Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales.

Artículo 43. Infracciones y sanciones.

En el caso de incumplimiento de lo dispuesto en este Real Decreto, será de aplicación el régimen de infracciones y sanciones establecido en la Ley 8/2003, de 24 de abril, de sanidad animal, sin perjuicio de las posibles responsabilidades civiles, penales o de otro orden que pudieran concurrir.

DISPOSICIÓN ADICIONAL PRIMERA. Carácter básico.

Lo dispuesto en el presente Real Decreto tendrá carácter de normativa básica estatal, al amparo de lo dispuesto en el artículo 149.1.16 de la Constitución que atribuye al Estado la competencia en materia de bases y coordinación general de la sanidad.

DISPOSICIÓN ADICIONAL SEGUNDA. Aplicabilidad de los programas nacionales.

Sin perjuicio de lo previsto en esta norma, será de aplicación el contenido de los programas nacionales de erradicación de la brucelosis bovina, tuberculosis bovina y brucelosis ovina y caprina, aprobados anualmente a nivel nacional por el Comité Nacional del Sistema de Alerta Sanitaria Veterinaria, y a nivel de la Unión Europea mediante Decisión comunitaria para su cofinanciación, y a los cuales se dará publicidad mediante resolución de la Dirección General de Recursos Agrícolas y Ganaderos y a través de la página web del Ministerio de Medio Ambiente, y Medio Rural y Marino.

DISPOSICIÓN TRANSITORIA PRIMERA. Plazo para la vacunación de la brucelosis bovina.

A partir de la entrada en vigor del presente Real Decreto se concede un plazo de doce meses para el cumplimiento de lo establecido en el apartado 1 del artículo 14, en lo referente a la vacunación de la brucelosis bovina.

DISPOSICIÓN TRANSITORIA SEGUNDA. Plazo máximo para el traslado de bovinos no afectados por la tuberculosis y brucelosis a otras Comunidades Autónomas.

No obstante lo dispuesto en el párrafo a de los artículos 19 y 24, y en el párrafo a del apartado 1 de los artículos 22 y 27, los órganos competentes de las Comunidades Autónomas podrán autorizar, hasta el 31 de diciembre de 2003, previo aislamiento de los animales sospechosos y sacrificio de los reaccionantes positivos de tuberculosis y brucelosis, el movimiento de los otros bovinos procedentes de la explotación afectada, siempre y cuando su destino sea exclusivamente una única explotación de engorde para su posterior traslado a matadero, previa comunicación a la Comunidad Autónoma de destino.

DISPOSICIÓN TRANSITORIA TERCERA. Movimiento de reses de lidia dentro del territorio nacional.

DISPOSICIÓN TRANSITORIA CUARTA. Vacunación contra la brucelosis.

1. Sin perjuicio de lo dispuesto en el apartado 1 del artículo 14, hasta el 31 de diciembre de 2014 podrá autorizarse, como excepción en lo referente a la brucelosis bovina, cuando la situación epidemiológica de la enfermedad valorada en cada región así lo aconseje, la vacunación de hembras, en determinadas áreas o explotaciones, con la vacuna RB-51 respecto de la infección con Brucella abortus, o con la vacuna REV-1 respecto de la infección con Brucella melitensis.

2. Los órganos competentes de las comunidades autónomas que deseen acogerse a estas excepciones lo someterán a la aprobación del Comité Nacional del Sistema de Alerta Sanitaria Veterinaria regulado en el Real Decreto 1440/2001, de 21 de diciembre, por el que se establece el sistema de alerta sanitaria veterinaria, en función de la competencia que le corresponde según lo establecido en el artículo 5 de dicho Real Decreto.

3. Las condiciones para dicha vacunación serán, sin perjuicio de las derivadas, en su caso, de la autorización de comercialización de la vacuna de que se trate, las siguientes:

1. El almacenamiento, suministro, distribución y entrega de las vacunas se realizará exclusivamente bajo control de los órganos competentes de las comunidades autónomas.

2. La distribución de las vacunas antibrucelares se realizará exclusivamente y con carácter gratuito por los órganos competentes de las comunidades autónomas, de lotes oficialmente contrastados por el Centro Nacional de Referencia para la brucelosis en animales, y queda prohibida fuera de los laboratorios fabricantes su tenencia, comercialización y venta.

3. Todos los lotes de las vacunas antibrucelares producidas por entidades situadas en el territorio español deberán estar contrastadas por el Centro Nacional de Referencia para brucelosis en animales. Si tras la contrastación de dichos lotes de vacunas el dictamen fuera no apto, se procederá a su destrucción bajo supervisión oficial.

4. Los animales vacunados deberán ser marcados de forma que en todo momento se disponga, como mínimo, de su identificación y de la fecha de vacunación.

5. Las vacunas sólo podrán ser utilizadas por veterinarios oficiales o autorizados en el marco de un programa de erradicación de brucelosis bovina aprobado por la Comisión Europea de acuerdo con el artículo 24 de la Decisión del Consejo 90/424/CEE.

6. Los órganos competentes de las comunidades autónomas informarán periódicamente y de modo detallado al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, para su envío a la Comisión de la Unión Europea y al resto de Estados miembros, respecto del programa de vacunación, en particular del área de vacunación, de la edad de los animales vacunados y del sistema que se aplique para la identificación de los animales vacunados.

7. En la base de datos SIMOGAN se marcará a los animales vacunados.

8. Los órganos competentes de las comunidades autónomas velarán porque los animales vacunados no sean objeto de comercio intracomunitario, en particular mediante la aplicación de métodos adicionales de marcaje y registro de dichos animales.

9. 

10. Los órganos competentes en materia de sanidad animal de las comunidades autónomas informarán a los órganos competentes en materia de salud pública de la respectiva comunidad acerca del uso de las vacunas y de los sistemas disponibles de diagnóstico y terapéuticos que se apliquen.

DISPOSICIÓN TRANSITORIA QUINTA. Explotaciones de precebo de ganado bovino no calificadas.

No obstante lo establecido en este Real Decreto, las explotaciones de precebo de ganado bovino no calificadas definidas en el Real Decreto 51/2004, de 19 de enero, por el que se modifica este Real Decreto, y que venían operando como tales hasta la entrado en vigor del presente real decreto, podrán enviar transitoriamente, hasta el 31 de octubre de 2011, animales de edad inferior a ocho meses hacia explotaciones de cebo no calificadas, para lo cual será necesaria la realización, en el caso de animales de la especie bovina mayores de seis semanas, de pruebas de diagnóstico de tuberculosis en los treinta días anteriores a la realización del movimiento, con resultado negativo.

DISPOSICIÓN DEROGATORIA ÚNICA. Derogación normativa.

Queda derogadas las siguientes disposiciones:

1. El capítulo XVII del título II del Decreto de 4 de febrero de 1955, por el que se aprueba el Reglamento de Epizootías.

2. La Orden de 25 de noviembre de 1978 por la que se establecen normas para el desarrollo de campañas de saneamiento ganadero.

3. La Orden de 28 de febrero de 1986 por la que se establecen normas para el desarrollo de las campañas de saneamiento ganadero, así como las Órdenes de 1 de febrero de 1990 y de 1 de diciembre de 1992, que la modifican.

4. La Orden de 3 de febrero de 1987 por la que se establecen normas complementarias para el desarrollo de campañas de saneamiento contra la leucosis bovina enzoótica.

5. La Orden de 9 de febrero de 1990 por la que se establecen medidas complementarias en campañas de saneamiento ganadero.

6. La Orden de 19 de febrero de 1991 por la que se establecen normas en campañas de saneamiento ganadero, para la erradicación de la brucelosis en el ganado ovino y caprino.

Asimismo, quedarán derogadas cuantas disposiciones de igual o inferior rango se opongan a lo dispuesto en este Real Decreto.

DISPOSICIÓN FINAL PRIMERA. Facultad de desarrollo.

Se faculta al Ministro de Agricultura, Pesca y Alimentación para dictar las disposiciones necesarias para el cumplimiento de lo dispuesto en el presente Real Decreto y, en particular, para modificar los anexos.

DISPOSICIÓN FINAL SEGUNDA. Entrada en vigor.

El presente Real Decreto entrará en vigor el día siguiente al de su publicación en el Boletín Oficial del Estado.

Dado en Madrid a 20 de diciembre de 1996.

- Juan Carlos R. -

La Ministra de Agricultura, Pesca y Alimentación,
Loyola de Palacio del Valle-Lersundi.

ANEXO 1.
Diagnóstico de tuberculosis bovina.

1. Identificación del agente.

La presencia de Mycobacterium bovis (M. bovis), agente de la tuberculosis bovina, en muestras clínicas y de autopsia puede demostrarse examinando frotis teñidos o mediante técnicas de inmunoperoxidasa y confirmarse mediante cultivo del organismo en medio de aislamiento primario.

El material patológico para la confirmación de M. bovis debe tomarse de ganglios linfáticos anormales y órganos parenquimatosos, como los pulmones, el hígado, el bazo, etc. Cuando el animal no presente lesiones patológicas, deberán recogerse muestras de los ganglios linfáticos retrofaríngeos, bronquiales, mediastínicos, supramamarios y mandibulares, así como de algunos ganglios linfáticos mesentéricos y del hígado, para su examen y cultivo.

La identificación de las cepas aisladas podrá realizarse habitualmente determinando las propiedades bioquímicas y de cultivo. También podrá emplearse la reacción en cadena de la polimerasa para la detección del complejo de M. tuberculosis. Las técnicas de análisis del ADN pueden resultar más rápidas y fiables que los métodos bioquímicos para la diferenciación de M. bovis de otros miembros del complejo de M. tuberculosis. La huella genética permite distinguir entre diferentes cepas de M. bovis y posibilitará la descripción de patrones del origen, transmisión y propagación de M. bovis.

Las técnicas y medios utilizados, su normalización y la interpretación de los resultados deben ajustarse a los que se precisan en el capítulo 2.3.3 (tuberculosis bovina) de la cuarta edición (2000) del Manual de normas para las pruebas de diagnóstico y las vacunas de la OIE.

2. Intradermotuberculinización.

Los derivados proteínicos purificados de la tuberculina que cumplan las normas establecidas en el apartado 2.1 se utilizarán para realizar la intradermotuberculinización oficial con arreglo a los procedimientos mencionados en el apartado 2.2.

2.1 Normas aplicables a la tuberculina (bovina y aviar).

2.1.1 Definición.

El derivado proteínico purificado de la tuberculina (bovina o aviar) es un preparado que se obtiene, previo calentamiento, de productos del crecimiento y la lisis de Mycobacterium bovis o Mycobacterium avium (M. avium), según corresponda, capaz de poner de manifiesto hipersensibilidad retardada en un animal sensibilizado a los microorganismos de la misma especie.

2.1.2 Producción.

Se obtiene a partir de fracciones hidrosolubles preparadas calentando en vapor libre y filtrando posteriormente cultivos de M. bovis o M. avium (según corresponda) en un medio líquido sintético.

La fracción activa del filtrado, consistente principalmente en proteínas, se aísla mediante precipitación, se lava y se vuelve a disolver. Puede añadirse un conservante antimicrobiano que no produzca reacciones positivas falsas, como el fenol. La preparación estéril final, libre de micobacterias, se distribuye asépticamente en recipientes de vidrio inviolables que se cierran después para evitar que se contaminen. El preparado puede liofilizarse.

2.1.3 Identificación del producto.

Inyectar por vía intradérmica en puntos diferentes varias dosis graduadas a cobayas albinos sensibilizados convenientemente, cada uno de los cuales debe pesar al menos 250 g. Al cabo de un período de 24 a 28 horas, se producen reacciones en forma de hinchazones edematosas con eritema, acompañadas o no de necrosis en el punto de inyección. El tamaño e importancia de las reacciones varía de acuerdo con la dosis. Los cobayas que no se hayan sensibilizado no presentan reacción a inyecciones de este tipo.

2.1.4 Pruebas.

2.1.4.1 pH: el pH debe oscilar entre 6,5 y 7,5.

2.1.4.2 Fenol: si el preparado que vaya a examinarse contiene fenol, su concentración no debe ser superior a 5 g/l.

2.1.4.3 Efecto sensibilizante: emplear un grupo de tres cobayas que no hayan sido tratados con ningún material que pueda interferir con la prueba. En tres ocasiones, a intervalos de cinco días, inyectar por vía intradérmica a cada cobaya una dosis del preparado que se vaya a examinar, equivalente a 500 UI en 0,1 ml. Entre 15 y 21 días después de la tercera inyección, inyectar la misma dosis (500 UI) por vía intradérmica a esos animales y a un grupo de control de tres cobayas del mismo peso a los que no se les haya inyectado previamente tuberculina. Entre 24 y 28 horas después de las últimas inyecciones, las reacciones de los dos grupos no son muy diferentes.

2.1.4.4 Toxicidad: emplear dos cobayas, cada uno de los cuales debe pesar al menos 250 g, que no hayan sido tratados previamente con ningún material que pueda interferir con la prueba. Inyectar por vía subcutánea a cada animal 0,5 ml del preparado que se vaya a examinar. Observar los animales durante siete días. En el período de observación no se producen efectos anormales.

2.1.4.5 Esterilidad: se debe cumplir la prueba de esterilidad prescrita en la monografía sobre vacunas de uso veterinario de la cuarta edición (2002) de la Farmacopea Europea.

2.1.5. Actividad.

La actividad del derivado proteínico purificado de la tuberculina (bovina y aviar) se determina comparando las reacciones producidas en cobayas sensibilizados mediante la inyección intradérmica de una serie de diluciones del preparado que se vaya a examinar con las producidas por concentraciones conocidas de un preparado de referencia de derivado proteínico purificado de tuberculina (bovina o aviar, según corresponda), calibrado en unidades internacionales.

Para probar la actividad, sensibilizar como mínimo nueve cobayas albinos, cada uno de los cuales debe pesar entre 400 y 600 g, mediante una inyección intramuscular profunda de 0,0001 mg de masa húmeda de M. bovis vivo de la cepa AN5, suspendida en 0,5 ml de una solución de 9 g/l de cloruro de sodio R, en el caso de la tuberculina bovina, o una dosis adecuada de M. avium inactivado o vivo, en el de la tuberculina aviar. Transcurridas al menos cuatro semanas tras la sensibilización de los cobayas, afeitar los costados de los animales para disponer de espacio para un máximo de cuatro puntos de inyección en cada lado. Preparar diluciones del preparado que se vaya a examinar y del preparado de referencia utilizando una solución salina isotónica amortiguadora de fosfatos (pH 6,5 - 7,5) que contenga 0,005 g/l de polisorbato 80 R. Utilizar al menos tres dosis del preparado de referencia y otras tantas del preparado que vaya a examinarse. Escoger las dosis de modo que las lesiones producidas tengan un diámetro comprendido entre 8 y 25 mm. Distribuir aleatoriamente las diluciones entre los puntos valiéndose de un cuadrado latino. Inyectar cada dosis intradérmicamente en un volumen constante de 0,1 o 0,2 ml. Transcurridas entre 24 y 28 horas, medir los diámetros de las lesiones y calcular el resultado de la prueba utilizando los métodos estadísticos habituales, basándose en el supuesto de que los diámetros de las lesiones son directamente proporcionales al logaritmo de la concentración de las tuberculinas.

La prueba no será válida a menos que los límites de error (con una confianza P = 0,95) estén entre el 50 y el 200 % de la actividad calculada. La actividad calculada estará entre el 66 y el 150 % de la actividad declarada de la tuberculina bovina. La actividad calculada estará entre el 75 y el 133 % de la actividad declarada de la tuberculina aviar.

La actividad declarada será al menos igual a 20000 UI/ml para ambas tuberculinas (bovina y aviar).

2.1.6 Almacenamiento.

Almacenar al abrigo de la luz, a una temperatura de 5 ± 3 ºC.

2.1.7 Etiquetado.

La etiqueta debe indicar:

1. La actividad en unidades internacionales por mililitro.

2. El nombre y la cantidad de las eventuales sustancias añadidas.

3. En el caso de preparados liofilizados:

1. El nombre y volumen del líquido reconstituyente que debe añadirse.

2. Que el producto debe utilizarse inmediatamente después de la reconstitución.

2.2 Procedimientos de prueba.

2.2.1 Se considerarán intradermotuberculinizaciones oficiales:

1. La intradermotuberculinización sencilla: esta prueba requiere una única inyección de tuberculina bovina.

2. La intradermotuberculinización de comparación: esta prueba requiere una inyección de tuberculina bovina y una inyección de tuberculina aviar, administradas simultáneamente.

2.2.2 La dosis de tuberculina inyectada será:

1. Igual o superior a 2000 UI de tuberculina bovina.

2. Igual o superior a 2000 UI de tuberculina aviar.

2.2.3 El volumen de cada inyección no rebasará los 0,2 ml.

2.2.4 Las tuberculinizaciones se realizarán inyectando tuberculina en la piel del cuello. Los puntos de inyección estarán situados en el límite de los tercios anterior y medio del cuello. Cuando se inyecte tuberculina aviar y bovina al mismo animal, el punto de inyección de la tuberculina aviar estará situado a unos 10 cm del borde superior del cuello y el de la tuberculina bovina, unos 12,5 cm más abajo en una línea aproximadamente paralela a la del hombro o en lados diferentes del cuello; tratándose de animales jóvenes en los que no haya espacio para separar suficientemente los puntos de inyección en un lado del cuello, se administrará una inyección a cada lado del cuello en puntos idénticos, en el centro del tercio medio de éste.

2.2.5 La técnica de la tuberculinización y la interpretación de las reacciones serán las siguientes:

2.2.5.1 Técnica.

Los puntos de inyección se rasurarán y limpiarán. En cada zona rasurada se tomará un pliegue de piel entre el índice y el pulgar, se medirá con un compás y se anotará el resultado. A continuación se inyectará la dosis de tuberculina siguiendo un método que garantice que aquélla se administra intradérmicamente. Podrá utilizarse una aguja corta estéril, con la parte biselada hacia fuera, de una jeringuilla graduada que contenga tuberculina, que se insertará oblicuamente en las capas más profundas de la piel. Para confirmar si una inyección se ha efectuado correctamente deberá palparse una hinchazón del tamaño de un guisante en cada punto de inyección. El grosor del pliegue de piel de cada punto de inyección se medirá de nuevo 72 horas (+/- 4 h) después de la inyección y se anotará el resultado.

2.2.5.2 Interpretación de las reacciones.

La interpretación de las reacciones se basará en observaciones clínicas y en el aumento de grosor de los pliegues de piel en los puntos de inyección, anotados 72 horas después de haber inyectado la tuberculina.

1. Reacción negativa: sólo se observa una hinchazón limitada, con un aumento del grosor del pliegue de piel no superior a 2 mm, sin signos clínicos tales como edema difuso o extensivo, exudación, necrosis, dolor o inflamación de los conductos linfáticos de esa región o de los ganglios linfáticos.

2. Reacción dudosa: no se observa ninguno de los signos clínicos mencionados en el párrafo a y el aumento de grosor del pliegue de piel es superior a 2 mm e inferior a 4.

3. Reacción positiva: se observan signos clínicos de los mencionados en el párrafo a o el grosor del pliegue de piel del punto de inyección aumenta 4 mm o más.

2.2.5.3 La interpretación de las intradermotuberculinizaciones oficiales será la siguiente:

2.2.5.3.1 Intradermotuberculinización sencilla:

1. Positiva: reacción bovina positiva como la descrita en el párrafo c del apartado 2.2.5.2.

2. Dudosa: reacción dudosa como la descrita en el párrafo b del apartado 2.2.5.2.

3. Negativa: reacción bovina negativa como la descrita en el párrafo a del apartado 2.2.5.2.

Los animales en los que la intradermotuberculinización sencilla haya dado resultados dudosos serán sometidos a otra tuberculinización después de un plazo mínimo de 42 días.

Los animales en los que esta segunda prueba no dé resultados negativos se considerarán positivos.

Los animales en los que la intradermotuberculinización sencilla dé resultados positivos podrán someterse a una intradermotuberculinización de comparación si se sospecha la existencia de una reacción positiva falsa o una reacción de interferencia.

2.2.5.3.2 Intradermotuberculinización de comparación para la determinación y el mantenimiento de la calificación de explotación oficialmente libre de tuberculosis:

1. Positiva: reacción bovina positiva que sea superior en más de 4 mm a la reacción aviar, o presencia de signos clínicos.

2. Dudosa: reacción bovina positiva o dudosa que sea de 1 a 4 mm superior a la reacción aviar, y ausencia de signos clínicos.

3. Negativa: reacción bovina negativa, o reacción bovina positiva o dudosa pero que sea igual o inferior a una reacción aviar positiva o dudosa, y ausencia de signos clínicos en ambos casos.

Los animales en los que la intradermotuberculinización de comparación haya dado resultados dudosos deberán ser sometidos a otra tuberculinización transcurrido un plazo mínimo de 42 días.

Los animales en los que esta segunda prueba no dé resultados negativos se considerarán positivos.

2.2.5.3.3 La calificación de explotación oficialmente libre de tuberculosis podrá suspenderse y los animales procedentes de ella no podrán ser objeto de intercambios comerciales intracomunitarios mientras no se determine la calificación de los animales siguientes:

1. Animales que se hayan considerado dudosos en la intradermotuberculinización sencilla.

2. Animales que se hayan considerado positivos en la intradermotuberculinización sencilla, pero que deban someterse de nuevo a una prueba por intradermotuberculinización de comparación.

3. Animales que se hayan considerado dudosos en la intradermotuberculinización de comparación.

2.2.5.3.4 Cuando la legislación comunitaria exija que los animales se sometan a una intradermotuberculinización antes de su traslado, se interpretará la prueba para que ningún animal que muestre un aumento del grosor del pliegue de la piel superior a 2 mm o la presencia de signos clínicos sea objeto de intercambios comerciales intracomunitarios.

2.2.5.3.5 Para permitir la detección del máximo número de animales infectados o enfermos de una explotación o una región, los Estados miembros podrán modificar los criterios para la interpretación de la prueba con el fin de mejorar la sensibilidad de ésta considerando que todas las reacciones dudosas mencionadas en el párrafo b de los apartados 2.2.5.3.1 y 2.2.5.3.2 son reacciones positivas.

3. Pruebas suplementarias.

Para permitir la detección del máximo número de animales infectados o enfermos de una explotación o una provincia, podrá autorizarse el empleo de la prueba de interferón gamma a que se refiere el capítulo 2.3.3 (tuberculosis bovina) de la cuarta edición (2000) del Manual de normas para las pruebas de diagnóstico y las vacunas de la Oficina Internacional de Epizootias, además de la tuberculinización.

4. Laboratorio Nacional de Referencia.

Se designa al Laboratorio Central de Sanidad Animal (Laboratorio de Sanidad y Producción Animal) de Santa Fe (Granada), perteneciente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, como centro nacional de referencia para la tuberculosis en animales.

El Laboratorio Nacional de Referencia se encargará, sin perjuicio de lo dispuesto en los artículos 9, 11 y 14, de la comprobación oficial de las tuberculinas o los reactivos a que se refieren los apartados 2 y 3, dentro de España, para garantizar que se ajustan a las normas anteriormente mencionadas.

ANEXO 2.
Diagnóstico de brucelosis bovina.

1. Identificación del agente.

La demostración, mediante tinción inmunoespecífica o acidorresistente modificada, de la presencia de organismos con morfología de brucela en material procedente de abortos, flujo vaginal o leche implica una presunción de brucelosis, especialmente si se corrobora con pruebas serológicas. Los métodos de reacción en cadena de la polimerasa ofrecen métodos de detección adicionales.

En la medida de lo posible, las bacterias del género brucela deben aislarse con medios simples o selectivos, por cultivo a partir de flujos uterinos, fetos abortados, secreciones mamarias o tejidos seleccionados, como ganglios linfáticos y órganos reproductores masculinos y femeninos.

Una vez aisladas las bacterias, deben identificarse la especie y la biovariedad mediante lisis por fagos o pruebas del metabolismo oxidativo y criterios de cultivo, bioquímicos y serológicos. La reacción en cadena de la polimerasa puede ofrecer un método complementario y biotipológico basado en secuencias genómicas específicas.

Las técnicas y los medios utilizados, su normalización, así como la interpretación de los resultados deben ajustarse a lo dispuesto en el capítulo 2.4.3 (brucelosis bovina), 2.7.2 (brucelosis caprina y ovina) y 2.8.5 (brucelosis porcina) del Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres de la OIE, sexta edición, de 2008.

2. Pruebas inmunológicas.

2.1 Estándares.

2.2 Enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) u otros análisis de saturación para la detección de la brucelosis bovina en suero o leche.

2.3. Prueba de fijación del complemento (FdC).

2.4 Prueba del anillo de leche.

2.5 Prueba del antígeno de brucela amortiguado (prueba del rosa de Bengala).

2.6 Prueba de seroaglutinación.

2.7 Ensayo de fluorescencia polarizada.

3. Pruebas complementarias.

3.1 Prueba cutánea de la brucelosis.

3.2 Enzimoinmunoanálisis de adsorción competitivo (ELISAc).

4. Laboratorio Nacional de Referencia.

4.1 El Laboratorio Central de Sanidad Animal (Laboratorio de Sanidad y Producción Animal) ubicado en Santa Fe (Granada), Camino del Jau s/n, 18320, es el designado como Laboratorio Nacional de Referencia para la brucelosis en animales.

4.2 Tareas y responsabilidades. Las tareas y responsabilidad del Laboratorio Nacional de Referencia, sin perjuicio de lo dispuesto en los artículos 9, 11 y 14 y en la disposición transitoria cuarta, del presente Real Decreto, y en el artículo 29 de la Ley 8/2003, de 24 de abril, son las siguientes:

1. La aprobación de los resultados de los estudios de validación que demuestren la fiabilidad del método de prueba utilizado en España.

2. La determinación del número máximo de muestras que deben mezclarse en las baterías de ELISA utilizadas.

3. La calibración de los estándares de trabajo contemplados en el punto 2.1.6.

4. los controles de calidad de todos los lotes de antígenos y de baterías de ELISA utilizados en España.

5. La aplicación de las recomendaciones del laboratorio comunitario de referencia para la brucelosis y la cooperación con dicho Laboratorio comunitario.

ANEXO 3.
Diagnóstico de leucosis bovina enzoótica.

1. La detección de la leucosis enzoótica bovina se realizará mediante las pruebas previstas en la Decisión 2009/976/UE, de la Comisión, de 15 de diciembre de 2009, por la que se modifica el anexo D de la Directiva 64/432/CEE del Consejo en lo relativo a las pruebas de diagnóstico de la leucosis enzoótica bovina.

2. El Laboratorio Central de Sanidad Animal ubicado en Algete (Madrid), del Ministerio de Medio Ambiente, y Medio Rural y Marino, es el designado como Laboratorio Nacional de Referencia para la leucosis enzoótica bovina.

ANEXO 4.
Diagnóstico de perineumonía contagiosa bovina.

A. Reacción de fijación del complemento de Campbell y Turner para la detección de anticuerpos en muestras de suero sanguíneo.

1. Se trata de una técnica de fijación de complemento en caliente que requiere los siguientes elementos:

1. Sistema hemolítico obtenido por la mezcla de volúmenes iguales de un suero hemolítico que contiene 12 unidades hemolíticas 50 % y una suspensión de hematíes de carnero al 6 %.

2. Solución de complemento de cobaya que contiene 2,5 unidades.

3. Solución de antígeno de Campbell y Turner que contiene dos unidades.

4. Diluciones de los sueros en prueba (1/10, 1/20, etcétera).

2. Los sueros deben ser inactivados como se detalla en el apartado 3 de la sección B del anexo 2 del presente Real Decreto.

3. Cada vez que se realice la prueba se efectuarán los siguientes controles:

1. Control del efecto anticomplementario del suero.

2. Control del antígeno.

3. Control del sistema hemolítico.

4. Control del complemento de cobaya.

5. Control, con la ayuda de un suero positivo, de la sensibilidad al desencadenamiento de la reacción.

6. Control, con la ayuda de un suero negativo, de la especificidad.

4. Criterio de interpretación:

1. Se considerará positivo todo suero que diluido a 1/10 fije completamente el complemento (1/10++++).

2. Los sueros que diluidos a 1/10 fijen parcialmente el complemento, se considerarán sospechosos.

5. El suero patrón positivo a la prueba de Reacción de Fijación de Complemento de Campbell y Turner será preparado por el Centro Nacional de Referencia de micoplasmosis animales, de acuerdo con las recomendaciones del Laboratorio Europeo de Referencia.

B. Centro Nacional de Referencia.

El Laboratorio de Sanidad y Producción Animal de Santa Fe (Granada), perteneciente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, es el designado como Centro Nacional de Referencia para las microplasmosis animales.

ANEXO 5.
Diagnóstico serológico de la brucelosis ovina y caprina por brucella melitensis.

La detección de la brucelosis (B. melitensis) se efectuará por medio de la prueba rosa bengala o por medio de la prueba de fijación del complemento que se describe a continuación o por cualquier otro método reconocido con arreglo al procedimiento comunitario previsto.

A. Prueba del antígeno brucelar tamponado.

La prueba rosa bengala pueda ser utilizada como prueba de serodiagnóstico en las explotaciones de animales de las especies ovina o caprina con el fin de concederles el título de explotación oficialmente indemne o indemne de brucelosis.

En caso de utilizar para la detección de brucelosis (brucella melitensis) la prueba de rosa bengala y obtener más de un 5 % de los animales de la explotación con reacción positiva, se efectuará un control complementario de cada animal de la explotación mediante una prueba de fijación del complemento.

1. Método manual:

1. El suero patrón es el segundo suero patrón internacional antibrucella abortus suministrado por el Laboratorio Central Veterinario de Weybridge, Surrey, Inglaterra.

2. El antígeno se preparará sin referencia a la concentración celular, pero su sensibilidad debe ser contratada en relación con el suero patrón internacional de manera que el antígeno produzca una reacción positiva para una dilución de suero de 1:47,5 y una reacción negativa para una dilución de 1:55.

3. El antígeno tamponado a pH 3,65 ± 0,5 y coloreado con rosa bengala.

4. Para preparar el antígeno se utilizará la cepa número 99 Weybridge a la cepa USDA 1119 u otra cepa de sensibilidad equivalente.

5. El antígeno será testado frente a ocho sueros liofilizados identificados como positivos y negativos.

6. La prueba deberá realizarse de la forma siguiente:

1. Poner una gota (0,03 ml) de antígeno y una gota (0,03 ml) de suero sobre una placa blanca.

2. Con la ayuda de un agitador proceder a la mezcla.

3. Agitar a continuación la placa con movimientos alternativos de delante a atrás (alrededor de 10 movimientos por minuto, durante cuatro minutos).

4. Efectuar la lectura bajo luz suficiente; en ausencia de aglutinación la prueba se considerará como negativa; toda aglutinación permite considerar la prueba como positiva a menos que se haya producido un secado excesivo sobre los bordes.

2. Método automático:

El método automático deber tener al menos igual sensibilidad y precisión que el método manual.

B. Reacción de fijación de complemento.

1. El suero patrón contendrá por milímetro 1.000 unidades sensibilizadoras; estas unidades se denominan unidades sensibilizadoras CEE.

2. La tasa de anticuerpos fijadores de complemento en un suero se expresará en unidades CEE.

3. Los sueros deben ser inactivados de 56 a 60 ºC durante treinta a cincuenta minutos.

4. Para la preparación de antígeno se utilizarán las copas Weybridge número 99 y USDA 1119.

5. Cuando se efectúe la reacción de fijación de complemento, es necesario proceder cada vez a los controles siguientes:

1. Control del efecto anticomplementario del suero.

2. Control del antígeno.

3. Control de los hematíes sensibilizados.

4. Control de complemento.

5. Control con la ayuda de un suero positivo, de la sensibilidad al desencadenamiento de la reacción.

6. Control de la especificidad de la reacción con la ayuda de un suero negativo.

C. Criterios de interpretación.

La prueba de fijación del complemento queda reservada para las pruebas efectuadas individualmente a los animales. la prueba de fijación del complemento podrá ser utilizada en las explotaciones de animales de las especies ovina o caprina con el fin de concederlas al título de explotación oficialmente indemne o indemne de brucelosis.

Para la prueba de fijación del complemento, se considerará positivo al suero que contenga como mínimo 20 unidades UCE por mililitro.

ANEXO 6.
Calificación sanitaria de explotaciones de cebaderos.

Todas las pruebas se realizarán a solicitud del titular del cebadero, corriendo de su cargo el coste de su realización.

La obtención, mantenimiento, suspensión, recuperación o retirada del estatuto de cebadero calificado se regirá por lo dispuesto en los apartados I y II del anexo I del Real Decreto 1716/2000, de 13 de octubre, para el ganado vacuno, y en el capítulo I o el capítulo II del anexo A del Real Decreto 2121/1993, de 3 de diciembre, para el ovino o caprino, con las siguientes especialidades:

1. Para la obtención del título, en el ganado vacuno, será preciso que la explotación se componga exclusivamente con animales procedentes de rebaños oficialmente indemnes de tuberculosis, oficialmente indemnes de brucelosis y oficialmente indemnes de leucosis enzoótica bovina, y que tras su composición se hayan realizado las pruebas previstas en el citado anexo I del Real Decreto 1716/2000, de 13 de octubre, con resultado favorable.

2. Para el mantenimiento del título, las pruebas efectuadas para la obtención del título tendrán una validez de un año a los efectos de la realización de las pruebas anuales exigidas dentro de los programas nacionales de erradicación de la tuberculosis y la brucelosis bovina, o de la brucelosis ovina y caprina, que se ejecutan en la comunidad autónoma correspondiente.

Notas: Disposición transitoria cuarta (apdo. 1): Redacción según Real Decreto 1616/2005, de 30 de diciembre, por el que se modifica el Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales, en lo que respecta al plazo máximo previsto para la autorización de vacunación de hembras bovinas contra la brucelosis. Disposición transitoria cuarta (apdo. 1): Redacción según Real Decreto 908/2008, de 30 de mayo, por el que se modifica el Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales, en lo que respecta al plazo máximo previsto para la autorización de vacunación de hembras bovinas contra la brucelosis. Anexo 2: Redacción según Orden ARM/2166/2009, de 29 de julio, por la que se modifica el anexo 2 del Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales. Artículos 3 (letra G), 17 (apdo. 4), 22 (apdo. 4) y 42 (apdo. 4); Disposiciones adicional primera (anterior disposición adicional única), transitoria cuarta (apdo. 1) y transitoria quinta; Anexos 3 y 6: Redacción según Real Decreto 727/2011, de 20 de mayo, por el que se modifica el Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales. Disposición adicional segunda: Añadida por Real Decreto 727/2011, de 20 de mayo, por el que se modifica el Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales. Artículo 3 (letra H), Disposición transitoria cuarta (apdo. 3.i): Suprimido por Real Decreto 727/2011, de 20 de mayo, por el que se modifica el Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales. Artículos 6, 7 y 8: Derogado por Real Decreto 1440/2001, de 21 de diciembre, por el que se establece el sistema de alerta sanitaria veterinaria. Disposición transitoria segunda: Redacción según Real Decreto 480/2002, de 31 de mayo, por el que se modifica la disposición transitoria segunda del Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales. Artículos 3, 14, 22, 27, 32 y 42; Anexos 1 y 2: Redacción según Real Decreto 1047/2003, de 1 de agosto, por el que se modifica el Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales. Título V; Artículo 43; Disposiciones transitoria tercera y transitoria cuarta: Añadido por Real Decreto 1047/2003, de 1 de agosto, por el que se modifica el Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales. Artículos 3 (letras G, H e I), 17 (apdo. 4) y 42 (apdo. 4): Redacción según Real Decreto 51/2004, de 19 de enero, por el que se modifica el Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales. Disposición transitoria quinta; Anexo 6: Añadido por Real Decreto 51/2004, de 19 de enero, por el que se modifica el Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales. Disposición transitoria tercera: Derogada por Real Decreto 1939/2004, de 27 de septiembre, por el que se regula la calificación sanitaria de las ganaderías de reses de lidia y el movimiento de los animales pertenecientes a éstas.

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