ANEXO

El anexo del Reglamento (CE) n.º 440/2008 queda modificado como sigue:

• 1) En la parte A se añade el capítulo siguiente:

  « A.25
  
  CONSTANTES DE DISOCIACIÓN EN AGUA (MÉTODO DE VALORACIÓN VOLUMÉTRICA - MÉTODO DE ESPECTROFOTOMETRÍA - MÉTODO DE CONDUCTIMETRÍA)

  INTRODUCCIÓN

  El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE 112 (1981).

  Condiciones previas

  • - Método analítico adecuado
  • - Hidrosolubilidad

  Información orientativa

  • - Fórmula estructural
  • - Conductividad eléctrica para el método de conductimetría

  Indicación general sobre el método de ensayo

  • - Todos los métodos de ensayo pueden aplicarse a sustancias puras o de calidad comercial. Debe considerarse el posible efecto de las impurezas sobre los resultados.
  • - El método de valoración volumétrica no es adecuado para las sustancias poco solubles (véase la sección Soluciones de ensayo, más abajo).
  • - El método de espectrofotometría solo es aplicable a las sustancias cuyos espectros de absorción UV/VIS son sensiblemente diferentes para las formas disociadas y las no disociadas. Este método también puede ser adecuado para sustancias poco solubles y para disociaciones que no sean del tipo ácido/base como, por ejemplo, la formación de complejos.
  • - En los casos en que se cumple la ecuación de Onsager puede utilizarse el método de conductimetría, incluso a concentraciones moderadamente bajas e incluso en caso de equilibrios distintos de los del tipo ácido/base.

  Documentos de referencia

  El presente método de ensayo se basa en métodos que figuran en las referencias de la sección de «Bibliografía» y en el documento Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification de la EPA, de 18 de agosto de 1978.

  MÉTODO - INTRODUCCIÓN, OBJETIVO, ÁMBITO DE APLICACIÓN, PERTINENCIA, APLICACIÓN Y LÍMITES DEL ENSAYO

  La disociación de una sustancia en el agua es importante para evaluar su impacto sobre el medio ambiente. De ella depende la forma de la sustancia, que a su vez determina su comportamiento y transporte. Puede afectar a la adsorción del producto en el suelo y los sedimentos y a su absorción en células biológicas.

  Definiciones y unidades

  La disociación es la descomposición reversible en dos o más especies químicas que pueden ser iónicas. El proceso se representa generalmente mediante la ecuación:

  

  y la constante de equilibrio de concentraciones que gobierna la reacción es

  

  Por ejemplo, en el caso particular en que R es el hidrógeno (la sustancia es un ácido), la constante es

  

  

  Sustancias de referencia

  No es preciso emplear las sustancias de referencia siguientes cada vez que se estudia una nueva sustancia. Se facilitan principalmente para poder efectuar de vez en cuando el calibrado del método y ofrecer la posibilidad de comparar los resultados cuando se aplique un método distinto.

  	pKa   (4)	Temp. en °C
  p-Nitrofenol	7,15	25 (4)
  Ácido benzoico	4,12	20
  p-Cloroanilina	3,93	20

  Sería útil disponer de una sustancia con varios pK como se indica en la sección Principio del método, más abajo. Esta sustancia podría ser la siguiente:

  Ácido cítrico	pKa (8)	Temp. en °C
  	1) 3,14	20
  	2) 4,77	20
  	3) 6,39	20

  Principio del método

  El proceso químico descrito suele depender solo ligeramente de la temperatura, en el intervalo de temperaturas pertinentes para el medio ambiente. La determinación de la constante de disociación requiere una medición de las concentraciones de las formas disociadas y sin disociar de la sustancia. La constante adecuada puede determinarse a partir de la estequiometría de la reacción de disociación indicada en la sección Definiciones y unidades, más arriba. En el caso concreto descrito en el presente método de ensayo, la sustancia se comporta como ácido o base, y la determinación más conveniente se hace midiendo las concentraciones relativas de las formas ionizadas y sin ionizar de la sustancia y el pH de la solución. La relación entre estos términos se da en la ecuación del pK_a en la sección Definiciones y unidades, más arriba. Algunas sustancias presentan más de una constante de disociación y pueden obtenerse ecuaciones similares. Algunos de los métodos descritos aquí son también adecuados para disociaciones distintas del tipo ácido/base.

  Criterios de calidad

  Repetibilidad

  La constante de disociación debe repetirse (un mínimo de tres determinaciones) con una variación no superior a ± 0,1 unidades logarítmicas.

  DESCRIPCIÓN DE LOS PROCEDIMIENTOS DE ENSAYO

  Hay dos planteamientos básicos para la determinación del pK_a. Uno supone la valoración volumétrica de una cantidad conocida de sustancia con ácido o base patrón, según proceda; el otro consiste en determinar la concentración relativa de las formas ionizadas y sin ionizar y su dependencia del pH.

  Preparación

  Los métodos basados en estos principios pueden clasificarse como procedimientos de valoración volumétrica, de espectrofotometría y de conductimetría.

  Soluciones de ensayo

  Para los métodos de valoración volumétrica y de conductimetría, el producto debe disolverse en agua destilada. Para los métodos de espectrofotometría y otros tipos se utilizan soluciones amortiguadoras. La concentración de la sustancia problema no debe ser superior a 0,01 M o a la mitad de la concentración de saturación (si este valor es menor), y para preparar las soluciones debe emplearse la forma más pura posible de la sustancia. Si la sustancia es poco soluble, podrá disolverse en una pequeña cantidad de un solvente miscible con agua, antes de añadirla hasta conseguir las concentraciones indicadas anteriormente.

  Las soluciones deben verificarse utilizando el efecto Tyndall con objeto de detectar la presencia de emulsiones, especialmente si se ha utilizado un cosolvente para aumentar la solubilidad. Si se utilizan soluciones amortiguadoras, la concentración de esta no debe ser superior a 0,05 M.

  Condiciones del ensayo

  Temperatura

  La temperatura debe controlarse con una precisión mínima de ± 1 °C. La determinación debe efectuarse preferentemente a 20 °C.

  Si se sospecha que el resultado depende significativamente de la temperatura, la determinación debe realizarse al menos a otras dos temperaturas. Los intervalos de temperatura deben ser en este caso de 10 °C y el control de la temperatura de ± 0,1 °C.

  Análisis

  El método se determinará en función de la naturaleza de la sustancia problema. Debe ser lo suficientemente sensible para permitir la determinación de las distintas especies a la concentración de cada solución de ensayo.

  Realización del ensayo

  Método de valoración volumétrica

  La solución de ensayo se determina por valoración volumétrica con la solución patrón de ácido o de base, según proceda, y midiendo el pH después de cada adición de valorante. Deben efectuarse al menos diez adiciones graduales antes de llegar al punto de equivalencia. Si se alcanza el equilibrio con suficiente rapidez, puede utilizarse un potenciómetro gráfico. A efectos del presente método, es preciso conocer con exactitud tanto la cantidad total de sustancia como su concentración. Deben tomarse las precauciones necesarias para excluir la presencia de dióxido de carbono. En los ensayos normalizados se encuentran pormenores del procedimiento, precauciones y cálculos, por ejemplo en las referencias (1), (2), (3), (4).

  Método de espectrofotometría

  Se encuentra una longitud de onda a la que las formas ionizada y sin ionizar de la sustancia tienen coeficientes de extinción sensiblemente diferentes. Se obtiene el espectro de absorción UV/VIS de soluciones de concentración constante a un pH al que la sustancia está esencialmente sin ionizar, a un pH al que está totalmente ionizada, y a varios pH intermedios. Esto puede llevarse a cabo bien añadiendo incrementos de ácido concentrado (o base) a un volumen relativamente grande de una solución de la sustancia de carácter amortiguador y de varios componentes, al principio a pH elevado (o bajo) (ref. 5), o bien añadiendo volúmenes iguales de una solución madre de la sustancia en, por ejemplo, agua o metanol, a volúmenes constantes de diversas soluciones amortiguadoras que abarquen el intervalo deseado de pH. Los valores del pH y de absorbancia a la longitud de onda elegida permiten calcular un número suficiente de valores de pK_a, utilizando datos de al menos 5 valores de pH a los que la sustancia esté ionizada como mínimo en un 10 % y sin llegar al 90 %. En la referencia (1) se dan más detalles experimentales y el método de cálculo.

  Método de conductimetría

  En una celda de constante pequeña y conocida, se mide la conductividad de una solución aproximadamente 0,1 M de la sustancia en agua de conductividad. Se mide también la conductividad de una serie de diluciones de esta solución efectuadas con exactitud. La concentración se reduce a la mitad cada vez, y la serie debe abarcar al menos un orden de magnitud de concentración. La conductividad limitante a dilución infinita se encuentra realizando un experimento similar con la sal sódica y extrapolando. El grado de disociación puede calcularse entonces a partir de la conductividad de cada solución mediante la ecuación de Onsager, y a continuación, haciendo uso de la ley de dilución de Ostwald, puede calcularse la constante de disociación como K = α²C/ (1 - α), donde C es la concentración en moles por litro y α es la fracción disociada. Deben tomarse las precauciones necesarias para excluir la presencia de CO₂. En los textos de las normas y en las referencias (1), (6) y (7) se dan más detalles experimentales y el método de cálculo.

  DATOS E INFORME

  Tratamiento de los resultados

  Método de valoración volumétrica

  Se calcula el valor del pK_a en 10 puntos de medición de la curva de valoración. Se calculan la media y la desviación típica de estos valores de pK_a. Debe incluirse una representación gráfica del pH frente al volumen de base o ácido patrón, junto con una presentación en forma de cuadro.

  Método de espectrofotometría

  Se presentan en forma de cuadro la absorbancia y el pH de cada espectro. Se calculan al menos cinco valores de pK_a a partir de los puntos de datos de espectros intermedios, y también se calculan la media y la desviación típica de estos resultados.

  Método de conductimetría

  Se calcula la conductividad equivalente Λ para cada concentración de ácido y para cada concentración de una mezcla de un equivalente de ácido más 0,98 equivalentes de hidróxido de sodio exento de carbonato. El ácido se encuentra en exceso para evitar un exceso de OH^- debido a la hidrólisis. Se representa 1/ Λ frente a Ö_C y puede determinarse la Λ ₀ de la sal por extrapolación a concentración cero.

  La Λ ₀ del ácido puede calcularse utilizando los valores de la bibliografía para H⁺ y Na⁺ El pK_a puede calcularse de α = Λ _i/ Λ ₀ y K_a = α²C/ (1-α) para cada concentración. Es posible obtener mejores valores de K_a aplicando correcciones para tener en cuenta la movilidad y la actividad. Deben calcularse la media y la desviación típica de los valores de pK_a

  Informe del ensayo

  Deben presentarse todos los datos en bruto y los valores calculados de pK_a, junto con el método de cálculo (de preferencia en forma de cuadro, tal como se sugiere en la referencia 1), así como los parámetros estadísticos descritos anteriormente. En el caso de los métodos de valoración volumétrica, deben darse datos de la normalización de los valorantes.

  En el caso del método de espectrofotometría, deben presentarse todos los espectros. En el caso del método de conductimetría, deben darse datos de la determinación de la constante de celda. Debe aportarse información sobre la técnica utilizada, los métodos analíticos y la naturaleza de los eventuales amortiguadores utilizados.

  Debe indicarse la temperatura o temperaturas de ensayo

  BIBLIOGRAFIA

  • (1) Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc, New York, 1962.
  • (2) Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, pp. 1186 -1188 (1969).
  • (3) ASTM D 1293 - Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
  • (4) Standard Method 242. APHA / AWWA / WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.
  • (5) Clark, J. & Cunliffe, A. E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973).
  • (6) ASTM D 1125 - Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
  • (7) Standard Method 205 - APHA/AWWA/NPCF (see above (4)).
  • (8) Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).».
• 2) En la parte B, el capítulo B.5 se sustituye por el texto siguiente:

  « B.5
  
  IRRITACIÓN/CORROSIÓN OCULAR AGUDA

  INTRODUCCIÓN

  El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo (TG) 405 de la OCDE (2012). Las directrices de ensayo de la OCDE para los ensayos de productos se revisan periódicamente a fin de garantizar que reflejan los mejores conocimientos científicos disponibles. En anteriores revisiones de estas directrices de ensayo se prestaba atención especial a las posibles mejoras mediante la evaluación de toda la información existente sobre el producto problema, para no someter a los animales de laboratorio a pruebas innecesarias y responder así a la preocupación por el bienestar de los animales. Las TG 405 (adoptadas en 1981 y actualizadas en 1987, 2002, y 2012) incluyen la recomendación de que, antes de llevar a cabo el ensayo in vivo que se describe para la irritación/corrosión ocular aguda, hay que efectuar una ponderación de las pruebas (1) con los datos relevantes existentes. Si los datos disponibles son insuficientes, se recomienda obtenerlos mediante la aplicación de secuencias de ensayos (2) (3). La estrategia de evaluación recomendada incluye la realización de ensayos in vitro validados y aceptados, y se recoge como suplemento del presente método de ensayo. A efectos del Reglamento (CE) nº 1907/2006, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y mezclas químicas (REACH) (5) , en el correspondiente documento de orientación de la ECHA (21) se incluye también una estrategia de ensayos integrada. Los ensayos con animales solo deben llevarse a cabo si se estima que resultan necesarios tras el examen de los métodos alternativos disponibles, y si se considera que su uso es adecuado. En el momento de la redacción del presente método de ensayo actualizado, hay casos en que la utilización de este método de ensayo sigue siendo necesaria u obligatoria en virtud de algunos marcos normativos.

  La última actualización se centró principalmente en el uso de analgésicos y anestésicos, sin afectar al concepto de base ni a la estructura de las directrices de ensayo. El ICCVAM (6) y un grupo internacional e independiente de revisión científica por pares revisó la utilidad y las limitaciones de la utilización sistemática de anestésicos tópicos, de analgésicos sistémicos y de parámetros compasivos en los ensayos de irritación ocular in vivo (12). La revisión concluyó que el uso de anestésicos tópicos y de analgésicos sistémicos puede evitar la mayoría o la totalidad del dolor y del sufrimiento, sin afectar a los resultados del ensayo, y recomendó que estas sustancias se utilizaran siempre. El presente método de ensayo tiene en cuenta esta revisión. En los ensayos in vivo de irritación y corrosión ocular aguda deben utilizarse sistemáticamente anestésicos tópicos, analgésicos sistémicos y parámetros compasivos. Las eventuales excepciones habrán de justificarse. Los refinamientos que se describen en el presente método reducirán sustancialmente o evitarán el dolor y el sufrimiento de los animales en la mayoría de las situaciones en las que siga siendo necesario efectuar ensayos de seguridad ocular in vivo.

  Un tratamiento preventivo y equilibrado del dolor debe incluir: i) un tratamiento previo sistemático con un anestésico tópico (por ejemplo, proparacaína o tetracaína) y un analgésico sistémico (por ejemplo, buprenorfina), ii) un tratamiento posterior sistemático con analgésicos sistémicos (por ejemplo, buprenorfina y meloxicam), iii) un programa de observación, seguimiento y registro de los animales en cuanto a los signos clínicos de dolor o sufrimiento, y iv) un programa de observación, seguimiento y registro de la naturaleza, gravedad y evolución de todas las lesiones oculares. Se encuentran más detalles en los procedimientos actualizados que se describen a continuación. Tras la administración del producto problema, no deben aplicarse más anestésicos ni analgésicos tópicos a fin de evitar interferencias con el estudio. No deben aplicarse de forma tópica analgésicos con actividad antiinflamatoria (p. ej., meloxicam), y las dosis utilizadas sistémicamente no deben interferir con los efectos oculares.

  Las definiciones se recogen en el apéndice del presente método de ensayo.

  CONSIDERACIONES INICIALES

  En aras de una ciencia válida y del bienestar de los animales no debe considerarse la realización de ensayos in vivo hasta que se hayan evaluado todos los datos disponibles relativos al potencial de corrosión/irritación ocular del producto mediante la ponderación de las pruebas. Dichos datos incluyen las pruebas obtenidas en estudios previos realizados con seres humanos o con animales de laboratorio, las pruebas de corrosión/irritación ocular por una o más de sustancias relacionadas estructuralmente o por una mezcla de las mismas, los datos que demuestren una elevada acidez o alcalinidad del producto (4) (5), y los resultados obtenidos en ensayos aceptados y validados de corrosión cutánea y de corrosión/irritación ocular in vitro o ex vivo (6) (13) (14) (15) (16) (17). Los estudios pueden haber sido realizados antes de la ponderación de las pruebas, o a consecuencia de la misma.

  Para ciertos productos, dicho análisis puede indicar la necesidad de realizar estudios in vivo del potencial de corrosión/irritación ocular del producto. En todos esos casos, antes de considerar el uso de un ensayo ocular in vivo, resulta preferible llevar a cabo en primer lugar un estudio in vitro o in vivo de los efectos de corrosión cutánea del producto, y evaluar este estudio de acuerdo con la estrategia de evaluación secuencial del método de ensayo B.4 (7) o la estrategia de ensayos integrada descrita en el documento de orientación de la ECHA (21).

  Se adjunta como suplemento del presente método de ensayo, y, a efectos de REACH, en el documento de orientación de la ECHA (21), una estrategia de evaluación secuencial, que incluye la ejecución de ensayos validados de irritación/corrosión ocular in vitro o ex vivo. Se recomienda seguir dicha estrategia de evaluación antes de llevar a cabo ensayos in vivo. Con los productos nuevos se recomienda un enfoque de evaluación por fases para obtener datos científicamente válidos sobre la corrosión/irritación provocada por el producto. Con los productos existentes que cuentan con datos insuficientes sobre su corrosión/irritación cutánea y ocular, puede utilizarse también esta estrategia para obtener los datos que falten. Deben justificarse los casos en que se emplee una estrategia o procedimiento de evaluación diferente, o en que se decida no utilizar un enfoque de evaluación por fases.

  PRINCIPIO DEL ENSAYO IN VIVO

  Después de un tratamiento previo con analgésicos sistémicos y la inducción de una anestesia tópica adecuada, el producto problema se aplica en una sola dosis a uno de los ojos del animal de experimentación; el ojo sin tratar sirve de testigo. Se evalúa el grado de irritación/corrosión ocular a intervalos determinados, asignando una puntuación a las lesiones de la conjuntiva, la córnea y el iris. También se describen otros efectos en el ojo y los efectos sistémicos adversos, para proporcionar una evaluación completa de los efectos. La duración del estudio ha de ser suficiente para evaluar la reversibilidad o irreversibilidad de los efectos observados.

  Los animales que presenten signos de sufrimiento o dolor graves en cualquier fase del ensayo o lesiones compatibles con los parámetros compasivos descritos en el presente método de ensayo (véase el punto 26) deben ser sacrificados de forma compasiva, y el producto evaluado en consecuencia. Los criterios para tomar la decisión de sacrificar de forma compasiva los animales moribundos y que sufren intensamente son objeto de un documento de orientación de la OCDE (8).

  PREPARACIÓN DEL ENSAYO IN VIVO

  Selección de las especies

  El conejo albino es el animal de laboratorio preferido; se emplean individuos adultos jóvenes y sanos. Si se utilizan otras especies será necesario justificarlo.

  Preparación de los animales

  En las 24 horas previas al inicio del ensayo se examinarán los dos ojos de los animales de experimentación provisionalmente seleccionados para el ensayo. No se utilizarán animales que muestren irritación ocular, defectos oculares o lesión corneal preexistente.

  Alojamiento y alimentación

  Los animales deben ser alojados de manera individual. La temperatura de los animalarios debe ser de 20 °C (± 3 °C) en el caso de los conejos. Aunque la humedad relativa debe ser del 30 % como mínimo y preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el objetivo debe ser el 50-60 %. La iluminación debe ser artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Debe evitarse una excesiva intensidad de la luz. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber.

  PROCEDIMIENTO DE ENSAYO

  Uso de anestésicos tópicos y analgésicos sistémicos

  Se recomiendan los siguientes procedimientos para evitar o reducir al mínimo el dolor y el sufrimiento en los ensayos de seguridad ocular. Pueden utilizarse otros procedimientos de los que se haya establecido que evitan o alivian de forma igual o mejor el dolor y el sufrimiento.

  • - Sesenta minutos antes de la aplicación del producto problema (APP), se administran 0,01 mg/kg de buprenorfina por inyección subcutánea (SC) para proporcionar un nivel terapéutico de analgesia sistémica. No se sabe ni se espera que la buprenorfina y otros analgésicos opiáceos similares administrados de forma sistémica alteren las respuestas oculares (12).
  • - Cinco minutos antes de la APP, se aplican a cada ojo una o dos gotas de anestésico ocular tópico (por ejemplo, clorhidrato de proparacaína al 0,5 % o clorhidrato de tetracaína al 0,5 %). Para evitar posibles interferencias con el estudio, se recomienda que el anestésico tópico no contenga conservantes. El ojo de cada animal que no se trata con el producto problema, pero sí con el anestésico tópico, sirve de testigo. Si se prevé que el producto problema puede causar dolor y sufrimiento significativos, en principio no debe someterse a ensayos in vivo. No obstante, en caso de duda o cuando sea necesario efectuar estos ensayos, debe considerarse la aplicación adicional del anestésico tópico a intervalos de 5 minutos antes de la APP. Los usuarios deben ser conscientes de que la repetición de la aplicación de anestésico tópico puede provocar un ligero aumento de la gravedad de las lesiones causadas químicamente o del tiempo necesario para recuperarse de tales lesiones.
  • - Ocho horas después de la APP se administran 0,01 mg/kg de buprenorfina y 0,5 mg/kg de meloxicam SC para conseguir un nivel terapéutico continuo de analgesia sistémica. Aunque no hay datos que sugieran que el meloxicam tiene efectos antiinflamatorios en los ojos si se administra una vez al día por vía subcutánea, no debe administrarse esta sustancia hasta que hayan pasado al menos 8 horas desde la APP, a fin de evitar cualquier posible interferencia con el estudio (12).
  • - Después del tratamiento inicial a las 8 horas de la APP, deben administrarse 0,01 mg/kg de buprenorfina SC cada 12 horas, además de 0,5 mg/kg de meloxicam SC cada 24 horas, hasta que desaparezcan las lesiones oculares y no haya signos clínicos de dolor y sufrimiento. Se dispone de preparados de analgésicos de liberación prolongada, con las que puede contarse para disminuir la frecuencia de la administración de analgésicos.
  • - Debe darse una analgesia de «socorro» inmediatamente tras la APP si la analgesia preventiva y la anestesia local son inadecuadas. A los animales que muestren signos de dolor y sufrimiento durante el estudio se les debe administrar inmediatamente una dosis de «socorro» de 0,03 mg/kg de buprenorfina SC, que se repetirá cada 8 horas, en caso necesario, en lugar de 0,01 mg/kg SC cada 12 horas. Se administran 0,5 mg/kg de meloxicam SC cada 24 horas además de la dosis de «socorro» de buprenorfina, pero no hasta que hayan pasado al menos 8 horas tras la APP.

  Aplicación del producto problema

  El producto problema debe aplicarse a la conjuntiva de un ojo de cada animal, tras separar suavemente el párpado inferior del globo ocular. A continuación se juntan con suavidad los párpados durante un segundo aproximadamente, para que no se pierda el material. El otro ojo no se trata y sirve de testigo.

  Lavado

  No se lavarán los ojos de los animales tratados hasta al menos 24 horas después de la instilación del producto problema, excepto en el caso de sólidos (véase el punto 18) y si se producen efectos corrosivos o irritantes inmediatos. Transcurridas 24 horas se podrán lavar los ojos si se considera necesario.

  No se recomienda utilizar un grupo satélite de animales para investigar la influencia del lavado, a menos que esté justificado desde el punto de vista científico. Si se necesita un grupo satélite, estará formado por dos conejos. Las condiciones del lavado deben quedar minuciosamente documentadas como, por ejemplo, hora del lavado, composición y temperatura de la solución de lavado, duración, volumen y velocidad de la aplicación.

  Posología

  1) Ensayo de líquidos

  Para el ensayo de líquidos se emplea una dosis de 0,1 ml. No se deben utilizar bombas de aerosol para instilar el producto directamente en el ojo. El aerosol líquido se expulsa de la bomba y se recoge en un recipiente, antes de instilar 0,1 ml en el ojo.

  2) Ensayo de sólidos

  Para el ensayo de sólidos, pastas y productos con partículas, la cantidad utilizada debe tener un volumen de 0,1 ml o no pesar más de 100 mg. El material problema debe estar reducido a polvo fino. El volumen de material sólido se medirá tras compactarlo con suavidad, por ejemplo golpeando suavemente con los dedos el envase medidor. Si en el primer punto temporal de observación (1 hora después de la aplicación) el producto problema sólido no ha sido eliminado del ojo del animal de ensayo por mecanismos fisiológicos, se puede lavar el ojo con suero salino o con agua destilada.

  3) Evaluación de aerosoles

  Se recomienda recoger en un recipiente el contenido de todas las bombas de aerosol antes de instilarlo en el ojo. La única excepción son los productos que van en envases de aerosol presurizados y que no se pueden recoger debido a la vaporización. En esos casos hay que sujetar el ojo bien abierto, administrando el producto problema en el ojo con una sola pulverización de alrededor de un segundo, a una distancia de 10 cm directamente delante del ojo. Esta distancia puede variar dependiendo de la presión del aerosol y de su contenido. Hay que tener cuidado para no lesionar el ojo con la presión del aerosol. En determinados casos puede ser necesario evaluar el potencial de causar una lesión «mecánica» del ojo por la fuerza del aerosol.

  Es posible calcular la dosis de un aerosol, simulando el ensayo como se indica a continuación: se pulveriza el producto sobre papel de pesar, a través de una abertura del tamaño del ojo de un conejo, colocada directamente delante del papel. El aumento de peso del papel sirve para calcular aproximadamente la cantidad administrada al ojo. En el caso de los productos volátiles se puede calcular la dosis pesando un envase receptor antes y después de retirar el producto problema.

  Ensayo inicial (ensayo de irritación/corrosión ocular in vivo con un solo animal)

  Se recomienda encarecidamente realizar el ensayo in vivo inicialmente con un solo animal (véase el suplemento del presente método de ensayo: Estrategia de evaluación secuencial de la irritación y la corrosión oculares). Las observaciones deben permitir determinar la gravedad y la reversibilidad antes de proceder a un ensayo de confirmación con un segundo animal.

  Si los resultados de este ensayo indican que el producto es irritante intenso o corrosivo en el ojo siguiendo el procedimiento descrito, no se harán más ensayos de irritación ocular.

  Ensayo de confirmación (ensayo de irritación ocular in vivo con animales adicionales)

  Si en el ensayo inicial no se observa efecto corrosivo o irritante intenso, la respuesta irritante o negativa debe confirmarse con un máximo de dos animales más. Si se observa efecto irritante en el ensayo inicial, se recomienda efectuar el ensayo de confirmación de forma secuencial exponiendo a los animales de uno en uno, en lugar de exponer a los dos animales adicionales a la vez. Si el segundo animal presenta efectos corrosivos o irritantes intensos se suspenderá el ensayo. Si los resultados del segundo animal son suficientes para permitir una clasificación de peligro, no deben hacerse más ensayos.

  Período de observación

  La duración del período de observación debe ser suficiente para evaluar por completo la magnitud y reversibilidad de los efectos observados. No obstante, se dará por finalizado el experimento si en cualquier momento el animal presenta signos de dolor o sufrimiento intensos (8). Para determinar la reversibilidad de los efectos, lo normal es someter a los animales a 21 días de observación a partir de la administración del producto problema. Si se observa la irreversibilidad antes de 21 días, el experimento debe finalizar en ese momento.

  Observaciones clínicas y graduación de las reacciones oculares

  Los ojos deben ser objeto de una evaluación exhaustiva en cuanto a la presencia o ausencia de lesiones oculares cuando haya pasado una hora de la APP, seguida de evaluaciones al menos diarias. Los animales deben ser evaluados varias veces al día durante los primeros 3 días para asegurarse de que las decisiones de finalización se adoptan en el momento oportuno. Los animales de ensayo deben ser objeto de evaluación sistemática a lo largo de toda la duración del estudio en cuanto a la presencia de signos clínicos de dolor o sufrimiento (por ejemplo, frotamiento repetido del ojo, parpadeo o lagrimeo excesivo) (9) (10) (11), al menos dos veces al día, con un mínimo de 6 horas entre las observaciones, o con mayor frecuencia si es necesario. Esto es necesario para: i) evaluar adecuadamente los animales en cuanto a la presencia de signos de dolor y sufrimiento a fin de tomar decisiones con conocimiento de causa sobre la necesidad de aumentar la dosis de analgésicos, y ii) evaluar los animales en cuanto a la presencia de parámetros compasivos establecidos a fin de tomar decisiones con conocimiento de causa sobre si procede realizar el sacrificio de los animales de forma compasiva, y garantizar que tales decisiones se tomen de manera oportuna. Se debe utilizar la tinción de fluoresceína sistemáticamente y un biomicroscopio de lámpara de hendidura cuando se considere oportuno (por ejemplo, para evaluar la profundidad de la lesión en caso de úlcera de la córnea) como ayuda en la detección y medición de daños oculares, y para evaluar si se han cumplido los criterios de parámetros establecidos para el sacrificio compasivo. Pueden tomarse fotografías digitales de las lesiones observadas para que sirvan de referencia y proporcionen un registro permanente de la importancia de los daños oculares. Los animales no permanecerán en el ensayo más tiempo del necesario, una vez obtenida la información definitiva. Los animales que muestren dolor o sufrimiento intenso deben ser sacrificados inmediatamente de forma compasiva, y el producto evaluado en consecuencia.

  Los animales que presenten las siguientes lesiones oculares después de la instilación deben ser sacrificados de forma compasiva (véase en el cuadro 1 una descripción de los grados de las lesiones): perforación de la córnea o ulceración importante de la córnea, incluido el estafiloma; presencia de sangre en la cámara anterior del ojo; opacidad corneal de grado 4; ausencia de reflejo fotomotor (respuesta del iris de grado 2) que persista durante 72 horas; ulceración de la conjuntiva; necrosis de la conjuntiva o de la membrana nictitante, o pérdida de epitelio. Esto se debe a que tales lesiones no suelen ser reversibles. Además, se recomienda que las siguientes lesiones oculares se utilicen como parámetros compasivos para finalizar los estudios antes de que termine el período de observación de 21 días. Se considera que estas lesiones predicen la aparición de lesiones irritantes intensas o corrosivas y de lesiones de las que no se espera que reviertan plenamente al final del período de observación de 21 días: lesión de profundidad importante (por ejemplo, úlcera de la córnea que se extiende más allá de las capas superficiales del estroma), destrucción del limbo > 50 % (puesta de manifiesto por la palidez conjuntival), e infección ocular grave (supuración). Una combinación de vascularización de la superficie de la córnea (es decir, queratitis vascular), mantenimiento de la superficie teñida con fluoresceína a lo largo del tiempo según una evaluación diaria y/o ausencia de nueva epitelización 5 días después de la aplicación del producto problema también podría considerarse como un criterio potencialmente útil para influir en la decisión clínica sobre la finalización precoz del estudio. No obstante, estas observaciones aisladas son insuficientes para justificar la finalización precoz del estudio. Una vez que se han detectado efectos oculares graves, debe pedirse a un veterinario especialista o experto en animales de laboratorio o a una persona con una formación adecuada para identificar lesiones clínicas que realice un examen clínico para determinar si la combinación de tales efectos justifica la finalización precoz del estudio. Deben obtenerse y registrarse los grados de reacción ocular (conjuntiva, córnea e iris) cuando han pasado 1, 24, 48 y 72 horas desde la aplicación del producto problema (cuadro 1). Los animales que no presenten lesiones oculares deben permanecer en observación al menos 3 días después de la instilación. Los animales con lesiones que no sean graves deben permanecer en observación hasta que desaparezcan las lesiones o hasta que transcurran 21 días, momento en que finaliza el estudio. Deben efectuarse y registrarse observaciones al menos cuando hayan pasado 1 hora, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 7 días, 14 días y 21 días, para determinar el estado de las lesiones y si son o no reversibles. Deben efectuarse observaciones más frecuentes cuando sea necesario para determinar si el animal de experimentación ha de sacrificarse por motivos compasivos o eliminarse del estudio debido a los resultados negativos.

  Deben registrarse en cada examen los grados de las lesiones oculares (cuadro 1). También deben consignarse las demás lesiones oculares (por ejemplo, queratitis vascular, manchas, cambios en la cámara anterior) o efectos sistémicos adversos eventuales.

  Se puede facilitar el examen de las reacciones mediante el uso de una lupa binocular, de una lámpara de hendidura manual, de un biomicroscopio o de otro dispositivo adecuado. Tras registrar las observaciones a las 24 horas, las ulteriores exploraciones del ojo pueden hacerse con la ayuda de fluoresceína.

  La graduación de las respuestas oculares es subjetiva necesariamente. Para armonizar tal graduación y ayudar a los laboratorios y a quienes efectúan e interpretan las observaciones, el personal encargado recibirá formación adecuada sobre el sistema de puntuación utilizado.

  DATOS E INFORME

  Evaluación de los resultados

  Deben evaluarse las puntuaciones de la irritación ocular, junto con la naturaleza y la gravedad de las lesiones, así como su reversibilidad o irreversibilidad. Las puntuaciones individuales no dan el nivel absoluto de las propiedades irritantes de un producto, ya que también se evalúan otros efectos del producto problema; más bien deben considerarse como valores de referencia, que solo serán significativos cuando sean respaldados por una descripción completa y la evaluación de todas las demás observaciones.

  Informe del ensayo

  El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

  Justificación del ensayo in vivo: análisis de la ponderación de las pruebas correspondientes a los datos de ensayos anteriores, incluidos los resultados de la estrategia de evaluación secuencial:

  • - descripción de datos relevantes de ensayos realizados anteriormente,
  • - datos obtenidos en cada fase de la estrategia de evaluación,
  • - descripción de los ensayos in vitro realizados, con detalles de los procedimientos y de los resultados obtenidos con los productos problema/ de referencia,
  • - descripción del estudio sobre irritación/corrosión cutánea in vivo realizado, con los resultados obtenidos,
  • - análisis de la ponderación de las pruebas para realizar el estudio in vivo.

  Producto problema:

  • - datos de identidad (por ejemplo, nombre químico y número CAS, si se dispone del mismo, pureza, impurezas conocidas, origen, número de lote),
  • - naturaleza física y propiedades fisicoquímicas (por ejemplo, pH, volatilidad, solubilidad, estabilidad, reactividad con el agua),
  • - en el caso de una mezcla, deben identificarse los componentes, con los datos de identidad de las sustancias constituyentes (por ejemplo, nombres químicos y números CAS, si se dispone de ellos) y sus concentraciones,
  • - dosis aplicada.

  Vehículo:

  • - identificación, concentración (en su caso), volumen utilizado,
  • - motivación de la elección del vehículo.

  Animales de ensayo:

  • - especie/cepa utilizada, justificación del uso de animales que no sean conejos albinos,
  • - edad de cada animal al principio del estudio,
  • - número de animales de cada sexo en los grupos de prueba y testigo (en su caso),
  • - peso de cada animal al principio y al final del ensayo,
  • - origen de los animales, condiciones del alojamiento, dieta, etc.

  Anestésicos y analgésicos

  • - dosis y momentos de administración de los anestésicos tópicos y analgésicos sistémicos que se hayan utilizado,
  • - si se utiliza anestésico local, identidad, pureza, tipo, y posible interacción con el producto problema.

  Resultados:

  • - descripción del método utilizado para puntuar la irritación en cada momento de observación (por ejemplo, lámpara de hendidura manual, biomicroscopio, fluoresceína),
  • - tabulación de los datos de respuesta irritante/corrosiva de cada animal en cada momento de observación, hasta la retirada de cada animal del ensayo,
  • - descripción narrativa del grado y la naturaleza de la irritación o la corrosión observadas,
  • - descripción de otras lesiones que se observen en el ojo (por ejemplo, vascularización, queratitis vascular, adherencias, manchas),
  • - descripción de los efectos adversos locales no oculares y sistémicos, registro de signos clínicos de dolor y sufrimiento, fotografías digitales, y observaciones histopatológicas, en su caso.

  Discusión de los resultados.

  Interpretación de los resultados

  La extrapolación a seres humanos de los resultados de los estudios de irritación ocular realizados con animales de laboratorio solo es válida en cierto grado. En muchos casos, los conejos albinos son más sensibles a los irritantes o corrosivos oculares que los seres humanos.

  Hay que interpretar con cuidado los datos para excluir la irritación resultante de una infección secundaria.

  BIBLIOGRAFÍA

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  • (7) Capítulo B.4 del presente anexo, Toxicidad aguda: irritación/corrosión cutánea.
  • (8) OCDE (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
  • (9) Wright EM, Marcella KL, Woodson JF. (1985), Animal pain: evaluation and control, Lab Animal, May/June, 20-36.
  • (10) National Research Council (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
  • (11) National Research Council (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
  • (12) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing, NIH Publication No. 10-7514, Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences.
    
    http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm
  • (13) Capítulo B.40 del presente anexo, Corrosión cutánea in vitro: ensayo de resistencia eléctrica transcutánea.
  • (14) Capítulo B.40 bis del presente anexo, Corrosión cutánea in vitro: ensayo con modelo de piel humana.
  • (15) OCDE (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.
  • (16) Capítulo B.47 del presente anexo, Método de ensayo de la opacidad y permeabilidad de la córnea de bovino para identificar: i) productos que provocan lesiones oculares graves y ii) productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves.
  • (17) Capítulo B.48 del presente anexo, Método de ensayo de ojo de pollo aislado para identificar: i) productos que provocan lesiones oculares graves y ii) productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves
  • (18) U.S. EPA (2003), Label Review Manual: 3rd Edition, EPA737-B-96-001, Washington, DC: U.S., Environmental Protection Agency.
  • (19) Naciones Unidas (2011), Sistema globalmente armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos (SGA), Cuarta edición revisada, Nueva York y Ginebra: Publicaciones de las Naciones Unidas.
  • (20) CE (2008), Reglamento (CE) n.º 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas, y por el que se modifican y derogan las Directivas 67/548/CEE y 1999/45/CE y se modifica el Reglamento (CE) n.º 1907/2006 (Diario Oficial de la Unión Europea L 353, p. 1).
  • (21) Documento de orientación de la ECHA: Guidance on information requirements and chemical safety assessment, Chapter R.7a: Endpoint specific guidance.

  http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf

  Cuadro 1:

  Graduación de las lesiones oculares

  Córnea	Grado
  Opacidad: grado de densidad (la lectura se efectuará en la zona más densa) (7)
  Sin ulceración ni opacidad	0
  Zonas de opacidad diseminadas o difusas (aparte de un empañado leve del brillo normal); los detalles del iris están claramente visibles	1
  Zona translúcida fácilmente discernible; los detalles del iris están ligeramente oscurecidos.	2
  Zona nacarada; no se ven los detalles del iris; el tamaño de la pupila es apenas discernible.	3
  Córnea opaca; no se distingue el iris por la opacidad	4
  Máximo posible: 4
  Iris
  Normal	0
  Pliegues notablemente hundidos, congestión, inflamación, moderada hiperemia o congestión pericorneal; iris reactivo a la luz (la reacción débil se considera efecto)	1
  Hemorragia, destrucción clara o ausencia de reacción a la luz	2
  Máximo posible: 2
  Conjuntiva
  Enrojecimiento (se refiere a la conjuntiva palpebral y bulbar; con exclusión de la córnea y el iris)
  Normal	0
  Algunos vasos sanguíneos hiperémicos (congestionados)	1
  Coloración carmesí difusa; vasos sanguíneos difícilmente distinguibles	2
  Coloración difusa roja carne de vacuno	3
  Máximo posible: 3
  Quemosis
  Inflamación (se refiere a los párpados o a las membranas nictitantes)
  Normal	0
  Cierta hinchazón por encima de lo normal	1
  Hinchazón evidente, con eversión parcial de los párpados	2
  Hinchazón con párpados medio cerrados	3
  Hinchazón con párpados más que medio cerrados	4
  Máximo posible: 4

  Apéndice |

  DEFINICIONES

  Reserva ácida/alcalina : En el caso de las preparaciones ácidas, es la cantidad (g) de hidróxido de sodio /100 g de preparación que se necesita para obtener un pH determinado. En el caso de las preparaciones alcalinas, es la cantidad (g) de hidróxido de sodio equivalente a la cantidad (g) de ácido sulfúrico /100 g de preparación que se necesita para obtener un pH determinado (Young et-al. 1988). 1988.

  Producto : Sustancia o mezcla.

  Productos no irritantes : Sustancias que no están clasificadas como irritantes oculares de la categoría I, II o III de la EPA; ni como irritantes oculares de la categoría 1, 2, 2A o 2B del SGA; ni de la categoría 1 o 2 de la UE (17) (18) (19).

  Productos corrosivos oculares : a) Productos que provocan una lesión irreversible de los tejidos oculares; b) productos clasificados como irritantes oculares de la categoría 1 del SGA, o de la categoría I de la EPA, o de la categoría 1 de la UE (17) (18) (19).

  Agentes irritantes para los ojos : a) Productos que producen un cambio reversible en el ojo; b) productos que están clasificados como irritantes oculares de la categoría II o III de la EPA; o como irritantes oculares de la categoría 2, 2A o 2B del SGA; o de la categoría 2 de la UE (17) (18) (19).

  Productos irritantes intensos oculares : a) Productos que provocan en los ojos lesiones tisulares que no se resuelven en los 21 días siguientes a la aplicación, o que provocan una degradación física severa de la vista; b) productos clasificados como irritantes oculares de la categoría 1 del SGA, o de la categoría I de la EPA, o de la categoría 1 de la UE (17) (18) (19).

  Producto problema : Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

  Procedimiento escalonado : Estrategia de ensayo por fases, en la que se revisa toda la información existente sobre un producto problema, siguiendo un orden especificado, en un proceso de ponderación de las pruebas en cada escalón, a fin de determinar si se dispone de información suficiente para tomar una decisión sobre la clasificación de un peligro, antes de pasar al escalón siguiente. Si puede establecerse la capacidad de irritación de un producto problema con la información disponible, no hace falta efectuar más ensayos. Si no puede establecerse la capacidad de irritación de un producto problema con la información disponible, se aplica un procedimiento secuencial de ensayos con animales por fases hasta que pueda efectuarse una clasificación inequívoca.

  Ponderación de las pruebas (proceso) : Los puntos fuertes y débiles de la información recopilada se utilizan como base para alcanzar una conclusión que puede no deducirse directamente de los datos individuales.

  SUPLEMENTO DEL MÉTODO DE ENSAYO B.5 (8)

  ESTRATEGIA DE EVALUACIÓN SECUENCIAL DE LA IRRITACIÓN Y LA CORROSIÓN OCULARES

  Consideraciones generales

  Es importante evitar el uso innecesario de animales y reducir al mínimo los ensayos que con toda probabilidad producen respuestas graves en los animales, por su bienestar y por motivos científicos. Antes de considerar la realización de ensayos in vivo hay que evaluar toda la información sobre un producto en lo que respeta a su posible poder corrosivo/irritante ocular. Puede que existan pruebas suficientes para clasificar el potencial corrosivo o irritante ocular de un producto problema, sin necesidad de realizar ensayos con animales de laboratorio. Por eso el uso de la ponderación de las pruebas y de una estrategia de evaluación secuencial reducirá al mínimo la necesidad de realizar ensayos in vivo, especialmente si es probable que el producto produzca reacciones graves.

  Se recomienda utilizar la ponderación de las pruebas para evaluar la información existente sobre el potencial de irritación y corrosión oculares de los productos, para determinar si la realización de estudios adicionales, aparte de los oculares in vivo, ayudaría a caracterizar dicho potencial. Cuando sean necesarios otros estudios, se recomienda utilizar la estrategia de evaluación secuencial para obtener los datos experimentales relevantes. Para sustancias no evaluadas anteriormente, se utilizará la estrategia de evaluación secuencial para obtener los datos necesarios a fin de evaluar su potencial corrosivo/irritante ocular. La estrategia de evaluación inicial que se describe en el prresente suplemento fue redactada en un taller de la OCDE (1). Posteriormente fue confirmada y ampliada por el sistema armonizado integrado de clasificación de peligros para la salud humana y efectos ambientales de los productos químicas (Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances), y fue aprobada en la XXVIII reunión del Comité Conjunto para productos químicos (Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals) en noviembre de 1998 (2) y actualizada por un grupo de expertos de la OCDE en 2011.

  Aunque la presente estrategia de evaluación no forma parte integrante del método de evaluación B.5, sí expresa el enfoque recomendado para la determinación de las características de irritación/corrosión oculares. Este enfoque representa la práctica óptima y una referencia desde el punto de vista ético para el análisis in vivo de la irritación/corrosión oculares. El método de ensayo proporciona instrucciones para la realización del ensayo in vivo, y resume los factores que se han de abordar antes de ponerlo en marcha. La estrategia proporciona un enfoque basado en la ponderación de las pruebas para la evaluación de los datos existentes sobre las propiedades de irritación/corrosión oculares de los productos problema, y un enfoque escalonado para generar datos relevantes sobre productos que necesitan estudios adicionales o que no han sido estudiadas. La estrategia incluye la realización en primer lugar de ensayos in vitro o ex vivo validados y aceptados, y luego de estudios según el método de ensayo B.4 en condiciones concretas (3) (4).

  Descripción de la estrategia de evaluación por fases

  Antes de llevar a cabo los ensayos que forman parte de la estrategia de evaluación secuencial (véase la figura), se evaluará toda la información disponible, para determinar la necesidad de practicar estudios oculares in vivo. Aunque se puede obtener información significativa a partir de la evaluación de parámetros aislados (por ejemplo, un pH extremo), hay que considerar la totalidad de la información existente. Se evaluarán todos los datos relevantes sobre los efectos del producto en cuestión y de sus análogos estructurales, para tomar una decisión basada en la ponderación de las pruebas, y se presentará la justificación de dicha decisión. Se hará especial hincapié en los datos existentes sobre el producto obtenidos con seres humanos y animales, seguido por el resultado de los ensayos in vitro o ex vivo. Siempre que sea posible se evitará realizar estudios in vivo con productos corrosivos. Los factores que se tienen en cuenta en la estrategia de evaluación son:

  Evaluación de los datos disponibles obtenidos con hombres y animales o in vitro mediante métodos validados y aceptados internacionalmente (fase 1).

  En primer lugar se tendrán en cuenta los datos existentes obtenidos con seres humanos mediante, por ejemplo, estudios clínicos u ocupacionales e informes de casos, y los datos de ensayos de irritación/corrosión ocular realizados con animales en estudios oculares o in vitro, mediante métodos validados y aceptados internacionalmente, pues proporcionan información directamente relacionada con los efectos producidos en los ojos. Posteriormente deben evaluarse los datos disponibles de estudios realizados con seres humanos o animales para investigar la corrosión/irritación cutánea, y de estudios in vitro de corrosión cutánea según métodos validados y aceptados internacionalmente. Los productos conocidos por ser corrosivos o intensamente irritantes para el ojo no deben aplicarse a los ojos de los animales, y tampoco los productos que muestren efectos corrosivos o intensamente irritantes en la piel; estos productos deben considerarse también corrosivos o irritantes para los ojos. Cuando en estudios oculares realizados anteriormente se hayan obtenido pruebas suficientes de que un producto no es corrosivo ni irritante, este tampoco se someterá a estudios oculares in vivo.

  Análisis de las relaciones estructura-actividad (SAR) (fase 2).

  Hay que tener en cuenta los resultados de los análisis de productos relacionados desde el punto de vista estructural, si es que existen. Cuando se disponga de suficientes datos obtenidos con seres humanos o animales sobre sustancias relacionadas desde el punto de vista estructural o sobre mezclas de dichas sustancias que indiquen su potencial corrosivo/irritante ocular, se puede presuponer que el producto problema producirá las mismas respuestas. En estos casos puede que no sea necesario someter a ensayo este producto. Los datos negativos de los estudios sobre sustancias relacionadas desde el punto de vista estructural o sobre mezclas de estas no constituyen demostración suficiente de que un producto no será corrosivo ni irritante en la estrategia de evaluación secuencial. Para identificar el potencial de corrosión e irritación cutánea y ocular hay que utilizar enfoques SAR validados y aceptados.

  Propiedades fisicoquímicas y reactividad química (fase 3).

  Los productos con pH extremos, como ≤ 2,0 y ≥ 11,5 pueden tener potentes efectos locales. Si el pH extremo es la base para identificar un producto como corrosivo o irritante para el ojo, entonces también se podrá tener en cuenta la reserva ácida/alcalina (capacidad amortiguadora) (5) (6) (7). Si la capacidad amortiguadora sugiere la posibilidad de que un producto no sea corrosivo para el ojo (es decir, productos con pH extremo y baja reserva ácida/alcalina), entonces tendrán que hacerse más ensayos para confirmarlo, de preferencia utilizando un ensayo in vitro o ex vivo validado y aceptado (véase el punto 10).

  Consideración de otras informaciones existentes (fase 4).

  En esta fase se evaluará toda la información disponible sobre la toxicidad sistémica por vía cutánea. También se tendrá en cuenta la toxicidad cutánea aguda del producto problema. Si se ha demostrado que el producto es muy tóxico por vía cutánea puede no ser necesario estudiarla en el ojo. Aunque no existe necesariamente relación entre la toxicidad cutánea aguda y la irritación/corrosión ocular, se puede suponer que si un agente es muy tóxico por vía cutánea también lo será si se aplica al ojo. Estos datos también se pueden tener en cuenta entre las fases 2 y 3.

  Evaluación de la corrosividad cutánea del producto si es también necesaria a efectos reglamentarios (fase 5).

  El potencial de corrosión e irritación intensa cutánea debe evaluarse en primer lugar de conformidad con el método de ensayo B.4 (4) y el suplemento que lo acompaña (8), incluido el uso de métodos de ensayo in vitro de corrosión cutánea validados y aceptados internacionalmente (9) (10) (11). Si se demuestra que el producto produce corrosión o irritación cutánea intensa, también puede considerarse corrosiva o intensamente irritante para los ojos. Por tanto, no se requerirán más ensayos. Si el producto no es corrosivo ni intensamente irritante para la piel, se realizará un ensayo ocular in vitro o ex vivo.

  Resultados de los ensayos in vitro o ex vivo (fase 6).

  Cuando se hayan demostrado las propiedades corrosivas o irritantes intensas de un producto en un ensayo in vitro o ex vivo (12) (13) validado y aceptado internacionalmente para la evaluación específica de la corrosión/irritación ocular, no será necesario evaluar este producto con animales. Se puede dar por supuesto que dicho producto producirá similares efectos intensos in vivo. Si no se dispone de ensayos in vitro / ex vivo validados y aceptados, debe prescindirse de la fase 6 y pasar directamente a la fase 7.

  Ensayo in vivo con conejos (fases 7 y 8).

  Los ensayos oculares in vivo deben empezar con un ensayo inicial con un solo animal. Si los resultados de este indican que el producto es corrosivo o intensamente irritante para el ojo, no se harán más ensayos. Si dicho ensayo no muestra efectos corrosivos ni irritantes intensos, se llevará a cabo un ensayo de confirmación con otros dos animales. En función de los resultados de la prueba de confirmación, podrá ser necesario efectuar exámenes adicionales (véase el método de ensayo B.5].

  ESTRATEGIA DE EVALUACIÓN DE LA IRRITACIÓN/CORROSIÓN OCULAR

  	Actividad	Constatación	Conclusión
  1	Datos disponibles obtenidos con hombres o animales, o in vitro mediante métodos validados y aceptados internacionalmente que indican efectos en los ojos	Lesión grave de los ojos	Parámetro final; se considera corrosivo para los ojos. No es necesario hacer ensayos.
  		Irritante para los ojos	Parámetro final; se considera corrosivo para los ojos. No es necesario hacer ensayos.
  		No corrosivo/no irritante para los ojos	Parámetro final; se considera que no es corrosivo ni irritante para los ojos. No es necesario hacer ensayos.
  	Datos disponibles obtenidos con hombres o animales, o in vitro mediante métodos validados y aceptados internacionalmente que indican efectos corrosivos en la piel	Corrosivo para la piel	Se supone que es corrosivo para los ojos. No es necesario hacer ensayos.
  	Datos disponibles obtenidos con hombres o animales, o in vitro mediante métodos validados y aceptados internacionalmente que indican efectos irritantes intensos en la piel	Irritante intenso para la piel	Se supone que es irritante para los ojos. No es necesario hacer ensayos.
  	↓
  	No se dispone de información, o la información disponible no es concluyente
  	↓
  2	Evaluación de las relaciones estructura-actividad en cuanto a la corrosión/irritación ocular	Predice lesión grave para los ojos	Se supone que es corrosivo para los ojos. No es necesario hacer ensayos.
  		Predice irritación para los ojos	Se supone que es irritante para los ojos. No es necesario hacer ensayos.
  	Consideración de las relaciones estructura-actividad en cuanto a la corrosión cutánea	Predice corrosión cutánea	Se supone que es corrosivo para los ojos. No es necesario hacer ensayos.
  	↓
  	No es posible hacer predicciones, o las predicciones son negativas o no concluyentes
  	↓
  3	Medición del pH (capacidad amortiguadora, si es relevante)	pH ≤ 2 o ≥ 11,5 (con elevada capacidad amortiguadora, si es relevante)	Se supone que es corrosivo para los ojos. No es necesario hacer ensayos.
  	↓
  	2 < pH < 11,5 o pH ≤ 2,0 o ≥11,5 con capacidad amortiguadora baja o nula, si es relevante
  	↓
  4	Consideración de los datos disponibles de toxicidad sistémica por vía cutánea	Muy tóxico a las concentraciones que se evaluarían en el ojo	El producto sería demasiado tóxico para evaluarlo. No es necesario hacer ensayos.
  	↓
  	No se dispone de tal información, o el producto no es muy tóxico
  	↓
  5	Evaluar experimentalmente el potencial de corrosión cutánea, según la estrategia de ensayo del capítulo B.4 del presente anexo si es también necesario a efectos reglamentarios	Respuesta corrosiva o irritante intensa	Se supone que es corrosivo para los ojos. No hacen falta más ensayos.
  	↓
  	El producto no es corrosivo ni intensamente irritante para la piel
  	↓
  6	Realizar ensayos oculares in vitro o ex vivo validados y aceptados	Respuesta corrosiva o irritante intensa	Se supone que es corrosivo o irritante intenso para los ojos, siempre que el ensayo realizado pueda utilizarse para identificar agentes corrosivos o irritantes intensos y el producto esté en el ámbito de aplicabilidad del ensayo. No hacen falta más ensayos.
  		Respuesta irritante	Se supone que es irritante para los ojos, siempre que el ensayo o ensayos realizados puedan utilizarse para identificar correctamente agentes corrosivos, irritantes intensos o irritantes, y el producto esté en el ámbito de aplicabilidad del ensayo o ensayos. No hacen falta más ensayos.
  		Respuesta no irritante	Se supone que no es irritante para los ojos, siempre que el ensayo o ensayos realizados puedan utilizarse para identificar correctamente agentes no irritantes y distinguir a estos de los productos irritantes, intensamente irritantes o corrosivos para los ojos, y el producto esté en el ámbito de aplicabilidad del ensayo. No hacen falta más ensayos.
  	↓
  	No pueden utilizarse ensayos oculares in vitro o ex vivo validados y aceptados para llegar a una conclusión
  	↓
  7	Efectuar el ensayo inicial in vivo en ojo de conejo utilizando un solo animal	Lesión grave de los ojos	Se considera corrosivo para los ojos. No hacen falta más ensayos.
  	↓
  	No hay lesión grave o no hay respuesta
  	↓
  8	Realizar el ensayo de confirmación con uno o dos animales adicionales	Corrosivo o irritante	Se considera corrosivo o irritante para los ojos. No hacen falta más ensayos.
  		Ni corrosiva ni irritante	Se considera que no es irritante ni corrosivo para los ojos. No hacen falta más ensayos.

  BIBLIOGRAFÍA

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  • (5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 - 26.
  • (6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxic. Toxicology in vitro 12, pp.483 - 524.
  • (7) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 - 231.
  • (8) Suplemento del capítulo B.4 del presente anexo, Estrategia de evaluación secuencial de la irritación y la corrosión cutáneas.
  • (9) Capítulo B.40 del presente anexo, Corrosión cutánea in vitro: ensayo de resistencia eléctrica transcutánea.
  • (10) Capítulo B.40 bis del presente anexo, Corrosión cutánea in vitro: ensayo con modelo de piel humana.
  • (11) OCDE (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.
  • (12) Capítulo B.47 del presente anexo, Método de ensayo de la opacidad y permeabilidad de la córnea de bovino para identificar: i) productos que provocan lesiones oculares graves y ii) productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves.
  • (13) Capítulo B.48 del presente anexo, Método de ensayo de ojo de pollo aislado para identificar: i) productos que provocan lesiones oculares graves y ii) productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves.».
• 3) En la parte B, el capítulo B.10 se sustituye por el texto siguiente:

  « B.10
  
  Ensayo de aberraciones cromosómicas en mamíferos in vitro

  INTRODUCCIÓN

  El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE 473 (2016). Forma parte de una serie de métodos de ensayo sobre toxicología genética. Se ha elaborado un documento de la OCDE que aporta información sucinta sobre los ensayos de toxicología genética y una síntesis de los recientes cambios aportados a dichas directrices de ensayo (1).

  El ensayo de aberraciones cromosómicas in vitro tiene por objeto detectar productos que provocan aberraciones cromosómicas estructurales en células de mamífero en cultivo (2) (3) (4). Las aberraciones estructurales pueden ser cromosómicas o cromatídicas. Puede surgir poliploidía (incluida la endorreduplicación) en los ensayos de aberraciones cromosómicas in vitro. Si bien los anéugenos pueden inducir la aparición de poliploidía, esta por sí sola no indica potencial aneugénico y puede indicar simplemente perturbación del ciclo celular o citotoxicidad (5). Este ensayo no está diseñado para medir la aneuploidía. Para la detección de la aneuploidía se recomendaría un ensayo de micronúcleos in vitro (6).

  El ensayo de aberraciones cromosómicas in vitro puede emplear cultivos de líneas celulares establecidas o cultivos de células primarias humanas o de roedores. Las células deben seleccionarse sobre la base de su capacidad de crecimiento en cultivo, su estabilidad cariotípica (incluido el número de cromosomas) y su frecuencia de aberraciones cromosómicas espontáneas (7). Por el momento, los datos de que se dispone no permiten formular recomendaciones firmes pero sugieren que es importante, a la hora de evaluar los peligros químicos, examinar la situación de la proteína p53, la estabilidad genética (cariotipo), la capacidad de reparación del ADN y el origen (roedores frente a hombre) de las células elegidas para el ensayo. Se recomienda, pues, a los usuarios de este método de ensayo que consideren la influencia de estas y otras características de las células sobre el comportamiento de una línea celular en la detección de la inducción de aberraciones cromosómicas, ya que la situación de los conocimientos en este ámbito está evolucionando.

  En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.

  CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES

  Los ensayos realizados in vitro suelen exigir la utilización de una fuente exógena de activación metabólica, salvo que las células sean competentes metabólicamente respecto a los productos problema. El sistema exógeno de activación metabólica no reproduce completamente las condiciones in vivo. Deben evitarse las condiciones que puedan conducir a resultados positivos falsos, es decir, lesiones cromosómicas no causadas por la interacción directa entre los productos problema y los cromosomas; tales condiciones incluyen cambios en el pH o en la osmolalidad (8) (9) (10), la interacción con los componentes del medio (11) (12) o unos niveles excesivos de citotoxicidad (13) (14) (15) (16).

  Este ensayo se emplea para detectar aberraciones cromosómicas que puedan producirse como consecuencia de sucesos clastogénicos. El análisis de la inducción de aberraciones cromosómicas debe efectuarse utilizando células en metafase. Por tanto, es esencial que las células estén en mitosis en los cultivos tanto tratados como sin tratar. En caso de nanomateriales fabricados, puede ser necesario recurrir a adaptaciones específicas del presente método de ensayo, pero estas no se describen aquí.

  Antes de la utilización del método de ensayo con una mezcla para obtener datos con fines reglamentarios, debe considerarse si podría proporcionar resultados adecuados a tal fin y, en caso afirmativo, por qué. Tales consideraciones no son necesarias si la reglamentación impone el ensayo de la mezcla.

  PRINCIPIO DEL ENSAYO

  Los cultivos celulares de origen humano o de otros mamíferos se exponen al producto problema tanto con fuente exógena de activación metabólica como sin ella, salvo que se utilicen células con una capacidad adecuada de metabolización (véase el punto 13). A intervalos predeterminados apropiados tras el inicio de la exposición de los cultivos celulares al producto problema, se tratan estos con un producto que detenga la división celular en la metafase (p. ej., colcemid o colchicina), se recolectan, se tiñen y se analizan al microscopio las células en metafase para evaluar la presencia de aberraciones cromatídicas y cromosómicas.

  DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

  Preparación

  Células

  Pueden utilizarse cultivos de diversas líneas celulares (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células de pulmón de hámster chino V79, células de pulmón de hámster chino (CHL)/IU, TK6) o de células primarias, incluidos los linfocitos de sangre periférica de hombre o de otros mamíferos (7). La elección de las líneas celulares debe justificarse científicamente. Cuando se utilizan células primarias, por razones de bienestar animal, debe considerarse la utilización de células primarias de origen humano, cuando sea viable y se hayan tomado de conformidad con los principios éticos humanos y la reglamentación. Los linfocitos de sangre periférica humana deben obtenerse de individuos jóvenes (aproximadamente de 18 a 35 años de edad), no fumadores, sin enfermedades conocidas ni exposiciones recientes a agentes genotóxicos (por ejemplo, productos, radiaciones ionizantes) a niveles que puedan aumentar la incidencia de fondo de las aberraciones cromosómicas. Esto garantizaría una incidencia de fondo de las aberraciones cromosómicas baja y constante. La incidencia de base de las aberraciones cromosómicas aumenta con la edad y esta tendencia es más pronunciada en las mujeres que en los varones (17) (18). Si se combinan células procedentes de más de un donante, debe especificarse el número de donantes. Es necesario demostrar que las células se han dividido entre el inicio de la administración del producto problema y la recolección de las células. Los cultivos celulares se mantienen en fase exponencial de crecimiento celular (líneas celulares) o se estimulan para que se dividan (cultivos primarios de linfocitos), a fin de exponer las células en diferentes fases del ciclo celular, ya que es posible que no se conozca la sensibilidad de las distintas fases celulares a los productos problema. Las células primarias que es preciso estimular con agentes mitogénicos para que se dividan dejan generalmente de estar sincronizadas durante la exposición al producto problema (por ejemplo, los linfocitos humanos tras una estimulación mitogénica de 48 horas).

  La utilización de células sincronizada durante el tratamiento no es recomendable, pero puede aceptarse si está justificada.

  Medios y condiciones de cultivo

  Para el mantenimiento de los cultivos deben utilizarse medios de cultivo y condiciones de incubación adecuados (recipientes de cultivo, atmósfera humidificada con 5 % de CO₂ en su caso, temperatura de incubación de 37 °C). Las líneas celulares deben examinarse sistemáticamente para comprobar la estabilidad del número modal de cromosomas y la ausencia de contaminación por Mycoplasma (7) (19), y no deben utilizarse las células que se contaminen o que presenten un cambio en el número modal de cromosomas. Debe determinarse la duración del ciclo celular normal de las líneas celulares o cultivos primarios utilizados en el laboratorio de ensayo, y ser coherente con las características celulares publicadas (20).

  Preparación de los cultivos

  Líneas celulares: las células se propagan a partir de cultivos madre, se siembran en el medio de cultivo a una densidad tal que las células en suspensión o en monocapas sigan creciendo exponencialmente hasta el momento de la recolección (por ejemplo, debe evitarse la confluencia de las células cultivadas en monocapas).

  Linfocitos: se cultiva sangre completa tratada con anticoagulante (p. ej., heparina) o bien linfocitos separados (p.ej., durante 48 horas en el caso de los linfocitos humanos) en presencia de un mitógeno [p. ej., fitohemaglutinina (PHA) en el caso de los linfocitos humanos] a fin de inducir la división celular antes de la exposición al producto problema.

  Activación metabólica

  Se debe recurrir a sistemas exógenos de metabolización cuando se utilicen células con una capacidad metabólica endógena inadecuada. El sistema utilizado con más frecuencia que se recomienda por defecto, salvo en casos justificados, es una fracción postmitocondrial (S9) a la que se añaden cofactores y que se obtiene a partir del hígado de roedores (generalmente ratas) tratados con inductores enzimáticos como el aroclor 1254 (21) (22) (23) o una combinación de fenobarbital y β-naftoflavona (24) (25) (26) (27) (28) (29). Esta última combinación no infringe el Convenio de Estocolmo sobre contaminantes orgánicos persistentes (30), y se ha visto que es tan efectiva como el aroclor 1254 para inducir oxidasas de función mixta (24) (25) (26) (28). La fracción S9 se utiliza normalmente a concentraciones que varían entre el 1 y el 2 % (v/v), pero pueden aumentarse hasta el 10 % (v/v) en el medio de ensayo final. Debe evitarse durante el tratamiento el uso de productos que reduzcan el índice mitótico, especialmente productos que acomplejen el calcio (31). La elección del tipo y de la concentración del sistema exógeno de activación metabólica o del inductor metabólico utilizado puede estar influida por la clase de los productos que se someten a ensayo.

  Preparación del producto problema

  Los productos problema sólidos deben prepararse en disolventes adecuados y, si es conveniente, diluirse antes de tratar las células (véase el punto 23). Los productos problema líquidos pueden añadirse directamente al sistema de ensayo o diluirse antes del tratamiento del sistema de ensayo. Los productos problema gaseosos o volátiles deben someterse a ensayo aplicando modificaciones adecuadas a los protocolos normales, tales como el tratamiento en recipientes de cultivo sellados (32) (33) (34). La preparación del producto problema debe hacerse justo antes del tratamiento, salvo que se cuente con datos de estabilidad que avalen la posibilidad de su conservación.

  Condiciones del ensayo

  Disolventes

  El disolvente debe elegirse para optimizar la solubilidad de los productos problema sin tener un impacto negativo en la realización del ensayo, por ejemplo por cambiar el crecimiento celular, afectar a la integridad del producto problema, reaccionar con los recipientes de cultivo, o interferir con el sistema de activación metabólica. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente (o medio de cultivo) acuoso. Son ejemplos de disolventes bien establecidos el agua o el dimetilsulfóxido. En general, los disolventes orgánicos no deben exceder del 1 % (v/v) y los disolventes acuosos (solución salina o agua) no deben superar el 10 % (v/v) en el medio de tratamiento final. Si se utilizan disolventes que no están bien establecidos (por ejemplo, etanol o acetona), debe disponerse de datos justificativos que indiquen su compatibilidad con el sistema de ensayo y los productos problema, y su ausencia de toxicidad genética a la concentración utilizada. En ausencia de estos datos justificativos, es importante incluir testigos sin tratar (véase el apéndice 1) para demostrar que el disolvente elegido no es nocivo ni tiene efectos clastogénicos.

  Medición de la proliferación celular y de la citotoxicidad, y selección de las concentraciones de tratamiento

  Al determinar la concentración máxima de producto problema, debe evitarse llegar a concentraciones que puedan producir respuestas positivas falsas, tales como las que provocan una citotoxicidad excesiva (véase el punto 22), precipitación en el medio de cultivo (véase el punto 23), o cambios marcados del pH o de la osmolalidad (véase el punto 5). Si el producto problema provoca un cambio marcado en el pH del medio en el momento de su adición, el pH puede ajustarse amortiguando el medio de tratamiento final para evitar resultados positivos falsos y mantener unas condiciones de cultivo adecuadas.

  Se mide la proliferación celular para asegurarse de que las células tratadas han alcanzado la mitosis durante el ensayo en número suficiente y de que los tratamientos se efectúan a los niveles adecuados de citotoxicidad (véanse los puntos 18 y 22). La citotoxicidad se debe determinar con y sin activación metabólica en el experimento principal mediante un indicador adecuado de la muerte y el crecimiento de las células. Si bien la evaluación de la citotoxicidad en un ensayo inicial puede ser útil para definir mejor las concentraciones que deben utilizarse en el experimento principal, no es obligatorio efectuar un ensayo inicial. Si se lleva a cabo, no debe sustituir a la medición de la citotoxicidad en el experimento principal.

  Para evaluar la citotoxicidad en los ensayos citogenéticos, puede recurrirse a la medición de la duplicación relativa de la población (DRP) o del aumento relativo del recuento celular (ARRC) (13) (15) (35) (36) (55) (véanse las fórmulas en el apéndice 2). En caso de tratamiento a largo plazo y de tiempos de recolección tras el inicio del tratamiento superiores a 1,5 veces la duración del ciclo celular normal (es decir, más de 3 ciclos celulares en total), la DRP puede subestimar la citotoxicidad (37). En tales circunstancias, puede ser preferible medir el ARRC, o puede ser útil evaluar la citotoxicidad tras un tiempo igual a 1,5 veces la duración del ciclo celular normal utilizando la DRP.

  En el caso de los linfocitos en cultivos primarios, si bien el índice mitótico (IM) es una medida de los efectos citotóxicos o citostáticos, se ve influido por el tiempo al que se mide después del tratamiento, por el mitógeno empleado y por la posible alteración del ciclo celular. No obstante, el IM es aceptable porque es posible que otras mediciones de la citotoxicidad resulten engorrosas y poco prácticas y no puedan aplicarse a la población objetivo de linfocitos que crecen en respuesta a la estimulación con PHA.

  Si bien el ARRC y la DRP en el caso de las líneas celulares y el IM en el de los cultivos primarios de linfocitos son los parámetros de citotoxicidad recomendados, el uso de otros indicadores (por ejemplo, integridad de las células, apoptosis, necrosis, ciclo celular) podría proporcionar información adicional útil.

  Deben evaluarse al menos tres concentraciones de ensayo (sin incluir los testigos positivos y de disolvente) que cumplan los criterios de aceptabilidad (citotoxicidad apropiada, número de células, etc.). Cualquiera que sea el tipo de células (líneas celulares o cultivos primarios de linfocitos), pueden utilizarse a cada concentración de ensayo cultivos tratados replicados o sin replicar. Si bien se recomienda el uso de cultivos duplicados, también son aceptables los cultivos sin replicar, siempre que se examine el mismo número total de células, sea en cultivos duplicados o sin replicar. La utilización de cultivos sin replicar es especialmente pertinente cuando se evalúan más de 3 concentraciones (véase el punto 31). Los resultados obtenidos en los cultivos replicados independientes a una concentración determinada se pueden poner en común para el análisis de los datos (38). En el caso de productos problema que muestren escasa o nula citotoxicidad, normalmente serán adecuados los intervalos de concentración de aproximadamente el doble o el triple. Cuando se produce citotoxicidad, las concentraciones de ensayo seleccionadas deben cubrir una gama a partir de la que provoca citotoxicidad según se describe en el punto 22, con inclusión en particular de las concentraciones a las que existe citotoxicidad moderada y débil o nula. Muchos productos problema presentan curvas de respuesta a la concentración de elevada pendiente y, con el fin de obtener datos a niveles bajos y moderados de citotoxicidad o de estudiar en detalle la relación entre dosis y respuesta, entonces es necesario recurrir a concentraciones más próximas entre sí o a más de tres concentraciones (cultivos replicados o sin replicar), en particular en situaciones en que se requiere una repetición del experimento (véase el punto 47).

  Si la concentración máxima se basa en la citotoxicidad, la concentración más elevada debe aspirar a provocar un 55 ± 5 % de citotoxicidad utilizando los parámetros recomendados de citotoxicidad (es decir, reducción del ARRC y de la DRP con líneas celulares y reducción del IM con cultivos primarios de linfocitos al 45 ± 5 % del testigo negativo en paralelo). Ha de tenerse cuidado al interpretar resultados positivos que solo se encuentren en el extremo superior de este intervalo de citotoxicidad del 55 ± 5 % (13).

  Para los productos problema poco solubles que no son citotóxicos a concentraciones inferiores a la concentración mínima insoluble, la mayor concentración analizada debe producir turbidez o precipitado visibles a simple vista o con ayuda de un microscopio invertido al final del tratamiento con el producto problema. Incluso si se produce citotoxicidad por encima del límite de solubilidad, es aconsejable hacer el ensayo a una única concentración que produzca turbidez o precipitado visible porque este puede provocar efectos falsos. A la concentración que produce precipitado, se debe evitar que este interfiera con la realización del ensayo (por ejemplo, con la tinción o el examen celular). Puede ser útil determinar la solubilidad en el medio de cultivo antes de que efectuar el experimento.

  Si no se observa precipitado ni citotoxicidad limitante, la concentración de ensayo más elevada debe corresponder a la más baja de las siguientes: 10 mM, 2 mg/ml o 2 μl/ml (39) (40) (41). Si el producto problema no tiene una composición definida y se trata, por ejemplo, de sustancias de composición desconocida o variable, productos complejos de reacción o materiales biológicos (UVCB) (42), extractos medioambientales, etc., es posible que la concentración superior tenga que ser mayor (por ejemplo, 5 mg/ml), en ausencia de citotoxicidad suficiente, para aumentar la concentración de cada uno de los componentes. Conviene señalar, no obstante, que estos requisitos pueden variar en caso de medicamentos de uso humano (43).

  Testigos

  Se incluirán, para cada período de recolección, testigos negativos en paralelo (véase el punto 15), consistentes en el disolvente solo en el medio de tratamiento y sometidos al mismo proceso que los cultivos del ensayo.

  Es necesario disponer testigos positivos en paralelo a fin de demostrar la capacidad del laboratorio para detectar clastógenos en las condiciones establecidas en el protocolo de ensayo utilizado y la efectividad del sistema exógeno de activación metabólica, si procede. En el cuadro 1 a continuación se encuentran ejemplos de testigos positivos. Es posible utilizar como testigos positivos otros productos, si se justifica. Dado que los ensayos de toxicidad genética con células de mamífero in vitro están suficientemente normalizados, el uso de testigos positivos puede limitarse a un clastógeno que requiera activación metabólica. Siempre que se utilice de forma paralela al ensayo sin activación con la misma duración del tratamiento, la respuesta de este único testigo positivo demostrará tanto la actividad del sistema de activación metabólica como la capacidad de respuesta del sistema de ensayo. No obstante, los tratamiento a largo plazo (sin fracción S9) deben tener su propio testigo positivo, ya que la duración del tratamiento será diferente de la del ensayo con activación metabólica. Cada testigo positivo debe utilizarse a una o varias concentraciones de las que quepa esperar que produzcan incrementos reproducibles y detectables respecto a los valores de fondo para demostrar la sensibilidad del sistema de ensayo (es decir, que los efectos sean claros, pero sin revelar inmediatamente al lector la identidad de los portaobjetos codificados), y la respuesta no debe verse comprometida por una citotoxicidad que exceda de los límites especificados en el método de ensayo.

  Cuadro 1.

  Productos de referencia recomendados para evaluar la competencia del laboratorio, y para la selección de los testigos positivos.

  Categoría	Producto	CAS RN
  1.  Clastógenos activos sin activación metabólica
  	Metanosulfonato de metilo	66-27-3
  	Mitomicina C	50-07-7
  	N-Óxido de 4-nitroquinolina	56-57-5
  	Arabinósido de citosina	147-94-4
  2.  Clastógenos que necesitan activación metabólica
  	Benzo(a)pireno	50-32-8
  	Ciclofosfamida	50-18-0

  PROCEDIMIENTO

  Tratamiento con el producto problema

  Se tratan células en crecimiento con el producto problema en presencia y en ausencia de un sistema de activación metabólica.

  Momento de recolección del cultivo

  Para una evaluación a fondo, que sería necesaria para deducir un resultado negativo, deben aplicarse las tres condiciones experimentales siguientes, utilizando un tratamiento a corto plazo con y sin activación metabólica y un tratamiento a largo plazo sin activación metabólica (véanse los puntos 43, 44 y 45):

  • - Las células deben exponerse al producto problema sin activación metabólica durante 3 a 6 horas, y recolectarse cuando haya transcurrido un período de aproximadamente 1,5 veces la duración del ciclo celular normal desde el inicio del tratamiento (18).
  • - Las células deben exponerse al producto problema con activación metabólica durante 3 a 6 horas, y recolectarse cuando haya transcurrido un período de aproximadamente 1,5 veces la duración del ciclo celular normal desde el inicio del tratamiento (18).
  • - Las células deben exponerse continuamente sin activación metabólica hasta la recolección tras un período de aproximadamente 1,5 veces la duración del ciclo celular normal. Determinados productos (por ejemplo, análogos de nucleósidos) pueden detectarse mejor con un tiempo de tratamiento y recolección superior a 1,5 veces la duración del ciclo celular normal (24).

  En caso de que alguna de las anteriores condiciones experimentales conduzca a una respuesta positiva, puede no ser necesario investigar los otros regímenes de tratamiento.

  Preparación de los cromosomas

  Se tratan los cultivos celulares con colcemid o colchicina, por lo general durante un período de 1 a 3 horas antes de la recolección. Los cultivos celulares se recolectan y procesan por separado para preparar los cromosomas. Esta preparación incluye el tratamiento hipotónico de las células, y su fijación y tinción. En las monocapas, es posible que haya células mitóticas (identificables por su forma redondeada y por despegarse de la superficie) al final del tratamiento de 3-6 horas. Como estas células mitóticas se despegan con facilidad, pueden perderse cuando se retira el medio que contiene el producto problema. Si hay pruebas de un aumento sustancial del número de células mitóticas en comparación con los testigos, lo que indica una probable detención mitótica, las células deben recogerse por centrifugación y volver a añadirse a los cultivos, para evitar la pérdida de células que estén en mitosis, y que podrían presentar aberraciones cromosómicas, en el momento de la recolección.

  Análisis

  Todos los portaobjetos, incluidos los de los testigos positivos y negativos, deben codificarse de forma independiente antes de su análisis microscópico para detectar aberraciones cromosómicas. Dado que los métodos de fijación provocan con frecuencia que una parte de las células en metafase pierdan cromosomas, las células examinadas deben contener un número de centrómeros igual al número modal ± 2.

  Deben examinarse al menos 300 metafases bien extendidas de cada concentración y testigo para concluir que un producto problema es claramente negativo (véase el punto 45). Las 300 células deben repartirse a partes iguales entre las réplicas, cuando se utilizan cultivos replicados. Cuando se utiliza un solo cultivo sin replicar por concentración (véase el punto 21), deben examinarse al menos 300 metafases bien extendidas en este cultivo único. El examen de 300 células tiene la ventaja de aumentar la potencia estadística del ensayo y, además, será poco probable que se observen valores nulos (se espera que sean solo el 5 %) (44). El número de metafases examinadas puede reducirse cuando se observe un elevado número de células con aberraciones cromosómicas y el producto problema se considere claramente positivo.

  Deben examinarse células con aberraciones cromosómicas estructurales, contando tanto con las separaciones (gaps) como sin ellas. Las roturas y separaciones se definen en el apéndice 1 de conformidad con (45) (46). Las aberraciones cromosómicas y las cromatídicas deben registrarse por separado y clasificarse en subtipos (roturas, intercambios). Los procedimientos seguidos en el laboratorio deben garantizar que el análisis de las aberraciones cromosómicas es realizado por examinadores bien formados y es objeto de una revisión por pares, si procede.

  Pese a que el objeto del ensayo consiste en detectar aberraciones cromosómicas estructurales, es importante registrar las frecuencias de la poliploidía y de la endorreduplicación cuando se dan estos fenómenos (véase el punto 2).

  Competencia del laboratorio

  Con el fin de conseguir la suficiente experiencia con el ensayo antes de utilizarlo en ensayos sistemáticos, el laboratorio debe haber efectuado una serie de experimentos con productos positivos de referencia que actúen a través de diferentes mecanismos y con diversos testigos negativos (con diversos disolventes o vehículos). Las respuestas obtenidas con estos testigos positivos y negativos deben ser coherentes con la bibliografía. Esto no es aplicable a los laboratorios que tienen experiencia, esto es, que disponen de una base de datos históricos, según se define en el punto 37.

  Debe investigarse una selección de productos testigo positivos (véase el cuadro 1 en el punto 26) con tratamientos cortos y largos en ausencia de activación metabólica, y también con tratamientos cortos en presencia de activación metabólica, para demostrar su capacidad de detectar productos clastogénicos y determinar la efectividad del sistema de activación metabólica. Debe elegirse una gama de concentraciones de los productos seleccionados de forma que produzcan aumentos sobre el nivel de fondo relacionados con la concentración y reproducibles para demostrar la sensibilidad y el intervalo dinámico del sistema de ensayo.

  Datos sobre testigos históricos

  El laboratorio debe determinar:

  • - un intervalo y una distribución de los testigos positivos históricos,
  • - un intervalo y una distribución de los testigos negativos (sin tratar, disolventes) históricos.

  Cuando se obtengan datos por primera vez en relación con la distribución de testigos negativos históricos, los testigos negativos en paralelo deben ser coherentes con los datos publicados de los testigos, si existen. Según se añadan más datos experimentales sobre la distribución de los testigos, los testigos negativos en paralelo deben situarse idealmente dentro de los límites de control del 95 % de dicha distribución (44) (47). La base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio debe constituirse en un principio con un mínimo de 10 experimentos, pero preferiblemente con al menos 20 experimentos realizados en condiciones experimentales comparables. Los laboratorios deben utilizar métodos de control de calidad, como gráficos de control [por ejemplo, gráficos C o gráficos de medias (48)], con el fin de determinar la variabilidad de sus datos sobre los testigos positivos y negativos, y de demostrar que la metodología está «controlada» en su laboratorio (44). En la bibliografía pueden encontrarse más recomendaciones sobre cómo conseguir y utilizar los datos históricos (es decir, criterios de inclusión y exclusión de datos en los datos históricos y criterios de aceptabilidad para un determinado experimento) (47).

  Cualquier cambio en el protocolo experimental debe considerarse en función de su coherencia con las bases de datos de testigos históricos existentes del laboratorio. Cualquier incoherencia importante debería dar lugar a la creación de una nueva base de datos de testigos históricos.

  Los datos sobre los testigos negativos deben consistir en la incidencia de células con aberraciones cromosómicas procedentes de un solo cultivo o de la suma de cultivos replicados como se describe en el punto 21. Lo ideal sería que los testigos negativos en paralelo estuvieran dentro de los límites de control del 95 % de la distribución de la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio (44) (47). Cuando hay datos de los testigos negativos en paralelo que quedan fuera de los límites de control del 95 %, su inclusión en la distribución de testigos históricos puede ser aceptable en la medida en que dichos datos no sean valores extremos y haya pruebas de que el sistema de ensayo está «controlado» (véase el punto 37) y pruebas de la ausencia de fallos técnicos o humanos.

  DATOS E INFORME

  Presentación de los resultados

  Debe evaluarse el porcentaje de células que presentan aberraciones cromosómicas estructurales. Las aberraciones cromosómicas y cromatídicas, clasificadas por subtipos (roturas, intercambios), deben enumerarse por separado con su número y frecuencia en relación con los cultivos experimentales y testigos. Las separaciones se registran y se recogen en el informe aparte, pero por lo general no se incluyen en la frecuencia total de aberraciones. Se recoge en el informe el porcentaje de poliploidía o de células endorreduplicadas, cuando se observan.

  Asimismo, deben registrarse las determinaciones de citotoxicidad realizadas en paralelo en todos los cultivos tratados y en los testigos positivos y negativos de los experimentos principales sobre aberraciones.

  Deben proporcionarse datos de cada cultivo. Además, se resumirán todos los datos en forma de cuadro.

  Criterios de aceptabilidad

  La aceptabilidad de un ensayo se basa en los criterios siguientes:

  • - El testigo negativo en paralelo se considera aceptable para añadirse a la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio de acuerdo con lo descrito en el punto 39.
  • - Los testigos positivos en paralelo (véase el punto 26) deben inducir respuestas compatibles con las obtenidas en la base de datos de testigos positivos históricos y producir un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo.
  • - Deben cumplirse los criterios de proliferación celular en el testigo del disolvente (puntos 17 y 18).
  • - Se han sometido a ensayo las tres condiciones experimentales, a menos que una haya dado lugar a resultados positivos (véase el punto 28).
  • - Es analizable un número apropiado de células y de concentraciones (puntos 31 y 21).
  • - Los criterios de selección de la concentración superior son coherentes con los descritas en los puntos 22, 23 y 24.

  Evaluación e interpretación de los resultados

  Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente positivo si, en alguna de las condiciones experimentales examinadas (véase el punto 28):

  • a) al menos una de las concentraciones de ensayo muestra un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo,
  • b) el aumento está relacionado con la dosis cuando se evalúa con una prueba de tendencia adecuada,
  • c) alguno de los resultados está fuera de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límites de control del 95 % según la distribución de Poisson; véase el punto 39).

  Cuando se cumplen todos estos criterios, el producto problema se considera capaz de inducir aberraciones cromosómicas en las células de mamífero cultivadas en este sistema de ensayo. En la bibliografía se encuentran recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (49) (50) (51).

  Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente negativo si, en todas las condiciones experimentales examinadas (véase el punto 28):

  • a) ninguna de las concentraciones de ensayo muestra un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo,
  • b) no hay ningún aumento relacionado con la concentración cuando se evalúa con una prueba de tendencia adecuada,
  • c) todos los resultados están dentro de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límites de control del 95 % según la distribución de Poisson; véase el punto 39).

  el producto problema se considera entonces incapaz de inducir aberraciones cromosómicas en las células de mamífero cultivadas en este sistema de ensayo.

  No se requiere ninguna verificación de una respuesta claramente positiva o negativa.

  En caso de que la respuesta no sea ni claramente positiva ni claramente negativa como se describe más arriba, o a fin de ayudar a determinar la relevancia biológica de un resultado, los datos deben ser evaluados por expertos o mediante más investigaciones. Puede ser útil examinar células adicionales (en su caso) o realizar una repetición del experimento modificando las condiciones experimentales, como, por ejemplo, la separación entre concentraciones u otras condiciones de activación metabólica (es decir, concentración u origen de la fracción S9).

  En casos raros, incluso después de hacer más investigaciones, el conjunto de datos puede no permitir que se extraiga una conclusión de resultado positivo o negativo, por lo que la respuesta del producto problema se considerará dudosa.

  El aumento del número de células poliploides puede indicar que los productos problema son capaces de inhibir procesos mitóticos y de producir aberraciones cromosómicas numéricas (52). El aumento del número de células con cromosomas endorreduplicados puede indicar que los productos problema tienen la capacidad de inhibir el progreso del ciclo celular (53) (54) (véase el punto 2). Por consiguiente, deben consignarse por separado la incidencia de células poliploides y la de células con cromosomas endorreduplicados.

  Informe del ensayo

  El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

  Producto problema:

  • - origen, número de lote, fecha límite de utilización, si se dispone de ellos;
  • - estabilidad del producto problema en sí, si se conoce;
  • - solubilidad y estabilidad del producto problema en el disolvente, si se conocen;
  • - medición del pH, osmolalidad y precipitado en el medio de cultivo al que se ha añadido el producto problema, según proceda.

  Sustancia con un solo componente:

  • - aspecto físico, hidrosolubilidad, y propiedades fisicoquímicas pertinentes adicionales;
  • - identificación química, como nombre IUPAC o CAS, número CAS, código SMILES o InChI, fórmula estructural, pureza, identidad química de las impurezas según convenga y sea factible en la práctica, etc.

  Sustancias de componentes múltiples, sustancias UVCB y mezclas:

  • - en la medida de lo posible, caracterizadas por la identidad química (véase más arriba), presencia cuantitativa y propiedades fisicoquímicas pertinentes de los componentes.

  Disolvente:

  • - justificación de la elección del disolvente;
  • - también debe indicarse el porcentaje de disolvente en el medio de cultivo final.

  Células:

  • - tipo y origen de las células;
  • - características del cariotipo e idoneidad del tipo de células empleadas;
  • - ausencia de micoplasmas, en el caso de las líneas celulares;
  • - en el caso de las líneas celulares, información sobre la duración del ciclo celular, tiempo de duplicación o índice de proliferación;
  • - sexo de los donantes de sangre, edad y cualquier información pertinente sobre los donantes, sangre completa o linfocitos aislados y mitógeno empleado;
  • - número de pases, si se conoce, en el caso de las líneas celulares;
  • - métodos de mantenimiento de los cultivos celulares, en el caso de las líneas celulares;
  • - número modal de cromosomas, en el caso de las líneas celulares.

  Condiciones de ensayo:

  • - identidad del producto que detiene la división celular en la metafase, concentración empleada y duración de la exposición de las células;
  • - concentración del producto problema, expresada como concentración final en el medio de cultivo (por ejemplo, mM o μg o mg/ml de medio de cultivo);
  • - fundamento de la selección de las concentraciones y del número de cultivos con inclusión, p. ej., de datos relativos a la citotoxicidad y límites de solubilidad;
  • - composición de los medios, concentración de CO₂ si procede, nivel de humedad;
  • - concentración (o volumen) del disolvente y del producto problema añadidos al medio de cultivo;
  • - temperatura de incubación;
  • - tiempo de incubación;
  • - duración del tratamiento;
  • - momento de la recolección tras el tratamiento;
  • - densidad celular en el momento de la siembra, si procede;
  • - tipo y composición del sistema de activación metabólica (origen de la fracción S9, método de preparación de la mezcla S9, concentración o volumen de mezcla S9 y de fracción S9 en el medio de cultivo final, controles de calidad de la fracción S9);
  • - productos testigos positivo y negativo, concentraciones finales en cada una de las condiciones de tratamiento;
  • - métodos de preparación de los portaobjetos y técnica de tinción utilizados;
  • - criterios de aceptabilidad de los ensayos;
  • - criterios de examen de las aberraciones;
  • - número de metafases analizadas;
  • - métodos de medición de la citotoxicidad;
  • - cualquier información adicional relativa a la citotoxicidad y método utilizado;
  • - criterios empleados para considerar si los resultados de los estudios son positivos, negativos o dudosos;
  • - métodos utilizados para determinar el pH, la osmolalidad y la precipitación.

  Resultados:

  • - número de células tratadas y número de células recolectadas de cada cultivo cuando se utilizan líneas celulares;
  • - mediciones de la citotoxicidad como, por ejemplo, ARRC, DRP, IM u otras observaciones, en su caso;
  • - información sobre la duración del ciclo celular, tiempo de duplicación o índice de proliferación en el caso de las líneas celulares;
  • - signos de precipitación y momento de la determinación;
  • - definición de las aberraciones, incluidas las separaciones;
  • - número de células examinadas, número de células con aberraciones cromosómicas y tipo de aberraciones cromosómicas por separado para cada cultivo tratado y testigo, tanto con las separaciones como sin ellas;
  • - variaciones de la ploidía (células poliploides y células con cromosomas endorreduplicados, indicadas por separado), en su caso;
  • - relación concentración-respuesta, cuando sea posible;
  • - datos de los testigos negativos (disolvente) y positivos (concentraciones y disolventes) en paralelo;
  • - datos históricos de los testigos negativos (disolvente) y positivos, con intervalos, medias y desviaciones típicas y límites de control del 95 % para la distribución, así como el número de datos;
  • - análisis estadístico; valores p, si se dispone de ellos.

  Discusión de los resultados

  Conclusiones

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  Apéndice 1

  DEFINICIONES

  Aneuploidía : Desviación respecto al número diploide (o haploide) normal de cromosomas que afecta a uno o varios cromosomas, pero no a dotaciones completas de cromosomas (poliploidía).

  Apoptosis : Muerte celular programada, caracterizada por una serie de fases que llevan a la desintegración de las células para formar partículas limitadas por membranas que se eliminan a continuación por fagocitosis o por liberación.

  Proliferación celular : Aumento del número de células como resultado de divisiones celulares mitóticas.

  Producto : Sustancia o mezcla.

  Rotura cromatídica : Discontinuidad de una sola cromátida en la que existe una alteración clara de la alineación de una de las cromátidas.

  Separación (gap) cromatídica : Región sin teñir (lesión acromática) de una sola cromátida en la que existe una alteración mínima de la alineación de la cromátida.

  Aberración de tipo cromátida : Lesión cromosómica estructural que consiste en la rotura de cromátidas solas o en la rotura y reunión entre cromátidas.

  Aberración de tipo cromosoma : Lesión cromosómica estructural que consiste en la rotura, o en la rotura y reunión, de ambas cromátidas en el mismo sitio.

  Clastógeno : Producto que provoca aberraciones cromosómicas estructurales en poblaciones de células u organismos eucarióticos.

  Concentraciones : Se refiere a las concentraciones del producto problema en el medio de cultivo.

  Citotoxicidad : Para los ensayos contemplados en este método de ensayo que emplean líneas celulares, la citotoxicidad se identifica como una reducción de la duplicación relativa de la población (DRP) o del aumento relativo del recuento de células (ARRC) de las células tratadas en comparación con el testigo negativo (véanse el punto 17 y el apéndice 2). Para los ensayos contemplados en este método de ensayo que emplean cultivos primarios de linfocitos, la citotoxicidad se identifica como una reducción del índice mitótico de las células tratadas en comparación con el testigo negativo (véanse el punto 18 y el apéndice 2).

  Endorreduplicación : Proceso en el que, tras una fase S de replicación del ADN, el núcleo no pasa a la mitosis sino que inicia otra fase S. El resultado son cromosomas con 4, 8, 16, etc. cromátidas.

  Genotoxicidad : Término general que engloba todos los tipos de lesión del ADN o de los cromosomas, con inclusión de roturas, deleciones, adiciones, modificaciones y uniones de nucleótidos, reorganizaciones, mutaciones génicas, aberraciones cromosómicas y aneuploidía. No todos los tipos de efectos genotóxicos resultan en mutaciones o en lesiones cromosómicas estables.

  Índice mitótico (IM) : Relación entre el número de células en metafase y el número total de células observadas en una población celular; indica el grado de proliferación de dicha población.

  Mitosis : División del núcleo celular, generalmente compuesta por profase, prometafase, metafase, anafase y telofase.

  Mutágeno : Agente que provoca un cambio hereditario en una o varias secuencias de pares de bases del ADN en los genes o en la estructura de los cromosomas (aberraciones cromosómicas).

  Aberración numérica : Cambio del número de cromosomas respecto al número normal característico de las células empleadas.

  Poliploidía : Aberraciones cromosómicas numéricas en células u organismos que afectan a una o varias dotaciones completas de cromosomas, frente a las aberraciones que afectan solo a cromosomas sueltos (aneuploidía).

  Situación de la proteína p53 : La proteína p53 participa en la regulación del ciclo celular, en la apoptosis y en la reparación del ADN. Las células deficientes en proteína p53 funcional, incapaces de detener el ciclo celular o de eliminar las células dañadas por apoptosis u otros mecanismos (por ejemplo, inducción de la reparación del ADN) en relación con funciones de la proteína p53 en respuesta a las lesiones del ADN, deben estar, en teoría, más expuestas a las mutaciones génicas o a las aberraciones cromosómicas.

  Aumento relativo del recuento celular (ARRC) : Aumento del número de células en los cultivos expuestos a los productos frente al aumento en cultivos no tratados, coeficiente expresado en porcentaje.

  Duplicación relativa de la población (DRP) : Aumento del número de duplicaciones de la población en los cultivos expuestos a los productos frente al aumento en cultivos no tratados, coeficiente expresado en porcentaje.

  Fracción hepática S9 : Sobrenadante de homogeneizado de hígado después de centrifugación a 9 000 g, es decir, extracto de hígado crudo.

  Mezcla S9 : Mezcla de la fracción hepática S9 y de cofactores necesarios para la actividad metabólica de las enzimas.

  Testigo del disolvente : Término general para definir los cultivos testigo que reciben solo el disolvente utilizado para disolver el producto problema.

  Aberración estructural : Cambio de la estructura cromosómica detectable mediante examen microscópico de la metafase de la división celular, observado como deleciones y fragmentaciones, intracambios o intercambios.

  Producto problema : Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

  Testigos sin tratar : Cultivos que no reciben tratamiento (es decir, ni producto problema ni disolvente), pero que se someten al mismo proceso en paralelo que los cultivos que reciben el producto problema.

  Apéndice 2 FÓRMULAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD

  Índice mitótico (IM):

  

  Aumento relativo del recuento celular (ARRC) o duplicación relativa de la población (DRP) (se recomiendan ambos parámetros, ya que tienen en cuenta la proporción de la población celular que se ha dividido):

  

  

  donde:

  N.º de duplicaciones de la población = [log (número de células tras el tratamiento ÷ número de células al inicio)] ÷ log 2

  Por ejemplo, un ARRC o una DRP del 53 % indica un 47 % de citotoxicidad o citostasis y un 55 % de citotoxicidad o citostasis medido por el IM significa que el IM real es el 45 % del testigo.

  En cualquier caso, debe medirse el número de células antes de tratamiento, de la misma forma que con los cultivos testigos tratados y negativos.

  Si bien el recuento celular relativo (RCR, número de células en los cultivos tratados dividido por el número de células en los cultivos testigo) se había utilizado como parámetro de citotoxicidad en el pasado, ya no se recomienda porque puede subestimar la citotoxicidad.

  En los cultivos testigos negativos, la duplicación de la población debe ser compatible con el requisito de recolectar las células después del tratamiento al cabo de un período igual a aproximadamente 1,5 veces la duración del ciclo celular normal y el índice mitótico debe ser lo bastante elevado para obtener un número suficiente de células en mitosis y poder calcular de forma fiable una reducción del 50 %.»

• 4) En la parte B, el capítulo B.11 se sustituye por el texto siguiente:

  « B.11
  
  Ensayo de aberraciones cromosómicas en médula ósea de mamífero

  INTRODUCCIÓN

  El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE 475 (2016). Forma parte de una serie de métodos de ensayo sobre toxicología genética. Se ha elaborado un documento de la OCDE que aporta información sucinta sobre los ensayos de toxicología genética y una síntesis de los recientes cambios aportados a dichas directrices de ensayo (1).

  El ensayo de aberraciones cromosómicas en médula ósea de mamíferos in vivo es especialmente relevante para la genotoxicidad porque, aunque pueden variar según la especie, los factores de los procesos del metabolismo in vivo, de la farmacocinética y de la reparación del ADN están activos y contribuyen a las respuestas. Los ensayos in vivo también resultan útiles para ahondar en el estudio de la genotoxicidad detectada en un sistema in vitro.

  El ensayo de aberraciones cromosómicas en mamíferos in vivo se realiza para detectar aberraciones cromosómicas estructurales inducidas por los productos problema en células de médula ósea de animales, por lo general roedores (2) (3) (4) (5). Las aberraciones cromosómicas estructurales pueden ser de tipo cromosoma o de tipo cromátida. Si bien la mayoría de las aberraciones provocadas por productos genotóxicos son de tipo cromátida, también pueden producirse aberraciones de tipo cromosoma. Las lesiones cromosómicas y los efectos relacionados ocasionan numerosas enfermedades genéticas humanas y hay pruebas de peso de que, cuando estas lesiones y efectos relacionados provocan alteraciones en los oncogenes y en los genes supresores de tumores, tienen relación con el cáncer en los seres humanos y en sistemas experimentales. Puede surgir poliploidía (incluida la endorreduplicación) en los ensayos de aberraciones cromosómicas in vivo. No obstante, un aumento en la poliploidía no indica por sí solo que haya potencial aneugénico y puede indicar simplemente perturbación del ciclo celular o citotoxicidad. Este ensayo no está diseñado para medir la aneuploidía. Para la detección de la aneuploidía se recomiendan como ensayos in vivo e in vitro, respectivamente, el ensayo de micronúcleos en eritrocitos de mamífero in vivo (capítulo B.12 del presente anexo) o el ensayo de micronúcleos en células de mamífero in vitro (método B.49 del presente anexo).

  En el apéndice 1 se dan las definiciones de la terminología utilizada.

  CONSIDERACIONES INICIALES

  En este ensayo se utilizan habitualmente roedores, pero en algunos casos pueden ser adecuadas otras especies, si está justificado científicamente. El tejido diana es la médula ósea por estar muy vascularizada y por contener una población de células de ciclo corto que pueden aislarse y tratarse con facilidad. La justificación científica para la utilización de especies distintas de las ratas y los ratones debe facilitarse en el informe. Si se utilizan especies que no sean de roedores, se recomienda que la medición de aberraciones cromosómicas en la médula ósea se integre en otro ensayo adecuado de toxicidad.

  Si hay pruebas de que el producto o productos problema, o alguno o algunos de sus metabolitos, no llegan al tejido diana, puede no proceder la realización del presente ensayo.

  Antes de la utilización del método de ensayo con una mezcla para obtener datos con fines reglamentarios, debe considerarse si podría proporcionar resultados adecuados a tal fin y, en caso afirmativo, por qué. Tales consideraciones no son necesarias si la reglamentación impone el ensayo de la mezcla.

  PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO

  Se exponen los animales al producto problema por una vía adecuada y se sacrifican de forma compasiva, en un momento adecuado después del tratamiento. Antes de sacrificarlos, se tratan con un agente que detenga la división celular en la metafase (por ejemplo, colchicina o colcemid). A continuación, se realizan preparaciones de cromosomas de células de la médula ósea y se tiñen, tras lo cual se analizan las células en metafase para detectar aberraciones cromosómicas.

  VERIFICACIÓN DE LA COMPETENCIA DEL LABORATORIO

  Investigaciones de competencia

  A fin de establecer que posee la suficiente experiencia con la realización del ensayo antes de utilizarlo para hacer ensayos sistemáticos, el laboratorio debe haber demostrado su capacidad de reproducir los resultados previstos a partir de los datos publicados (por ejemplo, (6)) en cuanto a frecuencias de las aberraciones cromosómicas con un mínimo de dos productos como testigo positivo (incluidas las respuestas débiles inducidas por dosis bajas de los testigos positivos), como las que figuran en el cuadro 1 y con testigos de disolvente/vehículo compatibles (véase el punto 22). Estos experimentos deben utilizar dosis que den aumentos relacionados con la dosis y reproducibles, y demostrar la sensibilidad y el intervalo dinámico del sistema de ensayo en el tejido de interés (médula ósea), empleando el método de examen utilizado en el laboratorio. Este requisito no es aplicable a los laboratorios que tienen experiencia, esto es, que disponen de una base de datos históricos, según se define en los puntos 10-14.

  Datos sobre testigos históricos

  En el transcurso de las investigaciones de competencia, el laboratorio debe demostrar:

  • - un intervalo y una distribución de los testigos positivos históricos, y
  • - un intervalo y una distribución de los testigos negativos históricos.

  Cuando se obtengan datos por primera vez en relación con la distribución de testigos negativos históricos, los testigos negativos en paralelo deben ser coherentes con los datos publicados de los testigos, si existen. Según se añadan más datos experimentales sobre la distribución de los testigos históricos, los testigos negativos en paralelo deben situarse idealmente dentro de los límites de control del 95 % de dicha distribución. La base de datos históricos del laboratorio de testigos negativos debe ser estadísticamente sólida para garantizar la capacidad del laboratorio de evaluar la distribución de sus datos sobre los testigos negativos. La bibliografía sugiere que puede ser necesario un mínimo de 10 experimentos, pero que sería preferible contar con al menos 20 experimentos realizados en condiciones experimentales comparables. Los laboratorios deben utilizar métodos de control de calidad, como gráficos de control (por ejemplo, gráficos C o gráficos de medias (7)), con el fin de determinar la variabilidad de sus datos y de demostrar que la metodología está «controlada» en su laboratorio. En la bibliografía pueden encontrarse más recomendaciones sobre cómo conseguir y utilizar los datos históricos (es decir, criterios de inclusión y exclusión de datos en los datos históricos y criterios de aceptabilidad para un determinado experimento) (8).

  Si el laboratorio no completa un número suficiente de experimentos para establecer una distribución de los testigos negativos estadísticamente sólida (véase el punto 11) durante las investigaciones de competencia (descritas en el punto 9), es admisible que la distribución se establezca durante los primeros exámenes sistemáticos. Este enfoque debe seguir las recomendaciones recogidas en la bibliografía (8) y los resultados de los testigos negativos obtenidos en estos experimentos deben seguir siendo coherentes con los datos publicados de los testigos negativos.

  Cualquier cambio en el protocolo experimental debe considerarse en función de su impacto en el mantenimiento de la coherencia entre los datos resultantes y la base de datos históricos de testigos existente del laboratorio. Solo si hubiera incoherencias importantes se justificaría el establecimiento de una nueva base de datos históricos de testigos, en caso de que la evaluación por expertos determine que es diferente de la distribución anterior (véase el punto 11). Durante el nuevo establecimiento, puede que no sea necesaria una base de datos completa sobre testigos negativos para poder realizar una prueba real, siempre que el laboratorio pueda demostrar que sus valores de los testigos negativos en paralelo siguen estando en consonancia con su anterior base de datos o con los correspondientes datos publicados.

  Los datos sobre testigos negativos deben consistir en la incidencia de aberraciones cromosómicas estructurales, excluidas las separaciones (gaps), en cada animal. Lo ideal sería que los testigos negativos en paralelo estuvieran dentro de los límites de control del 95 % de la distribución de la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio. Cuando haya datos de los testigos negativos en paralelo que queden fuera de los límites de control del 95 %, su inclusión en la distribución de testigos históricos puede ser aceptable en la medida en que dichos datos no sean valores discrepantes extremos y haya pruebas de que el sistema de ensayo está «controlado» (véase el punto 11) y no haya pruebas de fallos técnicos o humanos.

  DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

  Preparación

  Selección de la especie animal

  Deben usarse animales adultos jóvenes y sanos de cepas utilizadas habitualmente en laboratorio. Si bien suelen emplearse ratas, también puede ser adecuado el uso de ratones. Puede utilizarse cualquier otra especie apropiada de mamíferos, si se facilita la justificación científica en el informe.

  Condiciones de alojamiento y alimentación de los animales

  Con roedores, la temperatura en el animalario debe ser de 22 °C (± 3 °C). Aunque la humedad relativa debe ser idealmente del 50 al 60 %, debe ser como mínimo del 40 % y preferentemente no superar el 70 %, salvo durante la limpieza del local. La iluminación debe ser artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se pueden utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. La elección de la dieta puede verse influida por la necesidad de garantizar una mezcla conveniente del producto problema si se administra por esta vía. Los roedores deben alojarse en grupos pequeños (no más de cinco animales por jaula) del mismo sexo y grupo de tratamiento si no se espera conducta agresiva, preferentemente en jaulas de suelo continuo con un enriquecimiento ambiental adecuado. Los animales podrán alojarse por separado solo si está justificado científicamente.

  Preparación de los animales

  Se utilizan normalmente animales adultos jóvenes y sanos (en el caso de los roedores, idealmente de 6-10 semanas de edad al inicio del tratamiento, aunque también pueden aceptarse animales ligeramente más viejos), y se reparten al azar entre los lotes tratados y los testigos. Los animales se identifican individualmente utilizando un método compasivo y mínimamente invasivo (por ejemplo, mediante anillamiento, marcado, implantación de un microchip o identificación biométrica, pero no grapado a las orejas o los dedos), y se deja que se acostumbren a las condiciones del laboratorio durante al menos cinco días. Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. Debe evitarse la contaminación cruzada por el testigo positivo y el producto problema. La variación del peso de los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder del ± 20 % del peso medio de cada sexo.

  Preparación de las dosis

  Los productos problema sólidos deben disolverse o suspenderse en disolventes o vehículos adecuados, o mezclarse con los alimentos o con el agua de bebida, antes de su administración a los animales. Los productos problema líquidos pueden administrarse directamente o diluirse antes de la administración. En lo que respecta a la exposición por inhalación, los productos problema pueden administrarse en forma de gas, de vapor o de aerosol sólido o líquido, dependiendo de sus propiedades fisicoquímicas. Deben utilizarse preparaciones recientes del producto problema, salvo que se cuente con datos de estabilidad que avalen la posibilidad de su conservación y definan las condiciones adecuadas de esta.

  Disolvente o vehículo

  El disolvente o vehículo no debe producir efectos tóxicos a las dosis empleadas, y no debe sospecharse que pueda reaccionar químicamente con el producto problema. Si se emplean disolventes o vehículos poco conocidos, debe disponerse de información de referencia que avale su compatibilidad. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente o vehículo acuoso. Pueden citarse como ejemplos de disolventes o vehículos compatibles comúnmente utilizados el agua, el suero fisiológico, la solución de metilcelulosa, la solución de sal sódica de carboximetilcelulosa, el aceite de oliva y el aceite de maíz. A falta de información histórica o publicada sobre testigos que demuestre que un disolvente o vehículo elegido atípico no induce ninguna aberración estructural ni otro tipo de efectos nocivos, debe realizarse un estudio inicial a fin de establecer la aceptabilidad del testigo de disolvente/vehículo.

  Testigos

  Testigos positivos

  En principio debe incluirse en cada ensayo un grupo de animales tratados con un producto testigo positivo. Esto puede no aplicarse cuando el laboratorio de ensayo ha demostrado su competencia en la realización del ensayo y ha establecido un intervalo histórico de testigos positivos. Si no se incluye un grupo testigo positivo en paralelo, debe contarse en cada experimento con testigos de examen (portaobjetos fijados y sin teñir). Esto puede conseguirse incluyendo en el examen del estudio muestras de referencias adecuadas que se hayan obtenido y conservado a partir de un experimento con testigo positivo aparte realizado periódicamente (por ejemplo, cada 6 o 18 meses) en el laboratorio donde se realiza el ensayo; por ejemplo, durante las pruebas de competencia y, a continuación, con carácter periódico, en caso necesario.

  Los productos utilizados como testigo positivo deben provocar con fiabilidad un aumento detectable en la frecuencia de células con aberraciones cromosómicas estructurales respecto al nivel espontáneo. Las dosis del testigo positivo deben elegirse de tal forma que los efectos sean claros, pero no revelen inmediatamente al examinador la identidad de las muestras codificadas. El producto empleado como testigo positivo podrá administrarse por una vía distinta de la del producto problema, con otro programa de tratamiento, y el muestreo podrá efectuarse solo en un único momento. Además, podrá considerarse la utilización como testigo positivo de productos de clases químicas afines, cuando sea posible. En el cuadro 1 se incluyen ejemplos de productos válidos como testigo positivo.

  Cuadro 1.

  Ejemplos de productos válidos como testigo positivo

  Producto	CAS RN
  Metanosulfonato de etilo	62-50-0
  Metanosulfonato de metilo	66-27-3
  Etil-nitrosourea	759-73-9
  Mitomicina C	50-07-7
  Ciclofosfamida (monohidrato)	50-18-0 (6055-19-2)
  Trietilenomelamina	51-18-3

  Testigos negativos

  Deben incluirse animales de un grupo testigo negativo en cada tiempo de muestreo y someterse al mismo proceso que los grupos de tratamiento, salvo que no reciben el tratamiento con el producto problema. Si se utiliza un disolvente o vehículo para la administración del producto problema, el grupo testigo recibirá este disolvente o vehículo. No obstante, si mediante los datos históricos de testigos negativos se demuestra que la variabilidad entre animales y la frecuencia de las células con aberraciones estructurales son coherentes en cada momento de muestreo para el laboratorio de ensayo, puede que solo sea necesario un único muestreo del testigo negativo. En los casos en que se realice un único muestreo de los testigos negativos, debe corresponder al primer momento de muestreo utilizado en el estudio.

  PROCEDIMIENTO

  Número y sexo de los animales

  En general, la respuesta de micronúcleos es similar entre animales machos y hembras (9) y se espera que esto sea así también respecto a las aberraciones cromosómicas estructurales; por lo tanto, la mayor parte de los estudios podría realizarse con cualquier sexo. Unos datos que demuestren la existencia de diferencias pertinentes entre machos y hembras (como diferencias de toxicidad sistémica, metabolismo, biodisponibilidad, toxicidad para la médula ósea, etc., con inclusión por ejemplo de un estudio de determinación del intervalo) favorecerían la utilización de ambos sexos. En este caso puede ser conveniente realizar un estudio con ambos sexos, por ejemplo como parte de un estudio de toxicidad por administración continuada. Podría ser adecuado utilizar el diseño factorial en caso de que se utilizaran animales de ambos sexos. En el apéndice 2 se recogen detalles sobre cómo analizar los datos utilizando dicho diseño.

  El tamaño de los grupos al principio del estudio debe establecerse de manera que comprendan un mínimo de 5 animales analizables de un mismo sexo, o de cada sexo si se utilizan ambos, por grupo. En caso de que la exposición humana a los productos pueda ser específica de un sexo, como sucede con algunos productos farmacéuticos, el ensayo debe realizarse con animales del sexo correspondiente. Como orientación sobre las necesidades máximas típicas de animales, un estudio de la médula ósea con dos momentos de muestreo con tres grupos tratados y un grupo testigo negativo en paralelo, más un grupo testigo positivo (cada grupo compuesto por cinco animales de un solo sexo), requeriría 45 animales.

  Dosis

  Si se lleva a cabo un estudio previo de determinación del intervalo porque no se dispone aún de datos adecuados para ayudar en la selección de las dosis, ha de hacerse en el mismo laboratorio, con la misma especie, cepa, sexo y protocolo de tratamiento que se vayan a utilizar en el estudio principal (10). El estudio debe tratar de determinar la dosis máxima tolerada (DMT), es decir, la dosis más alta que se tolera sin signos de toxicidad que limite el estudio, en relación con la duración del período de estudio (por ejemplo, reducción del peso corporal o citotoxicidad para el sistema hematopoyético) pero sin llegar a la muerte ni presentar signos de dolor, sufrimiento o angustia que requieran el sacrificio compasivo (11).

  La dosis más alta también puede definirse como la dosis que produce algún signo de toxicidad para la médula ósea.

  Los productos que presentan saturación de las propiedades toxicocinéticas, o inducen procesos de destoxificación que puedan dar lugar a una disminución de la exposición después de un tratamiento a largo plazo pueden constituir excepciones en cuanto a los criterios de establecimiento de la dosis y han de evaluarse caso por caso.

  A fin de obtener información sobre la relación dosis-respuesta, los estudios completos deben incluir un grupo testigo negativo y un mínimo de tres dosis separadas por un factor que será en general de 2 y nunca superior a 4. Si el producto problema no produce toxicidad en un estudio de determinación del intervalo o según los datos disponibles, la dosis más alta para una administración única debe ser de 2 000 mg/kg de peso corporal. No obstante, si el producto problema provoca toxicidad, la DMT debe ser la mayor dosis administrada y las dosis deben abarcar preferentemente el intervalo desde la dosis máxima hasta una dosis que provoque toxicidad escasa o nula. Si se observa toxicidad para el tejido diana (médula ósea) a todas las dosis utilizadas en el ensayo, se recomienda hacer otro estudio a dosis no tóxicas. Unos estudios destinados a caracterizar de forma más completa la relación cuantitativa dosis-respuesta pueden necesitar más grupos de dosis. Estos límites pueden variar con determinados tipos de productos problema (por ejemplo, productos farmacéuticos de uso humano) a los que se apliquen requisitos específicos.

  Ensayo límite

  Si los experimentos de determinación del intervalo, o los datos disponibles sobre cepas animales afines, indican que un régimen de tratamiento de, como mínimo, la dosis límite (véase más adelante) no produce efectos tóxicos observables (entre los que se incluirían la depresión de la proliferación de la médula ósea u otros signos de citotoxicidad para el tejido diana) y si, basándose en estudios de genotoxicidad in vitro o en datos de productos estructuralmente afines, no cabe esperar genotoxicidad, entonces puede no considerarse necesario realizar un estudio completo con tres dosis, siempre que se haya demostrado que el producto o productos problema alcanzan el tejido diana (médula ósea). En tales casos, podrá ser suficiente una sola dosis, al nivel de la dosis límite. Para un período de administración superior a 14 días, la dosis límite será de 1 000 mg/kg de peso corporal/día. Para un período de administración inferior o igual a 14 días, la dosis límite será de 2 000 mg/kg de peso corporal/día.

  Administración de las dosis

  A la hora de diseñar el ensayo, debe tenerse en cuenta la vía prevista de exposición humana. Por lo tanto, cuando esté justificado, podrán elegirse vías de exposición como los alimentos, el agua de bebida, la tópica, la subcutánea, la intravenosa, la oral forzada (por sonda), la inhalación, la intratraqueal o la implantación. En cualquier caso, la vía debe elegirse de forma que se garantice una exposición adecuada del tejido o tejidos diana. En general no se recomienda la inyección intraperitoneal, ya que no es una vía de exposición humana prevista, y debe utilizarse solo en casos que tengan justificación científica específica. Si el producto problema se mezcla con los alimentos o el agua de bebida, en particular en caso de administración única, debe procurarse que el plazo entre el consumo de los alimentos o el agua y el muestreo sea suficiente para permitir la detección de los efectos (véanse los puntos 33-34). El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez por sonda o por inyección depende del tamaño del animal utilizado. Dicho volumen no debe en principio superar 1 ml/100 g de peso corporal, salvo en el caso de las soluciones acuosas, en que puede llegarse a un máximo de 2 ml/100 g. El uso de volúmenes superiores deberá justificarse. Excepto en el caso de productos problema irritantes o corrosivos, que por lo general producen efectos exacerbados a concentraciones superiores, la variabilidad del volumen de ensayo debe reducirse al mínimo ajustando la concentración para conseguir la administración de un volumen constante en relación con el peso corporal a todas las dosis.

  Pauta de tratamiento

  Los productos problema se administran normalmente de una vez, pero también puede dividirse la dosis (es decir, realizar dos o más tratamientos el mismo día separados por no más de 2 o 3 horas) con el fin de facilitar la administración de grandes volúmenes. En estas circunstancias, o cuando se administra el producto problema por inhalación, el tiempo de muestreo debe programarse basándose en el momento de la última administración o el final de la exposición.

  Se dispone de pocos datos sobre la idoneidad de un protocolo de administración continuada para este ensayo. Sin embargo, en circunstancias en las que sea deseable integrar este ensayo con un ensayo de toxicidad por administración continuada, deberá tenerse cuidado para evitar la pérdida de células mitóticas con lesiones cromosómicas, lo que puede suceder a dosis tóxicas. Esta integración es aceptable siempre y cuando la dosis más alta sea superior o igual a la dosis límite (véase el punto 29) y se le administre a un grupo la dosis límite mientras dure el período de tratamiento. El ensayo de micronúcleos (método B.12) debe considerarse el ensayo in vivo de elección para detectar las aberraciones cromosómicas cuando se desee la integración con otros estudios.

  Deben tomarse muestras de médula ósea en dos momentos distintos tras el tratamiento único. En el caso de los roedores, el primer intervalo de muestreo debe ser el tiempo equivalente a 1,5 veces la duración del ciclo celular normal (suele ser de 12 a 18 horas después del período de tratamiento). Dado que el tiempo necesario para que el producto o productos problema se absorban y se metabolicen, así como su efecto sobre la cinética del ciclo celular, pueden modificar el momento óptimo para detectar aberraciones cromosómicas, se recomienda tomar otra muestra 24 horas después de la primera. En el primer momento de muestreo, se tratan todos los grupos de dosis y se toman muestras de todos ellos para su análisis; no obstante, en los momentos de muestreo posteriores, solo es necesario administrar la dosis más alta. Si se siguen pautas de tratamiento de más de un día con justificación científica, debe hacerse un solo muestreo en general a un máximo de aproximadamente 1,5 veces la duración del ciclo celular normal desde el último tratamiento.

  Tras el tratamiento y antes de la recogida de la muestra, se les inyecta a los animales por vía intraperitoneal una dosis adecuada de un agente que detenga la división celular en la metafase (por ejemplo, colcemid o colchicina), y las muestras se toman a un intervalo adecuado a partir de ese momento. En el caso de los ratones, este intervalo hasta el muestreo es aproximadamente de 3-5 horas y en el de las ratas es de 2-5 horas. Se toman las células de la médula ósea, se hinchan, fijan y tiñen, y se analizan en busca de aberraciones cromosómicas (12).

  Observaciones

  Deben hacerse observaciones clínicas generales de los animales de ensayo y registrarse los signos clínicos al menos una vez al día, preferentemente a la misma hora u horas cada día y teniendo en cuenta el período de mayor intensidad de los efectos previstos tras la administración. Al menos dos veces al día durante el periodo de administración, se debe observar la posible morbilidad y mortalidad de todos los animales. Deben pesarse todos los animales al principio del estudio, al menos una vez por semana durante los estudios de administración continuada, y en el momento del sacrificio. En los estudios de al menos una semana de duración, el consumo de alimentos debe medirse al menos semanalmente. Si el producto problema se administra con el agua de bebida, debe medirse el consumo de agua cada vez que se cambie el agua y al menos una vez por semana. Los animales que presenten signos de toxicidad excesiva pero no letal deben sacrificarse de forma compasiva antes de que termine el período del ensayo (11).

  Exposición del tejido diana

  Debe tomarse una muestra de sangre en el momento o momentos adecuados para permitir la investigación de los niveles plasmáticos de los productos problema, a fin de demostrar que ha habido exposición de la médula ósea, cuando esté justificado y cuando no se disponga de otros datos de exposición (véase el punto 44).

  Preparación de la médula ósea y de los cromosomas

  Inmediatamente después del sacrificio compasivo, se extraen células de la médula ósea del fémur o la tibia de los animales, se exponen a una solución hipotónica y se fijan. A continuación, las células en metafase se extienden en portaobjetos y se tiñen según métodos establecidos ((3) (12)).

  Análisis

  Todos los portaobjetos, incluidos los de los testigos positivos y negativos, deben codificarse independientemente antes del análisis y deben aleatorizarse de forma que el examinador no tenga conocimiento de cómo se han tratado.

  Se evalúa la citotoxicidad determinando el índice mitótico en un mínimo de 1 000 células por animal, en todos los animales tratados (incluidos los testigos positivos) y en los animales usados como testigos negativos sin tratar o solo con disolvente/vehículo.

  Deben analizarse al menos 200 metafases en cada animal para detectar aberraciones cromosómicas estructurales, contando tanto con las separaciones (gaps) como sin ellas. No obstante, en caso de que la base de datos históricos de testigos negativos indique que la frecuencia media de aberraciones cromosómicas estructurales de fondo es < 1 % en el laboratorio de ensayo, debe considerarse el examen de células adicionales. Las aberraciones de tipo cromosoma y las de tipo cromátida deben registrarse por separado y clasificarse en subtipos (roturas, intercambios). Los procedimientos seguidos en el laboratorio deben garantizar que el análisis de las aberraciones cromosómicas es realizado por examinadores bien formados y es objeto de una revisión por pares, si procede. Reconociendo que los métodos de preparación de los portaobjetos provocan con frecuencia la rotura de células en metafase y la consiguiente pérdida de cromosomas, las células examinadas deben, por tanto, contener un número de centrómeros no inferior a 2n ± 2, donde n es el número de cromosomas haploides de la especie.

  DATOS E INFORME

  Tratamiento de los resultados

  Los datos relativos a cada animal se presentarán en forma de cuadro. Deben evaluarse respecto a cada animal el índice mitótico, el número de células en metafase examinadas, el número de aberraciones por célula en metafase y el porcentaje de células con aberraciones cromosómicas estructurales. Se debe hacer una relación de los distintos tipos de dichas aberraciones, con su número y frecuencia, respecto a los grupos tratados y los testigos. Las separaciones, así como las células poliploides y las células con cromosomas endorreduplicados, se registran por separado. La frecuencia de las separaciones se recoge en el informe, pero por lo general no se incluye en el análisis de la frecuencia total de aberraciones estructurales. Si no se observan diferencias en la respuesta de un sexo y otro, los datos pueden combinarse para el análisis estadístico. Deben también consignarse los datos sobre toxicidad y signos clínicos de los animales.

  Criterios de aceptabilidad

  Los siguientes criterios determinan la aceptabilidad del ensayo:

  • a) Los datos del testigo negativo en paralelo se consideran aceptables para añadirse a la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio (véanse los puntos 11-14).
  • b) Los testigos positivos en paralelo o los testigos de examen deben inducir respuestas compatibles con las obtenidas en la base de datos de testigos positivos históricos y producir un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo (véanse los puntos 20-21).
  • c) Se ha analizado el número adecuado de dosis y células.
  • d) Los criterios de selección de la concentración más alta son coherentes con los descritos en los puntos 25-28.

  Evaluación e interpretación de los resultados

  Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente positivo si:

  • a) al menos uno de los grupos de tratamiento presenta un aumento estadísticamente significativo de la frecuencia de células con aberraciones cromosómicas estructurales (excluidas las separaciones) en comparación con el testigo negativo en paralelo,
  • b) este aumento está relacionado con la dosis al menos en uno de los momentos de muestreo cuando se evalúan con una prueba de tendencia adecuada, y
  • c) alguno de estos resultados está fuera de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límites de control del 95 % según la distribución de Poisson).

  Si se examina únicamente la dosis más alta en un momento particular de muestreo, el producto problema se considera claramente positivo si se ve un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo y los resultados están fuera de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límites de control del 95 % según la distribución de Poisson). En la bibliografía se encuentran recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (13). Al realizar un análisis de la relación dosis-respuesta, deben someterse al mismo por lo menos tres grupos tratados con el producto problema. Las pruebas estadísticas deben utilizar como unidad experimental el animal. Un resultado positivo en el ensayo de aberraciones cromosómicas indica que el producto problema provoca aberraciones cromosómicas estructurales en la médula ósea de la especie estudiada.

  Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente negativo si, en todas las condiciones experimentales examinadas:

  • a) ninguno de los grupos de tratamiento presenta un aumento estadísticamente significativo de la frecuencia de células con aberraciones cromosómicas estructurales (excluidas las separaciones) en comparación con el testigo negativo simultáneo,
  • b) no hay ningún aumento relacionado con la concentración en ningún momento de muestreo cuando se evalúa con una prueba de tendencia adecuada,
  • c) todos los resultados están dentro de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límites de control del 95 % según la distribución de Poisson), y
  • d) ha habido exposición de la médula ósea al producto problema.

  En la bibliografía se encuentran recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (13). Como pruebas de exposición de la médula ósea a un producto problema pueden citarse la reducción del índice mitótico o la medición de los niveles hemáticos o plasmáticos del producto o productos problema. En caso de administración por vía intravenosa, no hacen falta pruebas de la exposición. Alternativamente, para demostrar la exposición de la médula ósea es posible utilizar los datos de ADME obtenidos en un estudio independiente utilizando la misma vía y la misma especie. Un resultado negativo indica que, en las condiciones del ensayo, el producto problema no provoca aberraciones cromosómicas estructurales en la médula ósea de la especie estudiada.

  No se requiere ninguna verificación de una respuesta positiva clara o negativa clara.

  En los casos en que la respuesta no sea claramente negativa ni positiva y con el fin de ayudar a determinar la importancia biológica de un resultado (por ejemplo, un incremento límite o débil), los datos deben ser evaluados por expertos o hay que completar otras investigaciones de los experimentos existentes. En algunos casos, puede ser de utilidad el análisis de más células o la repetición de un experimento en condiciones experimentales modificadas.

  En casos excepcionales, incluso después de otras investigaciones, los datos no permiten concluir si el producto problema produce resultados positivos o negativos, y el estudio deberá considerarse, por tanto, como de resultado dudoso.

  Deben consignarse por separado las frecuencias de las metafases poliploides y endorreduplicadas entre las metafases totales. El aumento del número de células poliploides o endorreduplicadas puede indicar que el producto problema es capaz de inhibir procesos mitóticos o la progresión del ciclo celular (véase el punto 3).

  Informe del ensayo

  El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

  Resumen

  Producto problema:

  • - origen, número de lote, fecha límite de utilización, si se dispone de ellos;
  • - estabilidad del producto problema, si se conoce.

  Sustancia con un solo componente:

  • - aspecto físico, hidrosolubilidad, y propiedades fisicoquímicas pertinentes adicionales;
  • - identificación química, como nombre IUPAC o CAS, número CAS, código SMILES o InChI, fórmula estructural, pureza, identidad química de las impurezas según convenga y sea factible en la práctica, etc.

  Sustancias de componentes múltiples, sustancias UVCB y mezclas:

  • - en la medida de lo posible, caracterizadas por la identidad química (véase más arriba), presencia cuantitativa y propiedades fisicoquímicas pertinentes de los componentes.

  Preparación del producto problema:

  • - justificación de la elección del vehículo;
  • - solubilidad y estabilidad del producto problema en el disolvente o vehículo, si se conocen;
  • - preparación de formulaciones para la administración con los alimentos, con el agua de bebida o por inhalación;
  • - determinaciones analíticas de las formulaciones (por ejemplo, estabilidad, homogeneidad, concentraciones nominales), si se han llevado a cabo;

  Animales de ensayo:

  • - especie y cepa utilizadas y justificación de su utilización;
  • - número, edad y sexo de los animales;
  • - origen, condiciones del alojamiento, alimentación, etc.;
  • - método para la identificación individual de los animales;
  • - para los estudios a corto plazo: peso individual de los animales al inicio y al final del ensayo; para los estudios de más de una semana: pesos corporales individuales durante el estudio y consumo de alimentos; deben incluirse el intervalo, la media y la desviación típica de los pesos corporales de cada grupo.

  Condiciones del ensayo:

  • - testigos positivos y negativos (vehículo o disolvente);
  • - datos del estudio de determinación del intervalo, si se ha llevado a cabo;
  • - justificación de la selección de las dosis;
  • - datos de la formulación del producto problema;
  • - datos sobre la administración del producto problema;
  • - fundamento de la elección de la vía de administración y de la duración de esta;
  • - métodos para verificar que el producto o productos problema han llegado a la circulación general o a la médula ósea;
  • - dosis reales (mg/kg peso corporal/día) calculadas a partir del consumo y de la concentración (ppm) del producto problema en los alimentos o en el agua de bebida, en su caso;
  • - datos sobre la calidad de los alimentos y del agua;
  • - método de sacrificio compasivo;
  • - método de analgesia (en su caso);
  • - descripción detallada de las pautas de tratamiento y muestreo y justificación de las decisiones;
  • - métodos de preparación de los portaobjetos;
  • - métodos de determinación de la toxicidad;
  • - identidad del producto que detiene la división celular en la metafase, su concentración, dosis y tiempo de administración antes del muestreo;
  • - procedimientos de aislamiento y conservación de las muestras;
  • - criterios de examen de las aberraciones;
  • - número de células en metafase analizadas por animal y número de células analizadas para la determinación del índice mitótico;
  • - criterios de aceptabilidad del estudio;
  • - criterios empleados para considerar que los resultados de los estudios son positivos, negativos o no concluyentes.

  Resultados:

  • - estado de los animales antes y a lo largo del ensayo, incluidos los signos de toxicidad;
  • - índice mitótico de cada animal por separado;
  • - tipo y número de aberraciones y de células aberrantes en cada animal por separado;
  • - número total de aberraciones por grupo, con medias y desviaciones típicas;
  • - número de células con aberraciones por grupo, con medias y desviaciones típicas;
  • - variaciones de la ploidía, en su caso, incluidas las frecuencias de las células poliploides o endorreduplicadas;
  • - relación dosis-respuesta, cuando sea posible;
  • - análisis estadísticos y métodos aplicados;
  • - datos justificativos de que se ha producido la exposición de la médula ósea;
  • - datos de los testigos negativos y positivos estudiados en paralelo, con intervalos, medias y desviaciones típicas;
  • - datos históricos de los testigos negativos y positivos, con intervalos, medias y desviaciones típicas y límites de control del 95 % para la distribución, así como el período de tiempo comprendido y el número de observaciones;
  • - criterios cumplidos para determinar una respuesta positiva o negativa.

  Discusión de los resultados

  Conclusión

  Referencias

  BIBLIOGRAFÍA

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  • (11) OCDE (2000), “Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, Nº19, OECD Publishing, Paris.
  • (12) Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse, Methods in Molecular Biology, Vol. 1044, pp. 147-163.
  • (13) Lovell, D.P. et al. (1989), “Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.

  Apéndice 1

  DEFINICIONES

  Aneuploidía : Desviación respecto al número diploide (o haploide) normal de cromosomas en uno o varios cromosomas, pero sin multiplicar dotaciones completas de cromosomas (véase “poliploidía”).

  Centrómero : Región o regiones del cromosoma con las que se asocian las fibras del huso acromático durante la división celular para permitir el movimiento ordenado de los cromosomas hijos hacia los polos de las células hijas.

  Producto : Sustancia o mezcla.

  Aberración de tipo cromátida : Lesión cromosómica estructural que consiste en la rotura de cromátidas solas o en la rotura y reunión entre cromátidas.

  Aberración de tipo cromosoma : Lesión cromosómica estructural que consiste en la rotura, o en la rotura y reunión, de ambas cromátidas en el mismo sitio.

  Endorreduplicación : Proceso en el que, tras una fase S de replicación del ADN, el núcleo no pasa a la mitosis sino que inicia otra fase S. El resultado son cromosomas con 4, 8, 16, etc. cromátidas.

  Separación (gap) : Lesión acromática más estrecha que la anchura de una cromátida, y con alteración mínima de la alineación de las cromátidas.

  Índice mitótico : Relación entre el número de células en mitosis y el número total de células de una población, que es una medida de la proliferación de dicha población celular.

  Aberración numérica : Cambio del número de cromosomas respecto al número normal característico de los animales empleados (aneuploidía).

  Poliploidía : Aberración cromosómica numérica que implica un cambio en el número de toda la dotación cromosómica, en contraste con un cambio numérico en una parte de la dotación cromosómica (aneuploidía).

  Aberración cromosómica estructural : Cambio de la estructura cromosómica detectable mediante examen microscópico de la metafase de la división celular, observado como deleciones y fragmentaciones, intracambios o intercambios.

  Producto problema : Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

  Apéndice 2 DISEÑO FACTORIAL PARA IDENTIFICAR LAS DIFERENCIAS DE SEXO EN EL ENSAYO DE ABERRACIONES CROMOSÓMICAS IN VIVO

  Diseño factorial y su análisis

  En este diseño, un mínimo de 5 machos y 5 hembras se someten a ensayo a cada concentración, lo que resulta en la utilización de un mínimo de 40 animales (20 machos y 20 hembras, más los testigos positivos pertinentes).

  Este diseño, que es uno de los diseños factoriales más simples, es equivalente a un análisis de varianza de dos factores, con el sexo y el nivel de concentración como efectos principales. Los datos pueden analizarse con numerosos paquetes de software estadístico estándar tales como SPSS, SAS, STATA, Genstat, así como utilizando R.

  El análisis divide la variabilidad de la serie de datos en la variabilidad entre sexos, la variabilidad entre las concentraciones y la relativa a la interacción entre los sexos y las concentraciones. Cada uno de los términos se somete a prueba frente a una estimación de la variabilidad entre los animales replicados dentro de los grupos de animales del mismo sexo que han recibido la misma concentración. Todos los detalles de la metodología subyacente se encuentran en muchos manuales estadísticos conocidos (véanse las referencias) y en las funciones de «ayuda» de los paquetes estadísticos.

  El análisis se lleva a cabo inspeccionando el término de la interacción sexo x concentración en el cuadro de ANOVA (5). A falta de un término de interacción significativo, los valores combinados de distintos sexos o niveles de concentración ofrecen pruebas estadísticas válidas entre los niveles, sobre la base del término de ANOVA de variabilidad intragrupo puesta en común.

  El análisis continúa dividiendo la estimación de la variabilidad entre concentraciones en contrastes que permiten una prueba de contrastes lineales y cuadráticos de las respuestas a través de los niveles de concentración. Cuando existe un término de interacción significativa sexo x concentración, este término también puede dividirse en contrastes de interacción lineal x sexo y cuadrático x sexo. Estos términos permiten pruebas de si las respuestas a la concentración son paralelas en los dos sexos, o si existe una diferencia en la respuesta entre estos.

  La estimación de la variabilidad intragrupo puesta en común se puede utilizar para proporcionar pruebas pareadas de la diferencia entre medias. Estas comparaciones podrían realizarse entre las medias para los dos sexos y entre las medias para los diferentes niveles de concentración, así como para las comparaciones con los niveles de los testigos negativos. En los casos en los que existe una interacción significativa pueden hacerse comparaciones entre las medias de concentraciones diferentes dentro de un sexo o entre las medias de los sexos a la misma concentración.

  Bibliografía

  Hay muchos manuales estadísticos que debaten la teoría, el diseño, la metodología, el análisis y la interpretación de los diseños factoriales que van desde los análisis bifactoriales más sencillos hasta las formas más complejas utilizadas en la metodología de diseño de experimentos. La lista que sigue no es exhaustiva. Algunos libros proporcionan ejemplos resueltos de diseños comparables, en algunos casos con el código para aplicar los análisis utilizando diversos paquetes de software.

  Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

  Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

  Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

  Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

  Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

  Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

  Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.»

• 5) En la parte B, el capítulo B.12 se sustituye por el texto siguiente:

  « B.12
  
  Ensayo de micronúcleos en eritrocitos de mamífero

  INTRODUCCIÓN

  El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE 474 (2016). Forma parte de una serie de métodos de ensayo sobre toxicología genética. Se ha elaborado un documento de la OCDE que aporta información sucinta sobre los ensayos de toxicología genética y una síntesis de los recientes cambios aportados a dichas directrices de ensayo (1).

  El ensayo de micronúcleos de mamífero in vivo es especialmente relevante para evaluar la genotoxicidad porque, aunque pueden variar según la especie, los factores de los procesos del metabolismo in vivo, de la farmacocinética y de la reparación del ADN están activos y contribuyen a las respuestas. Los ensayos in vivo también resultan útiles para ahondar en el estudio de la genotoxicidad detectada en un sistema in vitro.

  El ensayo de micronúcleos de mamífero in vivo se emplea para detectar lesiones provocadas por el producto problema en los cromosomas o el aparato mitótico de los eritroblastos. El ensayo sirve para evaluar la formación de micronúcleos en los eritrocitos tomados bien de la médula ósea o bien de la sangre periférica de los animales (por lo general, roedores).

  El ensayo de micronúcleos tiene por objeto determinar los productos que ocasionan lesiones citogenéticas que dan lugar a la formación de micronúcleos con fragmentos de cromosomas o cromosomas enteros retardados.

  Cuando los eritroblastos de la médula ósea se transforman en eritrocitos inmaduros (a veces denominados también reticulocitos o eritrocitos policromáticos), el núcleo principal es eliminado, pero los micronúcleos que se hayan formado pueden permanecer en el citoplasma. Resulta más fácil visualizar o detectar los micronúcleos en estas células, pues carecen de núcleo principal. El aumento de la frecuencia de micronúcleos en los eritrocitos inmaduros de animales tratados es indicativo de la inducción de aberraciones cromosómicas numéricas o estructurales.

  Los eritrocitos micronucleados recién formados se identifican y se cuantifican bien mediante tinción seguida de examen visual con microscópico, o bien mediante análisis automatizado. El recuento de suficientes eritrocitos inmaduros en la médula ósea o la sangre periférica de animales adultos se facilita en gran medida mediante la utilización de un programa automatizado de examen. Estos programas son alternativas aceptables a la evaluación manual (2). En estudios comparativos se ha puesto de manifiesto que tales métodos, utilizando los pertinentes patrones de calibración, pueden proporcionar una mayor sensibilidad y reproducibilidad intralaboratorios e interlaboratorios que el examen microscópico manual (3) (4). Entre los sistemas automatizados que permiten medir la frecuencia de eritrocitos micronucleados se incluyen, por ejemplo, los citómetros de flujo (5), los programas de análisis de imágenes (6) (7), y los citómetros de barrido por láser (8).

  Aunque no forme parte normalmente del ensayo, es posible distinguir los fragmentos de cromosomas de los cromosomas enteros aplicando diversos criterios. Entre estos se encuentra la presencia o la ausencia de cinetocoro o de ADN centromérico, que son tanto el uno como el otro característicos de los cromosomas intactos. La ausencia de cinetocoro o de ADN centromérico indica que el micronúcleo solo contiene fragmentos de cromosomas, mientras que su presencia es indicativa de la pérdida de cromosomas.

  En el apéndice 1 se dan las definiciones de la terminología utilizada.

  CONSIDERACIONES INICIALES

  La médula ósea de roedores adultos jóvenes es el tejido diana de las lesiones genéticas en este ensayo, ya que los eritrocitos se producen en este tejido. La medición de los micronúcleos en eritrocitos inmaduros en la sangre periférica es aceptable en otras especies de mamíferos respecto a las cuales se haya demostrado que poseen la sensibilidad adecuada para detectar productos que provocan aberraciones cromosómicas numéricas o estructurales (por inducción de la formación de micronúcleos en eritrocitos inmaduros) y se aporte una justificación científica. La frecuencia de la presencia de eritrocitos inmaduros micronucleados es el principal parámetro. La frecuencia de la presencia de eritrocitos maduros que contienen micronúcleos en la sangre periférica también puede utilizarse como parámetro en especies sin una fuerte selección esplénica contra las células micronucleadas y si los animales han sido tratados de forma continua durante un período superior a la vida de los eritrocitos en la especie utilizada (por ejemplo, 4 semanas o más en el caso del ratón).

  Si hay pruebas de que el producto o productos problema, o sus metabolitos, no llegan al tejido diana, puede no proceder la realización del presente ensayo.

  Antes de la utilización del método de ensayo con una mezcla para obtener datos con fines reglamentarios, debe considerarse si podría proporcionar resultados adecuados a tal fin y, en caso afirmativo, por qué. Tales consideraciones no son necesarias si la reglamentación impone el ensayo de la mezcla.

  PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO

  Se exponen los animales al producto problema por una vía adecuada. Si se utiliza la médula ósea, los animales se sacrifican de forma compasiva, en uno o varios momentos adecuados tras el tratamiento, se extrae la médula ósea, se hacen los frotis y se tiñen (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Si se emplea sangre periférica, esta se extrae en uno o varios momentos adecuados tras el tratamiento, se hacen los frotis y se tiñen (12) (16) (17) (18). Cuando el tratamiento se administra de forma aguda, es importante seleccionar los momentos en que se toman las muestras de médula ósea o de sangre para que en ellos se pueda detectar la inducción de la formación de eritrocitos inmaduros micronucleados relacionada con el tratamiento. En el caso de la toma de sangre periférica, también deberá haber transcurrido tiempo suficiente para que estos eritrocitos aparezcan en la sangre circulante. Se analizan los frotis para detectar la presencia de micronúcleos, por visualización utilizando un microscopio, análisis de imágenes, citometría de flujo, o citometría de barrido por láser.

  VERIFICACIÓN DE LA COMPETENCIA DEL LABORATORIO

  Investigaciones de competencia

  A fin de establecer que posee la suficiente experiencia con la realización del ensayo antes de utilizarlo para hacer ensayos sistemáticos, el laboratorio debe haber demostrado su capacidad de reproducir los resultados previstos a partir de los datos publicados (17) (19) (20) (21) (22) en cuanto a frecuencias de los micronúcleos con un mínimo de dos productos como testigo positivo (incluidas las respuestas débiles inducidas por dosis bajas de los testigos positivos), como las que figuran en el cuadro 1, y con testigos de disolvente/vehículo compatibles (véase el punto 26). Estos experimentos deben utilizar dosis que den aumentos relacionados con la dosis y reproducibles, y demostrar la sensibilidad y el intervalo dinámico del sistema de ensayo en el tejido de interés (médula ósea o sangre periférica), empleando el método de examen utilizado en el laboratorio. Este requisito no es aplicable a los laboratorios que tienen experiencia, esto es, que disponen de una base de datos históricos, según se define en los puntos 14-18.

  Datos sobre testigos históricos

  En el transcurso de las investigaciones de competencia, el laboratorio debe demostrar:

  • - un intervalo y una distribución de los testigos positivos históricos, y
  • - un intervalo y una distribución de los testigos negativos históricos.

  Cuando se obtengan datos por primera vez en relación con la distribución de testigos negativos históricos, los testigos negativos en paralelo deben ser coherentes con los datos publicados de los testigos, si existen. Según se añadan más datos experimentales sobre la distribución de los testigos históricos, los testigos negativos en paralelo deben situarse idealmente dentro de los límites de control del 95 % de dicha distribución. La base de datos históricos del laboratorio de testigos negativos debe ser estadísticamente sólida para garantizar la capacidad del laboratorio de evaluar la distribución de sus datos sobre los testigos negativos. La bibliografía sugiere que puede ser necesario un mínimo de 10 experimentos, pero que sería preferible contar con al menos 20 experimentos realizados en condiciones experimentales comparables. Los laboratorios deben utilizar métodos de control de calidad, como gráficos de control (por ejemplo, gráficos C o gráficos de medias (23)), con el fin de determinar la variabilidad de sus datos y de demostrar que la metodología está «controlada» en su laboratorio. En la bibliografía pueden encontrarse más recomendaciones sobre cómo conseguir y utilizar los datos históricos (es decir, criterios de inclusión y exclusión de datos en los datos históricos y criterios de aceptabilidad para un determinado experimento) (24).

  Si el laboratorio no completa un número suficiente de experimentos para establecer una distribución de los testigos negativos estadísticamente sólida (véase el punto 15) durante las investigaciones de competencia (descritas en el punto 13), es admisible que la distribución se establezca durante los primeros exámenes sistemáticos. Este enfoque debe seguir las recomendaciones recogidas en la bibliografía (24) y los resultados de los testigos negativos obtenidos en estos experimentos deben seguir siendo coherentes con los datos publicados de los testigos negativos.

  Cualquier cambio en el protocolo experimental debe considerarse en función de su impacto en el mantenimiento de la coherencia entre los datos resultantes y la base de datos históricos de testigos existente del laboratorio. Solo si hubiera incoherencias importantes se justificaría el establecimiento de una nueva base de datos históricos de testigos, en caso de que la evaluación por expertos determine que es diferente de la distribución anterior (véase el punto 15). Durante el nuevo establecimiento, puede que no sea necesaria una base de datos completa sobre testigos negativos para poder realizar una prueba real, siempre que el laboratorio pueda demostrar que sus valores de los testigos negativos en paralelo siguen estando en consonancia con su anterior base de datos o con los correspondientes datos publicados.

  Los datos sobre testigos negativos deben consistir en la incidencia de eritrocitos inmaduros con micronúcleos en cada animal. Lo ideal sería que los testigos negativos en paralelo estuvieran dentro de los límites de control del 95 % de la distribución de la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio. Cuando haya datos de los testigos negativos en paralelo que queden fuera de los límites de control del 95 %, su inclusión en la distribución de testigos históricos puede ser aceptable en la medida en que dichos datos no sean valores discrepantes extremos y haya pruebas de que el sistema de ensayo está «controlado» (véase el punto 15) y no haya pruebas de fallos técnicos o humanos.

  DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

  Preparación

  Selección de la especie animal

  Deben usarse animales adultos jóvenes y sanos de cepas utilizadas habitualmente en laboratorio. Pueden utilizarse ratones, ratas, u otras especies adecuadas de mamíferos. Si se emplea sangre periférica, se debe comprobar que la eliminación esplénica de células con micronúcleos de la circulación no compromete la detección de la formación de micronúcleos inducida en la especie seleccionada. Esto se ha comprobado claramente en el caso de la sangre periférica de ratón y rata (2). La justificación científica para la utilización de especies distintas de las ratas y los ratones debe facilitarse en el informe. Si se utilizan especies que no sean de roedores, se recomienda que la medición de los micronúcleos inducidos se integre en otro ensayo adecuado de toxicidad.

  Condiciones de alojamiento y alimentación de los animales

  Con roedores, la temperatura en el animalario debe ser de 22 °C (± 3 °C). Aunque la humedad relativa debe ser idealmente del 50 al 60 %, debe ser como mínimo del 40 % y preferentemente no superar el 70 %, salvo durante la limpieza del local. La iluminación debe ser artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se pueden utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. La elección de la dieta puede verse influida por la necesidad de garantizar una mezcla conveniente del producto problema si se administra por esta vía. Los roedores deben alojarse en grupos pequeños (no más de cinco animales por jaula) del mismo sexo y grupo de tratamiento si no se espera conducta agresiva, preferentemente en jaulas de suelo continuo con un enriquecimiento ambiental adecuado. Los animales podrán alojarse por separado solo si está justificado científicamente.

  Preparación de los animales

  Se utilizan normalmente animales adultos jóvenes y sanos (en el caso de los roedores, idealmente de 6-10 semanas de edad al inicio del tratamiento, aunque también pueden aceptarse animales ligeramente más viejos), y se reparten al azar entre los lotes tratados y los testigos. Los animales se identifican individualmente utilizando un método compasivo y mínimamente invasivo (por ejemplo, mediante anillamiento, marcado, implantación de un microchip o identificación biométrica, pero no grapado a las orejas o los dedos), y se deja que se acostumbren a las condiciones del laboratorio durante al menos cinco días. Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. Debe evitarse la contaminación cruzada por el testigo positivo y el producto problema. La variación del peso de los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder del ± 20 % del peso medio de cada sexo.

  Preparación de las dosis

  Los productos problema sólidos deben disolverse o suspenderse en disolventes o vehículos adecuados, o mezclarse con los alimentos o con el agua de bebida, antes de su administración a los animales. Los productos problema líquidos pueden administrarse directamente o diluirse antes de la administración. En lo que respecta a la exposición por inhalación, los productos problema pueden administrarse en forma de gas, de vapor o de aerosol sólido o líquido, dependiendo de sus propiedades fisicoquímicas. Deben utilizarse preparaciones recientes del producto problema, salvo que se cuente con datos de estabilidad que avalen la posibilidad de su conservación y definan las condiciones adecuadas de esta.

  Condiciones del ensayo

  Disolvente o vehículo

  El disolvente o vehículo no debe producir efectos tóxicos a las dosis empleadas, y no debe tener la posibilidad de reaccionar químicamente con los productos problema. Si se emplean disolventes o vehículos poco conocidos, debe disponerse de información de referencia que avale su compatibilidad. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente o vehículo acuoso. Pueden citarse como ejemplos de disolventes o vehículos compatibles comúnmente utilizados el agua, el suero fisiológico, la solución de metilcelulosa, la solución de sal sódica de carboximetilcelulosa, el aceite de oliva y el aceite de maíz. A falta de información histórica o publicada sobre testigos que demuestre que un disolvente o vehículo elegido atípico no induce la formación de micronúcleos ni ningún otro tipo de efectos nocivos, debe realizarse un estudio inicial a fin de establecer la aceptabilidad del testigo de disolvente o vehículo.

  Testigos

  Testigos positivos

  En principio debe incluirse en cada ensayo un grupo de animales tratados con un producto testigo positivo. Esto puede no aplicarse cuando el laboratorio de ensayo ha demostrado su competencia en la realización del ensayo y ha establecido un intervalo histórico de testigos positivos. Si no se incluye un grupo testigo positivo en paralelo, debe contarse en cada experimento con testigos de examen (portaobjetos fijados y sin teñir o muestras de suspensiones celulares, según el método de examen). Esto puede conseguirse incluyendo en el examen del estudio muestras de referencias adecuadas que se hayan obtenido y conservado a partir de un experimento con testigo positivo aparte realizado periódicamente (por ejemplo, cada 6 o 18 meses); por ejemplo, durante las pruebas de competencia y, a continuación, con carácter periódico, en caso necesario.

  Los productos utilizados como testigo positivo deben provocar con fiabilidad un aumento detectable en la frecuencia de los micronúcleos respecto al nivel espontáneo. Cuando se emplee un examen manual por microscopia, las dosis del testigo positivo deben elegirse de tal forma que los efectos sean claros, pero no revelen inmediatamente al examinador la identidad de las muestras codificadas. El producto empleado como testigo positivo podrá administrarse por una vía distinta de la del producto problema, con otro programa de tratamiento, y el muestreo podrá efectuarse solo en un único momento. Además, podrá considerarse la utilización como testigo positivo de productos de clases químicas afines, cuando sea posible. En el cuadro 1 se incluyen ejemplos de productos válidos como testigo positivo.

  Cuadro 1.

  Ejemplos de productos válidos como testigo positivo

  Productos y CASRN
  Metanosulfonato de etilo [CASRN 62-50-0]
  Metanosulfonato de metilo [CASRN 66-27-3]
  Etil-nitrosourea [CASRN 759-73-9]
  Mitomicina C [CASRN 50-07-7]
  Ciclofosfamida (monohidrato) [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]
  Trietilenomelamina [CASRN 51-18-3]
  Colchicina [CASRN 64-86-8] o vimblastina [CASRN 865-21-4] - como anéugenos

  Testigos negativos

  Deben incluirse animales de un grupo testigo negativo en cada tiempo de muestreo y someterse al mismo proceso que los grupos de tratamiento, salvo que no reciben el tratamiento con el producto problema. Si se utiliza un disolvente o vehículo para la administración del producto problema, el grupo testigo recibirá este disolvente o vehículo. No obstante, si mediante los datos históricos de testigos negativos se demuestra que la variabilidad entre animales y la frecuencia de las células con micronúcleos son coherentes en cada momento de muestreo en el laboratorio de ensayo, puede que solo sea necesario un único muestreo del testigo negativo. En los casos en que se realice un único muestreo de los testigos negativos, debe corresponder al primer momento de muestreo utilizado en el estudio.

  Si se emplea sangre periférica, puede aceptarse una muestra previa al tratamiento en lugar de un testigo negativo en paralelo en los estudios a corto plazo si los resultados son coherentes con la base de datos históricos de testigos del laboratorio de ensayo. Se ha demostrado que en las ratas la toma de pequeñas muestras previas al tratamiento (por ejemplo, de menos de 100 μl/día) tiene un impacto mínimo sobre la frecuencia espontánea de micronúcleos (25).

  PROCEDIMIENTO

  Número y sexo de los animales

  En general, la respuesta de micronúcleos es similar entre machos y hembras y, por lo tanto, la mayor parte de los estudios podría realizarse con cualquier sexo (26). Unos datos que demostraran la existencia de diferencias pertinentes entre machos y hembras (como diferencias de toxicidad sistémica, metabolismo, biodisponibilidad, toxicidad para la médula ósea, etc., por ejemplo en un estudio de determinación del intervalo) favorecerían la utilización de ambos sexos. En este caso puede ser conveniente realizar un estudio con ambos sexos, por ejemplo como parte de un estudio de toxicidad por administración continuada. Podría ser adecuado utilizar el diseño factorial en caso de que se utilizaran animales de ambos sexos. En el apéndice 2 se recogen detalles sobre cómo analizar los datos utilizando dicho diseño.

  El tamaño de los grupos al principio del estudio debe establecerse de manera que comprendan un mínimo de 5 animales analizables de un mismo sexo, o de cada sexo si se utilizan ambos, por grupo. En caso de que la exposición humana a los productos pueda ser específica de un sexo, como sucede con algunos productos farmacéuticos, el ensayo debe realizarse con animales del sexo correspondiente. Como orientación sobre las necesidades máximas típicas de animales, un estudio de la médula ósea realizado de acuerdo con los parámetros establecidos en el punto 37 con tres grupos tratados y testigos negativo y positivo en paralelo (cada grupo compuesto por cinco animales de un solo sexo), requeriría entre 25 y 35 animales.

  Dosis

  Si se lleva a cabo un estudio previo de determinación del intervalo porque no se dispone aún de datos adecuados para ayudar en la selección de las dosis, ha de hacerse en el mismo laboratorio, con la misma especie, cepa, sexo y protocolo de tratamiento que se vayan a utilizar en el estudio principal (27). El estudio debe tratar de determinar la dosis máxima tolerada (DMT), es decir, la dosis más alta que se tolera sin signos de toxicidad que limite el estudio, en relación con la duración del período de estudio (por ejemplo, reducción del peso corporal o citotoxicidad para el sistema hematopoyético pero sin llegar a la muerte ni presentar signos de dolor, sufrimiento o angustia que requieran el sacrificio compasivo (28)).

  La dosis más alta también puede definirse como la dosis que produce toxicidad en la médula ósea (por ejemplo, una reducción de la proporción de eritrocitos inmaduros respecto al total de eritrocitos en la médula ósea o en la sangre periférica superior al 50 %, pero hasta no menos del 20 % del valor del testigo). No obstante, al analizar las células positivas para el CD71 en la circulación sanguínea periférica (es decir, mediante citometría de flujo), esta fracción muy joven de eritrocitos inmaduros responde a los estímulos tóxicos más rápidamente que la cohorte positiva para el ARN de eritrocitos inmaduros, que es más grande. Por lo tanto, puede ponerse de manifiesto una mayor toxicidad aparente con diseños de exposición aguda que examinen la fracción de eritrocitos inmaduros positivos para el CD71 respecto a los que identifican eritrocitos inmaduros sobre la base del contenido de ARN. Por esta razón, cuando en los experimentos se utilizan cinco o menos días de tratamiento, la dosis más alta de los productos problema que causa toxicidad puede definirse como la dosis que produce una reducción estadísticamente significativa de la fracción de eritrocitos inmaduros positivos para el CD71 respecto al total de eritrocitos, pero hasta no menos del 5 % del valor del testigo (29).

  Los productos que presentan saturación de las propiedades toxicocinéticas, o inducen procesos de destoxificación que puedan dar lugar a una disminución de la exposición después de una administración a largo plazo pueden constituir excepciones en cuanto a los criterios de establecimiento de la dosis y han de evaluarse caso por caso.

  A fin de obtener información sobre la relación dosis-respuesta, los estudios completos deben incluir un grupo testigo negativo y un mínimo de tres dosis separadas por un factor que será en general de 2 y nunca superior a 4. Si el producto problema no produce toxicidad en el estudio de determinación del intervalo o según los datos existentes, la dosis más alta con un período de administración de 14 días o más debe ser de 1 000 mg/kg de peso corporal/día o, en caso de administración durante un período inferior a 14 días, de 2 000 mg/kg de peso corporal/día. No obstante, si el producto problema provoca toxicidad, la DMT debe ser la mayor dosis administrada y las dosis deben abarcar preferentemente el intervalo desde la dosis máxima hasta una dosis que provoque toxicidad escasa o nula. Si se observa toxicidad para el tejido diana (médula ósea) a todas las dosis utilizadas en el ensayo, se recomienda hacer otro estudio a dosis no tóxicas. Unos estudios destinados a caracterizar de forma más completa la relación cuantitativa dosis-respuesta pueden necesitar más grupos de dosis. Estos límites pueden variar con determinados tipos de productos problema (por ejemplo, productos farmacéuticos de uso humano) a los que se apliquen requisitos específicos.

  Ensayo límite

  Si los experimentos de determinación del intervalo, o los datos disponibles sobre cepas animales afines, indican que un régimen de tratamiento de, como mínimo, la dosis límite (véase más adelante) no produce efectos tóxicos observables (entre los que se incluirían la depresión de la proliferación de la médula ósea u otros signos de citotoxicidad para el tejido diana) y si, basándose en estudios de genotoxicidad in vitro o en datos de productos estructuralmente afines, no cabe esperar genotoxicidad, entonces puede no considerarse necesario realizar un estudio completo con tres dosis, siempre que se haya demostrado que el producto o productos problema alcanzan el tejido diana (médula ósea). En tales casos, podrá ser suficiente una sola dosis, al nivel de la dosis límite. Cuando la administración tiene lugar durante un período de 14 días o más, la dosis límite será de 1 000 mg/kg de peso corporal/día. Si el período de administración es inferior a 14 días, la dosis límite será de 2 000 mg/kg de peso corporal/día.

  Administración de las dosis

  A la hora de diseñar el ensayo, debe tenerse en cuenta la vía prevista de exposición humana. Por lo tanto, en casos justificados podrán elegirse vías de exposición como los alimentos, el agua de bebida, la tópica, la subcutánea, la intravenosa, la oral forzada (por sonda), la inhalación, la intratraqueal o la implantación. En cualquier caso, la vía debe elegirse de forma que se garantice una exposición adecuada del tejido o tejidos diana. En general no se recomienda la inyección intraperitoneal, ya que no es una vía de exposición humana prevista, y debe utilizarse solo en casos que tengan justificación científica específica. Si el producto problema se mezcla con los alimentos o el agua de bebida, en particular en caso de administración única, debe procurarse que el plazo entre el consumo de los alimentos o el agua y el muestreo sea suficiente para permitir la detección de los efectos (véase el punto 37). El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez por sonda o por inyección depende del tamaño del animal utilizado. Dicho volumen no debe en principio superar 1 ml/100 g de peso corporal, salvo en el caso de las soluciones acuosas, en que puede llegarse a un máximo de 2 ml/100 g. El uso de volúmenes superiores deberá justificarse. Excepto en el caso de productos problema irritantes o corrosivos, que por lo general producen efectos exacerbados a concentraciones superiores, la variabilidad del volumen de ensayo debe reducirse al mínimo ajustando la concentración para conseguir la administración de un volumen constante en relación con el peso corporal a todas las dosis.

  Pauta de tratamiento

  De preferencia, se efectúan 2 o más tratamientos a intervalos de 24 horas, especialmente cuando se integra este ensayo en otros estudios de toxicidad. También es posible administrar tratamientos únicos cuando esté científicamente justificado (por ejemplo, productos problema conocidos por bloquear el ciclo celular). Los productos problema también pueden administrarse en dosis divididas (es decir, en dos o más tratamientos el mismo día separados por no más de 2 o 3 horas) con el fin de facilitar la administración de grandes volúmenes. En estas circunstancias, o cuando se administra el producto problema por inhalación, el tiempo de muestreo debe programarse basándose en el momento de la última administración o el final de la exposición.

  El ensayo puede realizarse con ratas o ratones de tres maneras:

  • a. Se administra a los animales, en una sola vez, el producto problema. Las muestras de médula ósea se toman al menos en dos ocasiones (de grupos independientes de animales), no antes de 24 horas tras el tratamiento y sin sobrepasar las 48 horas desde el tratamiento, con intervalos adecuados entre las tomas de muestra, a menos que se sepa que el producto problema tiene una semivida excepcionalmente larga. Si se extraen muestras antes de que transcurran 24 horas desde el tratamiento, deberá justificarse. Las muestras de sangre periférica han de tomarse al menos en dos ocasiones (del mismo grupo de animales), la primera de ellas cuando haya transcurrido un mínimo de 36 horas desde el tratamiento, a intervalos adecuados tras la primera toma, y sin sobrepasar las 72 horas. En el primer momento de muestreo, se tratan todos los grupos de dosis y se toman muestras de todos ellos para su análisis; no obstante, en los momentos de muestreo posteriores, solo es necesario administrar la dosis más alta. Cuando se detecte una respuesta positiva en un momento de muestreo, no será preciso tomar más muestras, a menos que se necesite información cuantitativa dosis-respuesta. Los momentos descritos de toma de muestras son consecuencia de la cinética de aparición y desaparición de los micronúcleos en estos dos compartimentos tisulares.
  • b. Si se efectúan dos o más administraciones diarias (por ejemplo, dos administraciones a intervalos de 24 horas), han de tomarse muestras en una sola ocasión, transcurridas de 18 a 24 horas desde la última administración si se trata de médula ósea, y de 36 a 48 horas desde la última administración en el caso de la sangre periférica (30). Los momentos descritos de toma de muestras son consecuencia de la cinética de aparición y desaparición de los micronúcleos en estos dos compartimentos tisulares.
  • c. En caso de que se utilicen tres o más tratamientos diarios (por ejemplo, tres o más administraciones a intervalos de 24 horas, aproximadamente), se recogerán muestras de médula ósea a más tardar 24 horas después del último tratamiento, y las muestras de sangre periférica se tomarán antes de que hayan pasado 40 horas después del último tratamiento (31). Esta opción de tratamiento acomoda la combinación del ensayo de cometa (por ejemplo, muestreo 2-6 horas después del último tratamiento) con el ensayo de micronúcleos, y la integración del ensayo de micronúcleos con estudios de toxicidad por administración continuada. Los datos acumulados sugieren que la inducción de la formación de micronúcleos puede observarse a lo largo de estos períodos más amplios cuando se han efectuado tres o más administraciones (15).

  Pueden aplicarse otros regímenes de muestreo o de tratamiento cuando sea pertinente y esté científicamente justificado, y para facilitar la integración con otros ensayos de toxicidad.

  Observaciones

  Deben hacerse observaciones clínicas generales de los animales de ensayo y registrarse los signos clínicos al menos una vez al día, preferentemente a la misma hora u horas cada día y teniendo en cuenta el período de mayor intensidad de los efectos previstos tras la administración. Al menos dos veces al día durante el periodo de administración, se debe observar la posible morbilidad y mortalidad de todos los animales. Deben pesarse todos los animales al principio del estudio, al menos una vez por semana durante los estudios de administración continuada, y en el momento del sacrificio. En los estudios de al menos una semana de duración, el consumo de alimentos debe medirse al menos semanalmente. Si el producto problema se administra con el agua de bebida, debe medirse el consumo de agua cada vez que se cambie el agua y al menos una vez por semana. Los animales que presenten signos de toxicidad excesiva pero no letal deben sacrificarse de forma compasiva antes de que termine el período del ensayo (28). En determinadas circunstancias, podría comprobarse la temperatura corporal de los animales, dado que la hipotermia y la hipertermia inducidas por el tratamiento se han relacionado con la producción de falsos resultados (32) (33) (34).

  Exposición del tejido diana

  Debe tomarse una muestra de sangre en el momento o momentos adecuados para permitir la investigación de los niveles plasmáticos de los productos problema, a fin de demostrar que ha habido exposición de la médula ósea, cuando esté justificado y cuando no se disponga de otros datos de exposición (véase el punto 48).

  Preparación de la médula ósea o de la sangre periférica

  Por lo general, las células de la médula ósea se extraen del fémur o de la tibia de los animales inmediatamente después de su sacrificio compasivo. Las células suelen tomarse, prepararse y teñirse según métodos establecidos. Pueden obtenerse pequeñas cantidades de sangre periférica, conforme a las normas de bienestar animal adecuadas, bien mediante un método que permita la supervivencia del animal, como el sangrado de la vena caudal o de otro vaso sanguíneo adecuado, o bien por punción cardiaca o extracción de un gran vaso en la eutanasia del animal. Tanto en el caso de eritrocitos tomados de la médula ósea como en el de los procedentes de la sangre periférica, dependiendo del método de análisis, las células pueden someterse inmediatamente a una tinción supravital (16) (17) (18), a la preparación de frotis y luego a tinción para microscopia, o a la fijación y tinción de manera adecuada para análisis por citometría de flujo. Si se emplea un colorante específico del ADN [p. ej., naranja de acridina (35) o Hoechst 33258 más pironina-Y (36)] pueden evitarse algunos de los artefactos que aparecen cuando se utiliza un colorante que no es específico del ADN. Esta ventaja no excluye el uso de tinciones convencionales (por ejemplo, Giemsa para el análisis microscópico). También pueden utilizarse otros sistemas [por ejemplo, columnas de celulosa para eliminar las células nucleadas (37) (38)], siempre que se tenga constancia de que son compatibles con la preparación de las muestras en el laboratorio.

  Si estos métodos son aplicables, pueden utilizarse anticuerpos anti-cinetocoros (39), la técnica FISH con sondas pancentroméricas de ADN (40), o el etiquetado in situ cebado con cebadores pancentroméricos específicos, junto con una tinción de contraste adecuada del ADN (41), para determinar la naturaleza de los micronúcleos (cromosoma/fragmento cromosómico) a fin de determinar si el mecanismo de inducción de la formación de micronúcleos se debe a actividad clastogénica o aneugénica. Pueden utilizarse otros métodos para diferenciar entre clastógenos y anéugenos, siempre que se haya comprobado que son efectivos.

  Análisis (manual y automatizado)

  Todos los portaobjetos o muestras para el análisis, incluidos los de los testigos positivos y negativos, deben codificarse independientemente antes de cualquier tipo de análisis y aleatorizarse de forma que el examinador manual no tenga conocimiento de cómo se han tratado; esta codificación no es necesaria cuando se utilizan sistemas de examen automatizados que no dependen de la inspección visual y no pueden verse afectados por el sesgo del operador. Para cada animal, se determina la relación entre los eritrocitos inmaduros y el total de eritrocitos (inmaduros + maduros) en un recuento de al menos 500 eritrocitos si se trata de médula ósea y de 2 000 si se trata de sangre periférica (42). Se debe determinar la incidencia de eritrocitos inmaduros micronucleados en un mínimo de 4 000 eritrocitos inmaduros por animal (43). En caso de que la base de datos históricos de testigos negativos indique que la frecuencia media de eritrocitos inmaduros con micronúcleos de fondo es < 0,1 % en el laboratorio de ensayo, debe considerarse el examen de células adicionales. A la hora de analizar las muestras, la proporción de eritrocitos inmaduros respecto al total de eritrocitos en los animales tratados no debe ser inferior al 20 % de la proporción del testigo del vehículo/disolvente cuando se examinan por microscopia, ni al 5 % aproximadamente de la proporción del testigo del vehículo/disolvente cuando se examinan eritrocitos inmaduros positivos para el CD71 por métodos de citometría (véase el punto 31) (29). Por ejemplo, para un ensayo de médula ósea con examen por microscopia, si la proporción de eritrocitos inmaduros en la médula ósea respecto al testigo es del 50 %, el límite superior de toxicidad sería un 10 % de eritrocitos inmaduros.

  Debido a que el bazo de la rata secuestra y destruye los eritrocitos micronucleados, para mantener una elevada sensibilidad del ensayo cuando se analiza sangre periférica de rata, es preferible limitar el análisis de eritrocitos inmaduros micronucleados a la fracción más joven. Cuando se utilicen métodos de análisis automatizados, estos eritrocitos más inmaduros podrán identificarse sobre la base de su alto contenido de ARN, o del alto nivel de receptores de transferrina (positivos para el CD71) expresados en su superficie (31). No obstante, la comparación directa de diferentes métodos de tinción ha demostrado que se pueden obtener resultados satisfactorios con diversos métodos, incluyendo la tinción convencional con naranja de acridina (3) (4).

  DATOS E INFORME

  Tratamiento de los resultados

  Los datos relativos a cada animal se presentarán en forma de cuadro. Con cada animal analizado por separado se relacionará el número de eritrocitos inmaduros examinados, el de eritrocitos inmaduros micronucleados y la proporción de eritrocitos inmaduros respecto al total de eritrocitos. Cuando se tratan ratones de forma continua durante 4 semanas o más, también deben darse los datos sobre el número y la proporción de eritrocitos maduros micronucleados, si se han tomado. Deben también consignarse los datos sobre toxicidad y signos clínicos de los animales.

  Criterios de aceptabilidad

  Los siguientes criterios determinan la aceptabilidad del ensayo:

  • a. Los datos del testigo negativo en paralelo se consideran aceptables para añadirse a la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio (véanse los puntos 15-18).
  • b. Los testigos positivos en paralelo o los testigos de examen deben inducir respuestas compatibles con las obtenidas en la base de datos de testigos positivos históricos y producir un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo (véanse los puntos 24-25).
  • c. Se ha analizado el número adecuado de dosis y células.
  • d. Los criterios de selección de la concentración más alta son coherentes con los descritos en los puntos 30-33.

  Evaluación e interpretación de los resultados

  Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente positivo si también se cumple lo siguiente:

  • a. Al menos uno de los grupos de tratamiento presenta un aumento estadísticamente significativo de la frecuencia de eritrocitos inmaduros micronucleados en comparación con el testigo negativo en paralelo,
  • b. Este aumento está relacionado con la dosis al menos en uno de los momentos de muestreo cuando se evalúan con una prueba de tendencia adecuada, y
  • c. Alguno de estos resultados está fuera de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límites de control del 95 % según la distribución de Poisson).

  Si se examina únicamente la dosis más alta en un momento particular de muestreo, el producto problema se considera claramente positivo si se ve un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo y los resultados están fuera de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límites de control del 95 % según la distribución de Poisson). En la bibliografía se encuentran recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (44) (45) (46) (47). Al realizar un análisis de la relación dosis-respuesta, deben someterse al mismo por lo menos tres grupos tratados con dosis diferentes del producto problema. Las pruebas estadísticas deben utilizar como unidad experimental el animal. Un resultado positivo en el ensayo de micronúcleos indica que el producto problema induce la formación de micronúcleos, que son consecuencia de una lesión de los cromosomas o del aparato mitótico de los eritroblastos de la especie estudiada. En caso de que se haya realizado un ensayo para detectar la presencia de centrómeros en los micronúcleos, si el producto produce micronúcleos con centrómeros (ADN centromérico o cinetocoro, que indica la pérdida de cromosomas enteros), queda demostrado que este producto problema es un anéugeno.

  Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente negativo si, en todas las condiciones experimentales examinadas, también se cumple lo siguiente:

  • a. Ninguno de los grupos de tratamiento presenta un aumento estadísticamente significativo de la frecuencia de eritrocitos inmaduros micronucleados en comparación con el testigo negativo en paralelo,
  • b. No hay ningún aumento relacionado con la concentración en ningún momento de muestreo cuando se evalúa con una prueba de tendencia adecuada,
  • c. Todos los resultados están dentro de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límites de control del 95 % según la distribución de Poisson), y
  • d. Ha habido exposición de la médula ósea al producto problema.

  En la bibliografía se encuentran recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (44) (45) (46) (47). Como pruebas de la exposición de la médula ósea a un producto problema pueden citarse la reducción de la proporción de eritrocitos inmaduros y maduros o la medición de los niveles hemáticos o plasmáticos del producto problema. En caso de administración por vía intravenosa, no hacen falta pruebas de la exposición. Alternativamente, para demostrar la exposición de la médula ósea es posible utilizar los datos de ADME obtenidos en un estudio independiente utilizando la misma vía y la misma especie. Un resultado negativo indica que, en las condiciones del ensayo, el producto problema no induce la formación de micronúdeos en los eritrocitos inmaduros de la especie estudiada.

  No se requiere ninguna verificación de una respuesta positiva clara o negativa clara.

  En los casos en que la respuesta no sea claramente negativa ni positiva y con el fin de ayudar a determinar la importancia biológica de un resultado (por ejemplo, un incremento límite o débil), los datos deben ser evaluados por expertos o hay que completar otras investigaciones de los experimentos existentes. En algunos casos, puede ser de utilidad el análisis de más células o la repetición de un experimento en condiciones experimentales modificadas.

  En casos excepcionales, incluso después de otras investigaciones, los datos no permiten concluir si el producto problema produce resultados positivos o negativos, y el estudio deberá considerarse, por tanto, como de resultado dudoso.

  Informe del ensayo

  El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

  Resumen

  Producto problema:

  • - origen, número de lote, fecha límite de utilización, si se dispone de ellos;
  • - estabilidad del producto problema, si se conoce.

  Sustancia con un solo componente:

  • - aspecto físico, hidrosolubilidad, y propiedades fisicoquímicas pertinentes adicionales;
  • - identificación química, como nombre IUPAC o CAS, número CAS, código SMILES o InChI, fórmula estructural, pureza, identidad química de las impurezas según convenga y sea factible en la práctica, etc.

  Sustancias de componentes múltiples, sustancias UVCB y mezclas:

  • - en la medida de lo posible, caracterizadas por la identidad química (véase más arriba), presencia cuantitativa y propiedades fisicoquímicas pertinentes de los componentes.

  Preparación del producto problema:

  • - justificación de la elección del vehículo;
  • - solubilidad y estabilidad del producto problema en el disolvente o vehículo, si se conocen;
  • - preparación de formulaciones para la administración con los alimentos, con el agua de bebida o por inhalación;
  • - determinaciones analíticas de las formulaciones (por ejemplo, estabilidad, homogeneidad, concentraciones nominales), si se han llevado a cabo.

  Animales de ensayo:

  • - especie y cepa utilizadas y justificación de su utilización;
  • - número, edad y sexo de los animales;
  • - origen, condiciones del alojamiento, alimentación, etc.;
  • - método para la identificación individual de los animales;
  • - para los estudios de corta duración: peso individual de los animales al inicio y al final del ensayo; para los estudios de más de una semana: pesos corporales individuales durante el estudio y consumo de alimentos; deben incluirse el intervalo, la media y la desviación típica de los pesos corporales de cada grupo.

  Condiciones del ensayo:

  • - datos de los testigos positivos y negativos (vehículo o disolvente);
  • - datos del estudio de determinación del intervalo, si se ha llevado a cabo;
  • - justificación de la selección de las dosis;
  • - datos de la formulación del producto problema;
  • - datos sobre la administración del producto problema;
  • - fundamento de la elección de la vía de administración y de la duración de esta;
  • - métodos para verificar que el producto o productos problema han llegado a la circulación general o al tejido diana;
  • - dosis reales (mg/kg peso corporal/día) calculadas a partir del consumo y de la concentración (ppm) del producto problema en los alimentos o en el agua de bebida, en su caso;
  • - datos sobre la calidad de los alimentos y del agua;
  • - método de sacrificio compasivo;
  • - método de analgesia (en su caso);
  • - descripción detallada de las pautas de tratamiento y muestreo y justificación de las decisiones;
  • - métodos de preparación de los portaobjetos;
  • - procedimientos de aislamiento y conservación de las muestras;
  • - métodos de determinación de la toxicidad;
  • - criterios de examen de los eritrocitos inmaduros micronucleados;
  • - número de células analizadas por animal para determinar la frecuencia de eritrocitos inmaduros micronucleados y para determinar la proporción de eritrocitos inmaduros y maduros;
  • - criterios de aceptabilidad del estudio;
  • - métodos, tales como la utilización de anticuerpos anti-cinetocoro o de sondas de ADN centroméricas específicas, para caracterizar si los micronúcleos contienen cromosomas completos o fragmentados, en su caso.

  Resultados:

  • - estado de los animales antes y a lo largo del ensayo, incluidos los signos de toxicidad;
  • - proporción de eritrocitos inmaduros respecto al total de eritrocitos;
  • - número de eritrocitos inmaduros micronucleados, indicado en cada animal por separado;
  • - media ± desviación típica de eritrocitos inmaduros micronucleados de cada grupo;
  • - relación dosis-respuesta, cuando sea posible;
  • - análisis estadísticos y métodos aplicados,
  • - datos de los testigos negativos y positivos estudiados en paralelo, con intervalos, medias y desviaciones típicas;
  • - datos históricos de los testigos negativos y positivos, con intervalos, medias y desviaciones típicas y límites de control del 95 % para la distribución, así como el período de tiempo comprendido y el número de puntos de datos;
  • - datos justificativos de que se ha producido la exposición de la médula ósea;
  • - datos de caracterización que indiquen si los micronúcleos contienen cromosomas completos o fragmentados, en su caso;
  • - criterios de respuesta positiva o negativa que se cumplen.

  Discusión de los resultados

  Conclusión

  Referencias

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  Apéndice 1 DEFINICIONES

  Centrómero : Región o regiones del cromosoma con las que se asocian las fibras del huso acromático durante la división celular para permitir el movimiento ordenado de los cromosomas hijos hacia los polos de las células hijas.

  Producto : Sustancia o mezcla.

  Eritroblasto : Fase temprana de desarrollo de los eritrocitos, que precede inmediatamente a la de eritrocitos inmaduros, cuando la célula aún tiene núcleo.

  Cinetocoro : Estructura proteínica que se forma en el centrómero de las células eucarióticas, que vincula el cromosoma a los polímeros del microtúbulo del huso mitótico durante la mitosis y la meiosis y sirve para separar las cromátidas hermanas durante la división celular.

  Micronúcleos : Núcleos pequeños, adicionales a los núcleos celulares principales y separados de ellos, y producidos durante la telofase de la mitosis (o la meiosis) por fragmentos cromosómicos o cromosomas enteros retardados.

  Eritrocito normocromático o maduro : Eritrocito completamente madurado que ha perdido el ARN residual que queda tras la desnucleación o ha perdido otros marcadores celulares de vida corta que desaparecen típicamente tras la desnucleación que tiene lugar después de la división final del eritroblasto.

  Eritrocito policromático o inmaduro : Eritrocito recién formado en una fase intermedia de desarrollo, que se tiñe con los componentes tanto de color azul como de color rojo de las tinciones clásicas de sangre, como la de Wright-Giemsa, debido a la presencia de ARN residual en las células recién formadas. Estas células recién formadas son aproximadamente lo mismo que los reticulocitos, los cuales se visualizan utilizando una tinción vital que hace que el ARN residual se aglutine en un retículo. Para identificar los glóbulos rojos recién formados se suelen utilizar ahora otros métodos, como la tinción monocromática de ARN con colorantes fluorescentes o el etiquetado de marcadores de superficie de vida corta como el CD71 con anticuerpos fluorescentes. Los eritrocitos policromáticos, los reticulocitos y los eritrocitos positivos para el CD71 son todos eritrocitos inmaduros, aunque cada uno de ellos tiene una distribución por edades algo diferente.

  Reticulocito : Eritrocito recién formado teñido con una tinción vital que hace que el ARN celular residual se aglutine en un retículo característico. Los reticulocitos y los eritrocitos policromáticos tienen una distribución similar por edades celulares.

  Producto problema : Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

  Apéndice 2 DISEÑO FACTORIAL PARA IDENTIFICAR LAS DIFERENCIAS DE SEXO EN EL ENSAYO DE MICRONÚCLEOS IN VIVO

  Diseño factorial y su análisis

  En este diseño, un mínimo de 5 machos y 5 hembras se someten a ensayo a cada concentración, lo que resulta en la utilización de un mínimo de 40 animales (20 machos y 20 hembras, más los testigos positivos pertinentes).

  Este diseño, que es uno de los diseños factoriales más simples, es equivalente a un análisis de varianza de dos factores, con el sexo y el nivel de concentración como efectos principales. Los datos pueden analizarse con numerosos paquetes de software estadístico estándar tales como SPSS, SAS, STATA, Genstat, así como utilizando R.

  El análisis divide la variabilidad de la serie de datos en la variabilidad entre sexos, la variabilidad entre las concentraciones y la relativa a la interacción entre los sexos y las concentraciones. Cada uno de los términos se somete a prueba frente a una estimación de la variabilidad entre los animales replicados dentro de los grupos de animales del mismo sexo que han recibido la misma concentración. Todos los detalles de la metodología subyacente se encuentran en muchos manuales estadísticos conocidos (véanse las referencias) y en las funciones de “ayuda” de los paquetes estadísticos.

  El análisis se lleva a cabo inspeccionando el término de la interacción sexo x concentración en el cuadro de ANOVA (9) A falta de un término de interacción significativo, los valores combinados de distintos sexos o niveles de concentración ofrecen pruebas estadísticas válidas entre los niveles, sobre la base del término de ANOVA de variabilidad intragrupo puesta en común.

  El análisis continúa dividiendo la estimación de la variabilidad entre concentraciones en contrastes que permiten una prueba de contrastes lineales y cuadráticos de las respuestas a través de los niveles de concentración. Cuando existe un término de interacción significativa sexo x concentración, este término también puede dividirse en contrastes de interacción lineal x sexo y cuadrático x sexo. Estos términos permiten pruebas de si las respuestas a la concentración son paralelas en los dos sexos, o si existe una diferencia en la respuesta entre estos.

  La estimación de la variabilidad intragrupo puesta en común se puede utilizar para proporcionar pruebas pareadas de la diferencia entre medias. Estas comparaciones podrían realizarse entre las medias para los dos sexos y entre las medias para los diferentes niveles de concentración, así como para las comparaciones con los niveles de los testigos negativos. En los casos en los que existe una interacción significativa pueden hacerse comparaciones entre las medias de concentraciones diferentes dentro de un sexo o entre las medias de los sexos a la misma concentración.

  Bibliografía

  Hay muchos manuales estadísticos que debaten la teoría, el diseño, la metodología, el análisis y la interpretación de los diseños factoriales que van desde los análisis bifactoriales más sencillos hasta las formas más complejas utilizadas en la metodología de “diseño de experimentos”. La lista que sigue no es exhaustiva. Algunos libros proporcionan ejemplos resueltos de diseños comparables, en algunos casos con el código para aplicar los análisis utilizando diversos paquetes de software.

  Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

  Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

  Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

  Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

  Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

  Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

  Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.»

• 6) En la parte B, se suprime el capítulo B.15.
• 7) En la parte B, se suprime el capítulo B.16.
• 8) En la parte B, se suprime el capítulo B.18.
• 9) En la parte B, se suprime el capítulo B.19.
• 10) En la parte B, se suprime el capítulo B.20.
• 11) En la parte B, se suprime el capítulo B.24.
• 12) En la parte B, el capítulo B.47 se sustituye por el texto siguiente:

  « B.47
  
  Método de ensayo de la opacidad y permeabilidad de la córnea de bovino para identificar: i) productos que provocan lesiones oculares graves y ii) productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves

  INTRODUCCIÓN

  El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo (TG) 437 de la OCDE (2013). El método de ensayo de la opacidad y permeabilidad de la córnea de bovino (conocido por la siglas de su nombre en inglés, BCOP), fue evaluado por el Comité de Coordinación Interagencias sobre la Validación de Métodos Alternativos estadounidense (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM), junto con el Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) y el Centro Japonés para la Validación de Métodos Alternativos (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM), en 2006 y 2010 (1)(2). En la primera evaluación, el método de ensayo BCOP se evaluó en cuanto a su utilidad para identificar productos (sustancias y mezclas) que provocan lesiones oculares graves (1). En la segunda evaluación, el método de ensayo BCOP se evaluó en cuanto a su utilidad para identificar productos (sustancias y mezclas) que no están clasificados por irritación ocular ni por lesiones oculares graves (2). La base de datos de validación del método BCOP incluía 113 sustancias y 100 mezclas en total (2)(3). De estas evaluaciones y de su revisión por pares se dedujo que el método de ensayo permite identificar correctamente los productos (tanto sustancias como mezclas) que provocan lesiones oculares graves (categoría 1), así como los que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves, según se definen en el Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos (SGA) de las Naciones Unidas (4) y en el Reglamento (CE) n.º 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas (CLP) (10) , por lo que el método se considera científicamente válido para ambos objetivos. Una lesión ocular grave es un daño tisular en el ojo o un deterioro físico importante de la visión, como consecuencia de la aplicación de un producto problema en la superficie anterior del ojo, que no es completamente reversible en los 21 días siguientes a la aplicación. Los productos problema que provocan lesiones oculares graves se clasifican en la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas. Los productos no clasificados por irritación ocular o lesiones oculares graves se definen como aquellos que no cumplen los requisitos para la clasificación en las categorías 1 o 2 (2A o 2B), es decir, se mencionan como «sin categoría» del SGA de las Naciones Unidas. El presente método de ensayo incluye el uso recomendado y las limitaciones del método de ensayo BCOP a partir de sus evaluaciones. Las principales diferencias entre la versión inicial de 2009 y la versión actualizada de 2013 de las líneas directrices de la OCDE se refieren, entre otros, a los siguientes elementos: el uso del método de ensayo BCOP para identificar productos que no requieren clasificación según el SGA de las Naciones Unidas (puntos 2 y 7); aclaraciones sobre la aplicabilidad del método de ensayo BCOP a los ensayos de alcoholes, cetonas y sólidos (puntos 6 y 7) y de sustancias y mezclas (punto 8); aclaraciones sobre cómo deben someterse a ensayo las sustancias tensioactivas y las mezclas que contienen tensioactivos (punto 28); actualizaciones y aclaraciones sobre los testigos positivos (puntos 39 y 40); una actualización de los criterios de decisión del método de ensayo BCOP (punto 48); una actualización de los criterios de aceptación del estudio (punto 49); una actualización de los elementos del informe del ensayo (punto 50); una actualización del apéndice 1, sobre las definiciones; la adición del apéndice 2 sobre la capacidad de predicción del método de ensayo BCOP en diferentes sistemas de clasificación; una actualización del apéndice 3 sobre la lista de productos utilizados para demostrar la aptitud; y una actualización del apéndice 4 sobre el soporte de córnea para el método BCOP (punto 1) y sobre el opacímetro (puntos 2 y 3).

  Actualmente se reconoce en general que, en un futuro próximo, ningún ensayo de irritación ocular in vitro podrá sustituir por sí solo al ensayo ocular de Draize in vivo para predecir toda la gama de irritación causada por las distintas categorías de productos. Sin embargo, unas combinaciones estratégicas de varios métodos de ensayo alternativos dentro de una estrategia de ensayos (escalonados) sí podrán sustituir al ensayo ocular de Draize (5). El enfoque descendente (5) está diseñado para utilizarse cuando, sobre la base de la información existente, se espera de un producto que tenga una alta capacidad de irritación, mientras que el enfoque ascendente (5) está diseñado para utilizarse cuando, sobre la base de la información existente, se espera de un producto que no cause irritación ocular suficiente para exigir una clasificación. El método de ensayo BCOP es un procedimiento in vitro que puede utilizarse, en determinadas circunstancias y con limitaciones específicas con fines de clasificación de peligros para los ojos y de etiquetado de productos. Si bien no se considera válido para sustituir por sí solo al ensayo in vivo con ojo de conejo, el método de ensayo BCOP se recomienda como fase inicial en una estrategia de ensayo tal como el enfoque descendente sugerido por Scott et al. (5) para identificar los productos que provocan lesiones oculares graves, es decir, los productos que han de clasificarse en la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas, sin necesidad de hacer más pruebas (4). El método de ensayo BCOP se recomienda también para identificar productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves, según se definen en el SGA de las Naciones Unidas (sin categoría del SGA de las Naciones Unidas) (4) dentro de una estrategia de ensayos como el enfoque ascendente (5). No obstante, un producto del que no se espere que cause lesiones oculares graves o que no esté clasificado por irritación ocular o lesiones oculares graves según el método de ensayo BCOP tendría que someterse a ensayos adicionales (in vitro o in vivo) para establecer una clasificación definitiva.

  El objetivo del presente método de ensayo es describir los procedimientos utilizados para evaluar el posible peligro para los ojos de un producto problema en función de su capacidad para inducir opacidad y aumento de la permeabilidad en una córnea aislada de bovino. Los efectos tóxicos para la córnea se miden mediante: i) el descenso de la transmisión luminosa (opacidad), y ii) el aumento del paso del pigmento fluoresceína sódica (permeabilidad). Los resultados de la evaluación de la opacidad y de la permeabilidad de la córnea tras su exposición al producto problema se combinan para obtener una puntuación de la capacidad de irritación in vitro (conocida por sus siglas en inglés, IVIS), que se utiliza para clasificar el nivel de capacidad de irritación del producto problema.

  En el apéndice 1 se dan las definiciones pertinentes.

  CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES

  El presente método de ensayo se basa en el protocolo del método de ensayo BCOP del ICCVAM (5) (7), que fue elaborado originariamente a partir del protocolo del Institute for in vitro Sciences (IIVS) y del protocolo 124 de INVITTOX (8). Este último representa el protocolo utilizado en el estudio de prevalidación patrocinado por la Comunidad Europea y realizado en 1997-1998. Estos dos protocolos se basaban en el método de ensayo BCOP comunicado por primera vez por Gautheron et al. (9).

  El método de ensayo BCOP puede utilizarse para identificar los productos que provocan lesiones oculares graves, tal como se definen en el SGA de las Naciones Unidas, es decir, que deben clasificarse como productos de la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas (4). Cuando se utiliza para este fin, el método de ensayo BCOP tiene una exactitud general del 79 % (150/191), una tasa de falsos positivos del 25 % (32/126), y una tasa de falsos negativos del 14 % (9/65), cuando se compara con los datos del método de ensayo in vivo con ojo de conejo, clasificados según el sistema de clasificación del SGA de las Naciones Unidas (3) (véase el apéndice 2, cuadro 1). Cuando los productos problema de ciertas clases químicas (en concreto, alcoholes y cetonas) o físicas (en concreto, sólidos), se excluyen de la base de datos, el método de ensayo BCOP tiene una exactitud general del 85 % (111/131), una tasa de falsos positivos del 20 % (16/81), y una tasa de falsos negativos del 8 % (4/50) para el sistema de clasificación del SGA de las Naciones Unidas (3). Las posibles deficiencias del método de ensayo BCOP para identificar los productos que provocan lesiones oculares graves (categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas) están relacionadas con la elevada tasa de falsos positivos de alcoholes y cetonas y la elevada tasa de falsos negativos de sólidos, observadas en la base de datos de validación (1)(2)(3). Sin embargo, dado que no todos los alcoholes y cetonas dan resultados positivos excesivos (sobrepredicción) por el método de ensayo BCOP y algunos de ellos se asignan correctamente a la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas, estos dos grupos funcionales orgánicos no se consideran fuera del ámbito de aplicación del método de ensayo. Corresponde al usuario del método de ensayo decidir si puede aceptarse una posible sobrepredicción de un alcohol o cetona, o si deben efectuarse más ensayos con un planteamiento basado en la ponderación de las pruebas. En relación con las tasas de falsos negativos de sólidos, cabe señalar que los sólidos pueden dar lugar a condiciones de exposición variables y extremas en el ensayo in vivo de irritación de Draize, lo cual puede derivar en resultados poco pertinentes sobre el verdadero potencial de irritación (10). También debe señalarse que ninguno de los falsos negativos detectados en la base de datos de validación del ICCVAM (2)(3), en el contexto de la identificación de los productos que inducen lesiones oculares graves (categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas), dio lugar a una IVIS ≤ 3, que es el criterio utilizado para identificar un producto problema como sin categoría del SGA de las Naciones Unidas. Además, los falsos negativos del BCOP no son fundamentales en este contexto, ya que todos los productos problema que den 3 < IVIS ≤ 55 se someterían posteriormente a otros ensayos in vitro validados adecuadamente, o como última opción con conejos, en función de las exigencias normativas, utilizando una estrategia de ensayo secuencial en un enfoque de ponderación de las pruebas. Teniendo en cuenta que algunos productos sólidos son clasificados adecuadamente por el método de ensayo BCOP como de la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas, tampoco se considera que este estado físico quede fuera del ámbito de aplicación del método de ensayo. Los investigadores pueden considerar la posibilidad de utilizar este método de ensayo con todos los tipos de productos, aceptándose una IVIS > 55 como indicativa de una respuesta que provoca lesiones oculares graves, con lo que el producto se clasificaría en la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas sin ensayos adicionales. Sin embargo, como se ha mencionado antes, los resultados positivos obtenidos con alcoholes o cetonas deben interpretarse con precaución, debido al riesgo de sobrepredicción.

  El método de ensayo BCOP puede utilizarse también para identificar productos que no requieren clasificación por irritación ocular o lesiones oculares graves con arreglo al sistema de clasificación del SGA de las Naciones Unidas (4). Cuando se utiliza para este fin, el método de ensayo BCOP tiene una exactitud general del 69 % (135/196), una tasa de falsos positivos del 69 % (61/89), y una tasa de falsos negativos del 0 % (0/107), cuando se compara con los datos del método de ensayo in vivo con ojo de conejo, clasificados según el sistema de clasificación del SGA de las Naciones Unidas (3) (véase el apéndice 2, cuadro 2). La tasa de falsos positivos obtenida (productos sin categoría del SGA de las Naciones Unidas in vivo que presentan una IVIS > 3, véase el punto 48) es considerablemente elevada, pero no es crítica en este contexto, ya que todos los productos problema que den 3 < IVIS ≤ 55 se someterían posteriormente a otros ensayos in vitro validados adecuadamente, o como última opción con conejos, en función de las exigencias normativas, utilizando una estrategia de ensayo secuencial en un enfoque de ponderación de las pruebas. El método de ensayo BCOP no presenta deficiencias específicas para el ensayo de alcoholes, cetonas y sólidos cuando el objetivo es identificar productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves (sin categoría del SGA de las Naciones Unidas) (3). Los investigadores pueden considerar la posibilidad de utilizar este método de ensayo con todos los tipos de productos, aceptándose un resultado negativo (IVIS ≤ 3) como indicativo de que no se requiere clasificación (sin categoría del SGA de las Naciones Unidas). Dado que el método de ensayo BCOP solo puede identificar correctamente el 31 % de los productos que no requieren clasificación por irritación ocular o lesiones oculares graves, este método de ensayo no debe ser la primera opción para iniciar un enfoque ascendente (5), si se dispone de otros métodos in vitro validados y aceptados, con gran sensibilidad similar pero mayor especificidad.

  La base de datos de validación del método BCOP incluía 113 sustancias y 100 mezclas en total (2)(3). El método de ensayo BCOP se considera, por tanto, aplicable a los ensayos de sustancias y de mezclas.

  El método de ensayo BCOP no se recomienda para la identificación de productos problema que deben clasificarse como irritantes oculares (categoría 2 o categoría 2A del SGA de las Naciones Unidas) o de productos problema que deben clasificarse como moderadamente irritantes para los ojos (categoría 2B del SGA de las Naciones Unidas) debido al considerable número de productos de la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas clasificados de forma insuficiente en las categorías 2, 2A o 2B del SGA de las Naciones Unidas y productos sin categoría del SGA de las Naciones Unidas clasificados de forma excesiva en las categorías 2, 2A o 2B del SGA de las Naciones Unidas (2) (3). A tal fin, pueden resultar necesarias pruebas adicionales con otro método adecuado.

  Todos los procedimientos con ojos de bovino y córneas de bovino deben ajustarse a las normas y procedimientos aplicables de la instalación de ensayo en relación con la manipulación de materiales derivados de animales, entre los que figuran los tejidos o los líquidos tisulares. Se recomienda observar las precauciones universales de laboratorio (11).

  Si bien el método de ensayo BCOP no tiene en cuenta las lesiones de la conjuntiva y del iris, sí atiende a los efectos en la córnea, que son un factor de primer orden de la clasificación in vivo cuando se considera la clasificación del SGA de las Naciones Unidas. La reversibilidad de las lesiones de la córnea no puede evaluarse per se en el método de ensayo BCOP. Se ha propuesto, según estudios realizados con ojo de conejo, que se utilice una evaluación de la profundidad inicial de la lesión de la córnea para identificar algunos tipos de efectos irreversibles (12). Sin embargo, se necesitan más conocimientos científicos para comprender cómo se dan efectos irreversibles no relacionados con lesiones iniciales de alto nivel. Finalmente, el método de ensayo BCOP no permite la evaluación del potencial de toxicidad sistémica asociado con la exposición ocular.

  El presente método de ensayo se actualizará periódicamente a la luz de la nueva información y los datos que se vayan considerando. Por ejemplo, la histopatología puede ser útil si se necesita una caracterización más completa de las lesiones de la córnea. Como se indica en el documento de orientación de la OCDE n.º 160 (13), se insta a los usuarios a conservar las córneas y a preparar muestras de histopatología que puedan utilizarse para compilar una base de datos y criterios de decisión con los que se pueda mejorar más tarde la exactitud de este método.

  Cuando algún laboratorio establezca inicialmente este método de ensayo, deben utilizarse los productos para demostrar la aptitud que se indican en el apéndice 3. Los laboratorios pueden utilizar estos productos para demostrar su competencia técnica en la realización del método de ensayo BCOP antes de presentar, con fines de clasificación normativa de peligro, los datos obtenidos con este ensayo.

  PRINCIPIO DEL ENSAYO

  El método de ensayo BCOP es un modelo organotípico con mantenimiento a corto plazo del funcionamiento fisiológico y bioquímico normal de la córnea de bovino in vitro. En este método de ensayo, la lesión provocada por el producto problema se evalúa mediante la medición cuantitativa de los cambios producidos en la opacidad y en la permeabilidad de la córnea, utilizando un opacímetro y un espectrofotómetro de luz visible, respectivamente. Las dos mediciones se combinan para calcular la IVIS, que se utiliza para asignar una categoría de clasificación de peligro por irritación in vitro a fin de predecir el potencial de irritación ocular in vivo de un producto problema (véanse los criterios de decisión en el punto 48).

  El método de ensayo BCOP utiliza córneas aisladas de ojos de ganado bovino recién sacrificado. La opacidad de la córnea se mide cuantitativamente como cantidad de luz transmitida a través de la córnea. La permeabilidad se mide cuantitativamente como cantidad del pigmento fluoresceína sódica que atraviesa todo el espesor de la córnea y se detecta así en el medio que se encuentra en la cámara posterior. Los productos problema se aplican a la superficie epitelial de la córnea poniéndolos en la cámara anterior del soporte de córnea. En el apéndice 4 se ofrece una descripción y un diagrama de un soporte de córnea utilizado en el método de ensayo BCOP. Los soportes de córnea pueden obtenerse de diferentes fuentes comerciales o bien construirse en el propio laboratorio.

  Fuente y edad de los ojos de bovino y selección de la especie animal

  El ganado bovino enviado a los mataderos se sacrifica normalmente para el consumo humano o con otros fines comerciales. Como fuente de córneas para el método de ensayo BCOP se utilizan solo animales sanos que se consideren adecuados para entrar en la cadena alimentaria humana. Debido a que el ganado bovino presenta una amplia variedad de peso, en función de la raza, edad y sexo, no se recomienda ningún peso concreto del animal en el momento del sacrificio.

  Puede variar el tamaño de la córnea cuando se utilizan ojos de animales de distintas edades. Las córneas con un diámetro horizontal > 30,5 mm y un espesor central de la córnea (ECC) ≥ 1 100 μm suelen obtenerse de animales de más de ocho años, mientras que las córneas con un diámetro horizontal < 28,5 mm y un ECC < 900 μm suelen proceder de animales de menos de cinco años (14). Por este motivo, no suelen utilizarse ojos de animales de más de sesenta meses de edad. Tradicionalmente no se utilizan tampoco ojos de animales de menos de doce meses, ya que estos ojos están aún en fase de desarrollo y el espesor y el diámetro de su córnea son considerablemente más pequeños que los observados en ojos de bovinos adultos. Sin embargo, es admisible el uso de córneas de animales jóvenes (es decir, de entre seis y doce meses de edad) porque presentan ciertas ventajas, como una mayor disponibilidad, una variabilidad pequeña en cuanto a la edad, y un peligro reducido en cuanto a la posible exposición de los trabajadores a la encefalopatía espongiforme bovina (15). Como puede ser útil una evaluación más completa del efecto del tamaño o del espesor de la córnea sobre la sensibilidad ante productos corrosivos e irritantes, se anima a los usuarios a informar sobre la edad o el peso estimados de los animales de los que proceden las córneas utilizadas en un estudio.

  Recogida y transporte de los ojos al laboratorio

  Los ojos son recogidos por los empleados del matadero. Para minimizar las lesiones de los ojos, de tipo mecánico u otro, hay que enuclear los ojos tan pronto como sea posible tras la muerte y enfriarlos inmediatamente después de la enucleación y durante el transporte. A fin de evitar la exposición de los ojos a productos potencialmente irritantes, los empleados del matadero no deben utilizar detergentes cuando laven la cabeza del animal.

  Los ojos deben sumergirse completamente en solución salina equilibrada de Hank (conocida por sus siglas en inglés, HBSS) refrigerada en un recipiente de tamaño adecuado, y transportarse al laboratorio de manera que se reduzcan al mínimo su deterioro y su contaminación bacteriana. Como los ojos se recogen durante el proceso de sacrificio, pueden estar expuestos a la sangre y a otros materiales biológicos, además de bacterias y otros microorganismos. Por tanto, es importante velar por que se reduzca al mínimo el riesgo de contaminación (por ejemplo, manteniendo en hielo el recipiente con los ojos durante las operaciones de recogida y transporte, y añadiendo antibióticos a la HBSS utilizada para conservar los ojos durante el transporte [por ejemplo, 100 UI/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina]).

  Debe reducirse al mínimo el tiempo transcurrido entre la recogida de los ojos y la utilización de las córneas en el método de ensayo BCOP (lo normal es efectuar todo el proceso en un solo día), y hay que demostrar que ese tiempo no altera los resultados del ensayo. Estos resultados se basan en los criterios de selección de los ojos, así como en las respuestas obtenidas con testigos positivos y negativos. Todos los ojos utilizados en el ensayo deben proceder del mismo grupo de ojos recogidos un día concreto.

  Criterios de selección de los ojos utilizados en el método de ensayo BCOP

  Tras su llegada al laboratorio, los ojos se someten a un atento examen para detectar posibles defectos, como un aumento de la opacidad, arañazos o neovascularización. Solo deben utilizarse las córneas de ojos que no presenten estos defectos.

  La calidad de cada córnea se evalúa también en otras fases posteriores del ensayo. Deben desecharse las córneas que tengan una opacidad mayor de siete unidades de opacidad o equivalente según el opacímetro y los soportes de córneas que se hayan usado con ellas después del período inicial de equilibrado de una hora (NOTA: El opacímetro debe calibrarse con los patrones de opacidad utilizados para establecer las unidades de opacidad, véase el apéndice 4).

  Cada grupo de tratamiento (producto problema, testigos negativos y positivos en paralelo) consiste en un mínimo de tres ojos. Para el testigo negativo en el método de ensayo BCPO deben utilizarse tres córneas. Puesto que todas las córneas se extraen del globo entero y se montan en las cámaras de córnea, existe la posibilidad de que haya artefactos procedentes de la manipulación que influyan en los distintos valores de opacidad y permeabilidad de la córnea (incluido el testigo negativo). Por otra parte, los valores de opacidad y permeabilidad de las córneas del testigo negativo se utilizan para corregir los valores de opacidad y permeabilidad de las córneas tratadas con la muestra problema y con los testigos positivos a efectos del cálculo de la IVIS.

  PROCEDIMIENTO

  Preparación de los ojos

  Se disecan córneas libres de defectos, dejándoles un borde de 2 o 3 mm de esclerótica para facilitar la manipulación posterior, y atendiendo a no lesionar el epitelio ni el endotelio de la córnea. Las córneas aisladas se montan en soportes de córnea, diseñados especialmente, que consisten en un compartimento anterior y otro posterior, en contacto respectivamente con el lado epitelial y el lado endotelial de la córnea. Ambas cámaras se llenan hasta rebosar con medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) sin rojo de fenol y precalentado, empezando por la cámara posterior y evitando la formación de burbujas. El dispositivo se estabiliza después a 32 ± 1 °C durante al menos una hora para que las córneas alcancen un estado de equilibrio con el medio y consigan una actividad metabólica normal, dentro de lo posible (la temperatura aproximada de la superficie de la córnea in vivo es de 32 °C).

  Tras el periodo de equilibrado, se añade a ambas cámaras nuevo EMEM sin rojo de fenol y precalentado, y se toman lecturas de la opacidad de base de cada córnea. Deben desecharse las córneas que muestren lesiones tisulares macroscópicas (p. ej., arañazos, pigmentación, neovascularización) o una opacidad mayor de siete unidades de opacidad o equivalente según el opacímetro y los soportes de córneas que se hayan usado. Se selecciona para el testigo negativo (o de disolvente) un mínimo de tres córneas. El resto de las córneas se distribuye después en grupos de tratamiento y de testigo positivo.

  Como la capacidad térmica del agua es superior a la del aire, el agua ofrece condiciones de temperatura más estables para la incubación. Por tanto, se recomienda utilizar un baño de agua para mantener los soportes de córnea y su contenido a 32 ± 1 °C. Sin embargo, también pueden utilizarse incubadoras de aire, si se toman precauciones para mantener la estabilidad de la temperatura (por ejemplo, precalentando los soportes y los medios).

  Aplicación del producto problema

  Se utilizan dos protocolos de tratamiento diferentes, uno para líquidos y agentes tensioactivos (sólidos o líquidos) y otro para sólidos que no son agentes tensioactivos.

  Los líquidos se someten al ensayo sin diluir. Los semisólidos, cremas y ceras se someten a ensayo en principio como líquidos. Las sustancias tensioactivas sin diluir se someten a ensayo a una concentración del 10 % (p/v) en solución de cloruro sódico al 0,9 %, agua destilada u otro disolvente del que se haya demostrado que no tiene efectos negativos sobre el sistema de ensayo. Debe justificarse adecuadamente si se utilizan otras concentraciones de dilución. Las mezclas que contengan tensioactivos pueden someterse a ensayo sin diluir o diluidas a una concentración adecuada en función del escenario de exposición in vivo pertinente. Debe justificarse adecuadamente la concentración utilizada en el ensayo. Las córneas se exponen a los líquidos y agentes tensioactivos durante 10 minutos. La utilización de otros tiempos de exposición exige una explicación científica adecuada. Véase en el apéndice 1 una definición de tensioactivo y de mezcla que contiene tensioactivos.

  Los sólidos que no son agentes tensioactivos se someten a ensayo en principio como soluciones o suspensiones a una concentración del 20 % (p/v) en solución de cloruro sódico al 0,9 %, agua destilada u otro disolvente del que se haya demostrado que no tiene efectos negativos sobre el sistema de ensayo. En ciertas circunstancias y con una justificación científica adecuada, es posible someter a ensayo los sólidos sin diluir mediante aplicación directa sobre la superficie de la córnea, utilizando el método de cámara abierta (véase el punto 32). Las córneas se exponen a los sólidos durante cuatro horas, pero, como sucede con los líquidos y agentes tensioactivos, es posible utilizar otros tiempos de exposición si se cuenta con una explicación científica adecuada.

  Pueden utilizarse distintos métodos de tratamiento, en función de la naturaleza física y de las características químicas del producto problema (por ejemplo, sólidos, líquidos, líquidos viscosos frente a líquidos no viscosos). El factor crítico consiste en velar por que el producto problema cubra adecuadamente la superficie epitelial y se elimine adecuadamente durante las fases de lavado. Suele utilizarse un método de cámara cerrada cuando se estudian productos problema líquidos desde no viscosos hasta ligeramente viscosos, mientras que se usa en principio un método de cámara abierta con productos problema líquidos viscosos y semiviscosos, así como con sólidos sin diluir.

  En el método de cámara cerrada, se introduce en la cámara anterior (a través de los orificios de administración que se encuentran en la superficie superior de la cámara) una cantidad suficiente de producto problema (750 μl) para cubrir la cara epitelial de la córnea, y los agujeros se tapan a continuación con los tapones de la cámara durante la exposición. Es importante que cada córnea quede expuesta al producto problema durante el periodo adecuado.

  En el método de cámara abierta, antes del tratamiento se retiran el anillo de cierre de la ventana y la ventana de cristal de la cámara anterior. El producto problema o testigo (750 μl, o una cantidad suficiente de producto problema para cubrir completamente la córnea) se aplica directamente sobre la superficie epitelial de la córnea utilizando una micropipeta. Si es difícil pipetear el producto problema, este puede cargarse a presión en una pipeta de desplazamiento positivo para facilitar la dosificación. La punta de pipeta de la pipeta de desplazamiento positivo se inserta en la punta de dispensación de la jeringa, de forma que el producto problema pueda cargarse en la punta de desplazamiento bajo presión. Simultáneamente, se oprime el émbolo de la jeringa mientras se arrastra hacia arriba el pistón de la pipeta. Si aparece alguna burbuja de aire en la punta de la pipeta, se retira (se expulsa) el producto problema y se repite el proceso hasta que la punta se quede llena sin ninguna burbuja de aire. En caso necesario, puede utilizarse una jeringa normal (sin aguja), ya que permite medir un volumen exacto de producto problema y facilita su aplicación sobre la superficie epitelial de la córnea. Tras la aplicación del producto, se vuelve a colocar la ventana de cristal de la cámara anterior para crear de nuevo un sistema cerrado.

  Incubación tras la exposición

  Tras el periodo de exposición, el producto problema, el testigo negativo o el producto de testigo positivo se retiran de la cámara anterior y se lava el epitelio al menos tres veces (o hasta que no quede ningún rastro visible del producto problema) utilizando EMEM con rojo de fenol. Se utiliza para el lavado el medio con rojo de fenol porque la observación del cambio de color de esta sustancia permite determinar la efectividad del lavado de productos problema ácidos o alcalinos. Las córneas se lavan más de tres veces si el rojo de fenol sigue sin colorearse (amarillo o púrpura) o sigue viéndose el producto problema. Una vez el medio ha quedado libre de producto problema, se lavan las córneas una última vez con EMEM sin rojo de fenol. Se utiliza EMEM sin rojo de fenol en el lavado final para eliminar el rojo de fenol de la cámara anterior antes de medir la opacidad. La cámara anterior vuelve a llenarse a continuación con EMEM nuevo sin rojo de fenol.

  En el caso de líquidos o agentes tensioactivos, las córneas, una vez lavadas, se incuban otras dos horas a 32 ± 1ºC. En ciertas circunstancias puede ser útil prolongar este tiempo tras la exposición, extremo que debe estudiarse en cada caso. Las córneas tratadas con sólidos se lavan a fondo al final del periodo de exposición de cuatro horas, pero no es necesario prolongar su incubación.

  Al final del periodo de incubación tras la exposición en el caso de líquidos y agentes tensioactivos y al final del periodo de exposición de cuatro horas en el caso de sólidos que no son agentes tensioactivos, se registran la opacidad y la permeabilidad de cada córnea. Asimismo, se observa visualmente cada córnea y se registran las observaciones pertinentes (por ejemplo, abrasión tisular, producto problema residual, opacidad no uniforme). Estas observaciones pueden ser importantes ya que pueden reflejarse en variaciones de las lecturas del opacímetro.

  Productos testigo

  En cada experimento se incluyen testigos simultáneos negativos (o del disolvente/vehículo) y positivos.

  Cuando se somete a ensayo una sustancia líquida al 100 %, se incluye en el método de ensayo BCOP un testigo negativo en paralelo (por ejemplo, solución de cloruro sódico al 0,9 % o agua destilada), de forma que puedan detectarse los eventuales cambios inespecíficos del sistema de ensayo y se disponga de una base de referencia para los parámetros del ensayo. También permite asegurarse de que las condiciones del ensayo no provocan de forma inadecuada una respuesta de irritación.

  Cuando se somete a ensayo una sustancia líquida diluida, un agente tensioactivo o un sólido, se incluye en el método de ensayo BCOP un grupo de testigo en paralelo del disolvente/vehículo, de forma que puedan detectarse los eventuales cambios inespecíficos del sistema de ensayo y se disponga de una base de referencia para los parámetros del ensayo. Solo pueden utilizarse disolventes/vehículos de los que se haya demostrado que carecen de efectos adversos sobre el sistema de ensayo.

  Un producto del que se sabe que induce una respuesta positiva se incluye como testigo positivo en paralelo en cada experimento para verificar la integridad del sistema de ensayo y su correcta realización. Sin embargo, para asegurar la posibilidad de evaluar la variabilidad de las respuestas del testigo positivo a lo largo del tiempo, no debe ser excesiva la magnitud de la respuesta de irritación.

  Como ejemplos de testigos positivos para productos problema líquidos se pueden citar el etanol al 100 % y la dimetilformamida al 100 %. Un ejemplo de testigo positivo para productos problema sólidos es el imidazol al 20 % (p/v) en solución de cloruro sódico al 0,9 %.

  Es útil disponer de productos de referencia para evaluar el potencial de irritación ocular de productos desconocidos dentro de una clase específica de productos, o para evaluar la capacidad de irritación relativa de un irritante ocular dentro de una gama específica de respuestas de irritación.

  Parámetros medidos

  La opacidad se determina mediante la cantidad de luz transmitida a través de la córnea. La opacidad de la córnea se mide cuantitativamente con ayuda de un opacímetro, que permite medir los valores de opacidad en una escala continua.

  La permeabilidad se determina por la cantidad del pigmento fluoresceína sódica que penetra en todas las capas de células de la córnea (es decir, desde el epitelio de la superficie exterior de la córnea hasta el endotelio de su superficie interior). Se añade a la cámara anterior del soporte de córnea 1 ml de solución de fluoresceína sódica (4 o 5 mg/ml cuando se estudian líquidos y agentes tensioactivos o sólidos no tensioactivos, respectivamente), en contacto con el lado epitelial de la córnea, mientras que la cámara posterior, en contacto con el lado endotelial de la córnea, se llena con EMEM nuevo. El soporte se incuba a continuación en posición horizontal durante 90 ± 5 min a 32 ± 1 °C. La cantidad de fluoresceína sódica que atraviesa la córnea hasta la cámara posterior se mide cuantitativamente mediante espectrofotometría UV/VIS. Las mediciones espectrofotométricas evaluadas a 490 nm se registran como valores de absorbancia o densidad óptica (DO490), medidos en una escala continua. Los valores de permeabilidad a la fluoresceína se determinan utilizando los valores de DO490 conseguidos mediante un espectrofotómetro de luz visible con un camino óptico normal de 1 cm.

  También puede utilizarse un lector de placa de microvaloración de 96 pocillos siempre que: i) pueda establecerse la banda de linealidad del lector de placas para determinar los valores de DO490 de fluoresceína; y ii) se utilice el volumen correcto de muestras de fluoresceína en la placa de 96 pocillos para obtener unos valores de DO490 equivalentes a los conseguidos con un camino óptico normal de 1 cm [esto puede exigir que los pocillos estén completamente llenos (generalmente, 360 l)].

  DATOS E INFORME

  Evaluación de los datos

  Una vez corregidos los valores de opacidad y de permeabilidad media (DO490) para tener en cuenta los valores de opacidad de fondo y de permeabilidad (DO490) del testigo negativo, los valores medios de opacidad y permeabilidad (DO490) se combinan en una fórmula empírica para calcular la puntuación de la capacidad de irritación in vitro (IVIS) de cada grupo de tratamiento, de la manera siguiente:

  IVIS = valor medio de opacidad + [15 × valor medio de permeabilidad (DO490)]

  Sina et al. (16) comunican que esta fórmula se ha obtenido mediante estudios internos e interlaboratorios. Los datos obtenidos con una serie de 36 compuestos en un estudio interlaboratorios se sometieron a análisis con múltiples variables para determinar la ecuación que se ajustara mejor a los datos in vivo e in vitro. Los científicos de dos empresas distintas realizaron este análisis y llegaron a ecuaciones casi idénticas.

  Los valores de opacidad y permeabilidad deben evaluarse también independientemente para determinar si un producto problema ha inducido corrosividad o irritación intensa mediante solo uno de los dos parámetros (véase la parte siguiente, sobre criterios de decisión).

  Criterios de decisión

  Los valores de corte de la IVIS para la identificación de productos problema que provocan lesiones oculares graves (categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas) y productos problema que no requieren clasificación por irritación ocular o lesiones oculares graves (sin categoría del SGA de las Naciones Unidas) figuran a continuación:

  IVIS	SGA de las Naciones Unidas
  ≤ 3	Sin categoría
  > 3; ≤ 55	No se puede predecir
  ≤ 55	Categoría 1

  Criterios de aceptación del estudio

  Se considera que un ensayo es aceptable si el testigo positivo da una IVIS comprendida en el intervalo de dos desviaciones típicas respecto a la media histórica del momento, que debe actualizarse al menos cada tres meses, o cada vez que se efectúe un ensayo aceptable en caso de laboratorios en los que no sea frecuente efectuar estos ensayos (es decir, con una frecuencia que no llegue a mensual). Las respuestas de los testigos negativos o del disolvente/vehículo deben llevar a unos valores de opacidad y permeabilidad inferiores a los límites superiores establecidos para los valores de opacidad y permeabilidad de fondo de las córneas de bovino tratadas con el respectivo testigo negativo o del disolvente/vehículo. Una sola tanda de ensayos, formada al menos por tres córneas, debería ser suficiente para un producto problema, si la clasificación resultante es inequívoca. Sin embargo, en casos de resultados dudosos en la primera tanda de ensayos, debe considerarse la realización de una segunda tanda de ensayos (aunque no sea necesariamente obligatoria), así como la de una tercera en caso de resultados medios de IVIS discordantes entre las dos primeras series de pruebas. En este contexto, un resultado de la primera tanda de ensayos se considera dudoso si las predicciones obtenidas de las tres córneas no concuerdan, de forma que:

  • - dos de las tres córneas dan predicciones discordantes respecto a la media de las tres córneas, O BIEN
  • - una de las tres córneas da una predicción discordante de la media de las tres córneas, Y el resultado discordante > 10 unidades de IVIS respecto al umbral de corte de 55.
  • - Si la tanda de ensayos repetida corrobora la predicción de la primera tanda de ensayos (según el valor medio de la IVIS), puede tomarse una decisión final sin ensayos adicionales. Si el resultado de la tanda de ensayos repetida es una predicción no concordante con la tanda de ensayos inicial (según el valor medio de la IVIS), entonces debe hacerse una tercera y última tanda de ensayos, con el fin de resolver las predicciones dudosas y clasificar el producto problema. No será necesario realizar nuevas pruebas con vistas a la clasificación y etiquetado en caso de que alguna tanda de ensayos resulte en una predicción de categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas.

  Informe del ensayo

  El informe del ensayo debe incluir la siguiente información, en caso de que corresponda a la realización del estudio:

  • Productos problema y testigo
    • - Denominación o denominaciones químicas, como la denominación estructural utilizada por el Chemical Abstracts Service (CAS), seguida por otras denominaciones, si se conocen; número de registro CAS, si se conoce;
    • - pureza y la composición del producto problema/testigo (en porcentajes en peso), en la medida en que se disponga de esta información;
    • - propiedades físico-químicas pertinentes para la realización del estudio, como estado físico, volatilidad, pH, estabilidad, clase química o hidrosolubilidad;
    • - tratamiento de los productos problema y testigo antes del ensayo, en su caso (por ejemplo, calentamiento, trituración);
    • - estabilidad, si se conoce.
  • Información referente al promotor y al laboratorio
    • - Nombre y dirección del promotor, laboratorio y director del estudio.
  • Condiciones del método de ensayo
    • - Opacímetro utilizado (por ejemplo, modelo y especificaciones) y configuración del instrumento;
    • - información sobre la calibración de los dispositivos utilizados para medir la opacidad y la permeabilidad (por ejemplo, opacímetro y espectrofotómetro) para garantizar la linealidad de las mediciones;
    • - tipo de los soportes de córnea utilizados (por ejemplo, modelo y especificaciones);
    • - descripción de otros equipos utilizados;
    • - procedimiento utilizado para garantizar la integridad (es decir, la exactitud y la fiabilidad) del método de ensayo a lo largo del tiempo (por ejemplo, ensayo periódico de productos de la prueba de aptitud).
  • Criterios de aceptabilidad del ensayo
    • - Bandas aceptables de testigos positivos y negativos en paralelo según los datos anteriores;
    • - cuando corresponda, bandas aceptables de testigos de referencias simultáneos según los datos anteriores.
  • Recogida y preparación de los ojos
    • - Identificación de la fuente de los ojos (es decir, instalación en la que se han recogido);
    • - diámetro de la córnea como medida de la edad del animal del que procede y de la adecuación para el ensayo;
    • - condiciones de almacenamiento y transporte de los ojos (por ejemplo, fecha y hora de recogida de los ojos, plazo transcurrido hasta el inicio del ensayo, medios de transporte y condiciones de temperatura, uso eventual de antibióticos);
    • - preparación y montaje de las córneas de bovino, con inclusión de declaraciones sobre su calidad, la temperatura de los soportes de córnea y criterios de selección de las córneas utilizadas para los ensayos.
  • Procedimiento
    • - Número de réplicas utilizadas;
    • - identidad de los testigos positivos y negativos utilizados (en su caso, también los testigos de disolvente y de referencia);
    • - concentración o concentraciones del producto problema, aplicación, tiempo de exposición y tiempo de incubación tras la exposición utilizados;
    • - Descripción de los criterios de evaluación y decisión seguidos;
    • - Descripción de los criterios de aceptación del estudio seguidos;
    • - descripción de las eventuales modificaciones del procedimiento del ensayo;
    • - descripción de los criterios de decisión seguidos.
  • Resultados
    • - Presentación en forma de cuadro de los datos correspondientes a las distintas muestras problema (por ejemplo, valores de opacidad y DO490 e IVIS calculada para el producto problema y los testigos positivos, negativos y de referencia [si se utilizan], incluidos los datos procedentes de los experimentos repetidos en paralelo cuando corresponda, y las medias ± la desviación típica de cada experimento);
    • - Descripción de otros efectos observados.
    • - la clasificación del SGA de las Naciones Unidas obtenida in vitro, si procede.
  • Discusión de los resultados
  • Conclusión

  BIBLIOGRAFÍA

  • (1) ICCVAM (2006). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponible en: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.
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  • (6) ICCVAM (2006). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - in vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponible en: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.
  • (7) ICCVAM (2010). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Disponible en: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.
  • (8) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay - SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).
  • (9) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.
  • (10) Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicol. in Vitro 20:78-81.
  • (11) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Disponible en: [http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].
  • (12) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.
  • (13) OCDE (2011). Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-severe Irritants. Series on Testing and Assessment, No. 160. Adopted October 25, 2011. Paris: Organisation for Economic Co-operation and Development.
  • (14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.
  • (15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The Lancet 349: 636-641.
  • (16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam. Appl. Toxicol. 26:20-31.
  • (17) Capítulo B.5 del presente anexo, Toxicidad aguda: irritación/corrosión cutánea.
  • (18) ICCVAM (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Disponible en: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].
  • (19) OCDE (1998). Series on Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring. No. 1: OECD Principles on Good Laboratory Practice (revised in 1997).

  Disponible en: http://www.oecd.org/document/63/0,3343,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html

  Apéndice 1

  DEFINICIONES

  Exactitud : Grado de coincidencia entre los resultados obtenidos con el método de ensayo y los valores de referencia aceptados. Se trata de una medida del comportamiento del método de ensayo y es un aspecto de su “pertinencia”. Este término y el de “concordancia” se suelen usar indistintamente para indicar la proporción de resultados correctos de un método de ensayo.

  Producto de referencia : Producto utilizado como patrón para comparar con un producto problema. Los productos de referencia deben presentar las siguientes propiedades: i) un origen coherente y fiable; ii) similitud estructural y funcional con la clase de productos problema; iii) características físicas y químicas conocidas; iv) datos de apoyo sobre los efectos conocidos, y v) potencia conocida en la gama de respuestas deseada.

  Planteamiento ascendente : Enfoque gradual utilizado para un producto del que se sospecha que no requiere clasificación por irritación ocular o lesiones oculares graves, que comienza con la determinación de los productos que no requieren clasificación (resultado negativo) frente a otros productos (resultado positivo).

  Producto : Sustancia o mezcla.

  Córnea : Parte transparente delantera del globo ocular que cubre el iris y la pupila y permite el paso de la luz al interior.

  Opacidad de la córnea : Medida del grado de opacidad de la córnea tras su exposición a un producto problema. Un aumento de la opacidad de la córnea indica que esta ha sufrido una lesión. La opacidad puede evaluarse subjetivamente, como se hace en el ensayo con ojo de conejo de Draize, u objetivamente con un instrumento como un “opacímetro”.

  Permeabilidad de la córnea : Medida cuantitativa de la lesión del epitelio corneal mediante determinación de la cantidad del pigmento fluoresceína sódica que pasa a través de todas las capas de células corneales.

  Irritación ocular : Producción de cambios en el ojo, como consecuencia de la aplicación de un producto problema en la superficie anterior del ojo, que son totalmente reversibles en los 21 días siguientes a la aplicación. Intercambiable con “efectos reversibles en el ojo” y con “categoría 2 del SGA de las Naciones Unidas” (4).

  Tasa de falsos negativos : Proporción de todos los productos positivos identificados erróneamente como negativos por un método de ensayo. Es uno de los indicadores del comportamiento del método de ensayo.

  Tasa de falsos positivos : Proporción de todos los productos negativos identificados erróneamente como positivos por un método de ensayo. Es uno de los indicadores del comportamiento del método de ensayo.

  Peligro : Propiedad inherente de un agente o situación que tiene capacidad para provocar efectos adversos cuando un organismo, sistema o (sub)población se expone a dicho agente.

  Puntuación de la capacidad de irritación in vitro (In Vitro Irritancy Score, IVIS) : Fórmula empírica utilizada en el método de ensayo BCOP mediante la cual se combinan en una sola puntuación in vitro por cada grupo de tratamiento los valores medios de opacidad y de permeabilidad de cada grupo de tratamiento. IVIS = valor medio de opacidad + (15 × valor medio de permeabilidad).

  Efectos irreversibles en el ojo : Véase la definición de “Lesiones oculares graves”.

  Mezcla : Mezcla o solución compuesta por dos o más sustancias que no reaccionan (4)

  Testigo negativo : Muestra replicada no tratada que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo. Esta muestra se somete al mismo proceso que las muestras tratadas con producto problema y otras muestras testigo para determinar si el disolvente interactúa con el sistema de ensayo.

  Sin clasificar : Producto que no está clasificado por irritación ocular (categoría 2, 2A o 2B del SGA de las Naciones Unidas) ni por lesión ocular grave (categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas). Intercambiable con “sin categoría del SGA de las Naciones Unidas”.

  Opacímetro : Instrumento utilizado para medir la opacidad de la córnea evaluando cuantitativamente la transmisión de la luz a través de esta. El instrumento clásico tiene dos compartimentos, cada uno provisto de su propia fuente de luz y una célula fotoeléctrica. Un compartimento se utiliza para la córnea tratada, y el otro para calibrar y poner a cero el instrumento. Se envía a una célula fotoeléctrica la luz de una lámpara halógena a través de un compartimento de control (cámara vacía sin ventanas ni líquido) y se compara con la luz enviada a una célula fotoeléctrica a través del compartimento experimental, que alberga la cámara que contiene la córnea. Se compara la diferencia en la transmisión luminosa a partir de las células fotoeléctricas y se presenta un valor numérico de opacidad en un indicador digital.

  Testigo positivo : Muestra replicada que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo y que se trata con un producto del que se sabe que induce una respuesta positiva. Para asegurar la posibilidad de evaluar la variabilidad de las respuestas del testigo positivo a lo largo del tiempo, no debe ser excesiva la magnitud de la respuesta positiva.

  Efectos reversibles en el ojo : Véase “Irritación ocular”.

  Fiabilidad : Medida del grado en que un método de ensayo puede aplicarse de forma reproducible a lo largo del tiempo, en un mismo laboratorio y en distintos laboratorios, utilizando el mismo protocolo. Se evalúa calculando la reproducibilidad intra e interlaboratorios y la repetibilidad intralaboratorios.

  Lesiones oculares graves : Producción de una lesión tisular en el ojo o una degradación física severa de la vista, como consecuencia de la aplicación de un producto problema en la superficie anterior del ojo, y que no es totalmente reversible en los 21 días siguientes a la aplicación. Intercambiable con “efectos irreversibles en el ojo” y con “categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas”(4).

  Testigo del disolvente/vehículo : Muestra no tratada que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo, incluido el disolvente o vehículo, y que se somete al mismo proceso que las muestras tratadas con producto problema y otras muestras testigo a fin de determinar la respuesta de base correspondiente a las muestras tratadas con el producto problema disuelto en el mismo disolvente o vehículo. Cuando se somete a ensayo con un testigo negativo en paralelo, esta muestra pone de manifiesto también si el disolvente o vehículo interactúa con el sistema de ensayo.

  Sustancia : Elementos químicos y sus compuestos en estado natural u obtenidos mediante cualquier proceso de producción, incluidos los aditivos necesarios para mantener la estabilidad del producto y las eventuales impurezas derivadas del proceso empleado, pero excluidos los disolventes que se puedan separar sin influir en la estabilidad de la sustancia ni cambiar su composición (4)

  Tensioactivo : También denominado agente tensioactivo, es una sustancia, como un detergente, que puede reducir la tensión superficial de un líquido y, de este modo, permitir que forme espuma o penetre en los sólidos; se conoce también como agente humectante.

  Mezcla que contiene tensioactivos : En el contexto del presente método de ensayo, es una mezcla que contiene uno o más agentes tensioactivos a una concentración final > 5 %.

  Enfoque descendente : Enfoque gradual utilizado para un producto del que se sospecha que causa lesiones oculares graves, que comienza con la determinación de los productos que inducen lesiones oculares graves (resultado positivo) frente a otros productos (resultado negativo).

  Producto problema : Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

  Estrategia de ensayos escalonados : Estrategia de ensayo por fases, en la que se revisa toda la información existente sobre un producto problema, siguiendo un orden especificado, en un proceso de ponderación de las pruebas en cada escalón, a fin de determinar si se dispone de información suficiente para tomar una decisión sobre la clasificación de un peligro, antes de pasar al escalón siguiente. Si puede establecerse la capacidad de irritación de un producto problema con la información disponible, no hace falta efectuar más ensayos. Si no puede establecerse la capacidad de irritación de un producto problema con la información disponible, se aplica un procedimiento secuencial de ensayos con animales por fases hasta que pueda efectuarse una clasificación inequívoca.

  Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos de las Naciones Unidas (SGA de la ONU) : Sistema que propone la clasificación de productos químicos (sustancias y mezclas) según tipos y niveles normalizados de peligros físicos, sanitarios y ambientales, y que hace referencia a los elementos correspondientes de comunicación, como pictogramas, palabras de advertencia, indicaciones de peligro, consejos de prudencia, y fichas de datos de seguridad, a efectos de proporcionar información sobre sus efectos adversos con el fin de proteger a la población (incluidos empresarios, trabajadores, transportistas, consumidores y personal de protección civil) y al medio ambiente (4).

  Categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas : Véase la definición de “Lesiones oculares graves”.

  Categoría 2 del SGA de las Naciones Unidas : Véase “Irritación ocular”.

  Sin categoría del SGA de las Naciones Unidas : Productos que no cumplen los requisitos para clasificarse en la categoría 1 o 2 (2A o 2B) del SGA de las Naciones Unidas. Intercambiable con “sin clasificar”.

  Método de ensayo validado : Método de ensayo sobre el cual se han completado estudios de validación para determinar su pertinencia (incluida su exactitud) y su fiabilidad con un fin específico. Es importante señalar que un método de ensayo validado puede tener un comportamiento insuficiente en términos de exactitud y fiabilidad como para considerarse aceptable a efectos del fin propuesto.

  Ponderación de las pruebas : Proceso de consideración de los aspectos favorables y desfavorables de los distintos elementos de información a efectos de alcanzar y confirmar una conclusión en cuanto al peligro potencial de un producto problema.

  Apéndice 2 CAPACIDAD DE PREDICCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO BCOP

  Cuadro 1

  Capacidad de predicción del método BCOP para identificar los productos que inducen lesiones oculares graves (categoría 1 del SGA de la ONU o del CLP de la UE frente a no categoría 1 (categoría 2 + sin categoría); categoría I de la EPA de EE.UU. frente a no de categoría I (categoría II + categoría III + categoría IV)]

  Sistema de clasificación	Número	Exactitud		Sensibilidad		Falsos negativos		Especificidad		Falsos positivos
  		%	Número	%	Número	%	Número	%	Número	%	Número
  SGA de las Naciones Unidas CLP de la UE	191	78,53	150/191	86,15	56/65	13,85	9/65	74,60	94/126	25,40	32/126
  EPA de EE.UU.	190	78,95	150/190	85,71	54/63	14,29	9/63	75,59	96/127	24,41	31/127

  Cuadro 2:

  Capacidad de predicción del BCOP para identificar los productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni por lesiones oculares graves («no irritantes») (sin categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas o del CLP de la UE frente a no sin categoría (categoría 1 + categoría 2); categoría IV de la EPA de EE.UU. frente a no de categoría IV (categoría I + categoría II +categoría III)]

  Sistema de clasificación	Número	Exactitud		Sensibilidad		Falsos negativos		Especificidad		Falsos positivos
  		%	Número	%	Número	%	Número	%	Número	%	Número
  SGA de las Naciones Unidas CLP de la UE	196	68,88	135/196	100	107/107	0	0/107	31,46	28/89	68,54	61/89
  EPA de EE.UU.	190	82,11	156/190	93,15	136/146	6,85	10/146	45,45	20/44	54,55	24/44

  Apéndice 3 PRODUCTOS UTILIZADOS PARA DEMOSTRAR LA APTITUD DEL MÉTODO DE ENSAYO BCOP

  Antes de proceder al uso sistemático de este método de ensayo, los laboratorios deben demostrar su aptitud técnica, identificando correctamente la clasificación de los trece productos recomendados del cuadro 1 en cuanto al peligro para los ojos. Estos productos se seleccionaron para representar la gama de respuestas en cuanto a los peligros para los ojos sobre la base de los resultados del ensayo in vivo con ojo de conejo (TG 405) (17) y el sistema de clasificación SGA de las Naciones Unidas (es decir, categorías 1, 2A, 2B, o sin clasificar) (4). Otros criterios de selección fueron el que los productos estuvieran disponibles en el mercado, que tuvieran datos de referencia in vivo de alta calidad y también datos in vitro de alta calidad obtenidos con el método de ensayo BCOP. Se encuentran datos de referencia en el documento de resumen simplificado (3) y en el documento de revisión de fondo del ICCVAM sobre el método de ensayo BCOP (2)(18).

  Cuadro 1:

  Productos recomendados para demostrar la aptitud técnica con el método de ensayo BCOP

  Producto	CAS RN	Clase química (11)	Estado físico	Clasificación in vivo   (12)	Clasificación BCOP
  Cloruro de benzalconio (5 %)	8001-54-5	Compuesto onio	Líquido	Categoría 1	Categoría 1
  Clorhexidina	55-56-1	Amina, amidina	Sólido	Categoría 1	Categoría 1
  Ácido dibenzoil-L-tartárico	2743-38-6	Ácido carboxílico, éster	Sólido	Categoría 1	Categoría 1
  Imidazol	288-32-4	Heterociclo	Sólido	Categoría 1	Categoría 1
  Ácido tricloroacético (30 %)	76-03-9	Ácido carboxílico	Líquido	Categoría 1	Categoría 1
  Cloruro de 2,6-diclorobenzoilo	4659-45-4	Haluro de acilo	Líquido	Categoría 2 A	No se puede hacer ninguna predicción exacta/fiable
  2-Metilacetoacetato de etilo	609-14-3	Cetona, éster	Líquido	Categoría 2 B	No se puede hacer ninguna predicción exacta/fiable
  Nitrato de amonio	6484-52-2	Sal inorgánica	Sólido	Categoría 2 (13)	No se puede hacer ninguna predicción exacta/fiable
  EDTA, sal de dipotasio	25102-12-9	Amina, ácido carboxílico (sal)	Sólido	Sin clasificar	Sin clasificar
  Tween 20	9005-64-5	Éster, poliéter	Líquido	Sin clasificar	Sin clasificar
  2-Mercaptopirimidina	1450-85-7	Haluro de acilo	Sólido	Sin clasificar	Sin clasificar
  Fenilbutazona	50-33-9	Heterociclo	Sólido	Sin clasificar	Sin clasificar
  Éter laurílico de polioxietileno 23 (BRIJ- 35) (10 %)	9002-92-0	Alcohol	Líquido	Sin clasificar	Sin clasificar
  Abreviaturas: CAS RN: número de registro del Chemical Abstracts Service.

  Apéndice 4

  SOPORTE DE CÓRNEA PARA EL MÉTODO BCOP

  Los soportes de córnea para el método BCOP se hacen de material inerte, como polipropileno. Los soportes están formados por dos mitades (una cámara anterior y una cámara posterior), y tienen dos cámaras internas cilíndricas similares. Cada cámara está diseñada para albergar un volumen de unos 5 ml y termina en una ventana de cristal, a través de la cual se hacen las mediciones de la opacidad. Cada cámara interna tiene unas dimensiones de 1,7 cm de diámetro y 2,2 cm de profundidad (14) . Para evitar fugas se utiliza una junta tórica situada en la cámara posterior. Las córneas se colocan, con el lado endotelial hacia abajo, sobre la junta tórica de las cámaras posteriores, y las cámaras anteriores se colocan sobre el lado epitelial de las córneas. Las cámaras se mantienen en su posición mediante tres tornillos de acero inoxidable situados en los bordes externos de la cámara. El extremo de cada cámara tiene una ventana de cristal, que puede retirarse para facilitar el acceso a la córnea. Para evitar fugas, se pone también una junta tórica entre la ventana de cristal y la cámara. En la parte superior de cada cámara hay dos agujeros que permiten introducir y retirar el medio y los productos problema. Se cierran con tapones de goma durante los periodos de tratamiento y de incubación. La transmisión de la luz a través de los soportes de córnea puede cambiar, ya que los efectos del desgaste o de la acumulación de residuos químicos específicos sobre las perforaciones de la cámara interior o en las ventanas de vidrio pueden afectar a la dispersión o a la reflectancia de la luz. La consecuencia puede ser que aumente o disminuya la transmisión de la luz de base (y a la inversa las lecturas de la opacidad de base) a través de los soportes de las córneas, y puede manifestarse como cambios notables en las mediciones previstas de la opacidad inicial de base de la córnea en distintas cámaras (es decir, los valores iniciales de opacidad de la córnea en distintos soportes de córnea específicos pueden diferir normalmente en más de 2 o 3 unidades de opacidad respecto a los valores de base). Cada laboratorio debe considerar el establecimiento de un programa de evaluación de los cambios en la transmisión de la luz a través de los soportes de córnea, dependiendo de la naturaleza de los productos problema y de la frecuencia de uso de las cámaras. Para fijar los valores de base, los soportes de córnea pueden comprobarse antes de su uso rutinario procediendo a la medición de los valores de opacidad de base (o de transmisión luminosa) de cámaras llenas con medio completo, sin córneas. Los soportes de córnea se comprueban periódicamente después en cuanto a los cambios en la transmisión de la luz en los períodos de utilización. Cada laboratorio puede determinar la frecuencia con la que se deberán comprobar los soportes de córnea, en función de los productos problema, la frecuencia de uso, y las observaciones de cambios en los valores de base de opacidad de la córnea. Si se observan cambios notables en la transmisión de la luz a través de los soportes de córnea, ha de considerarse la posibilidad de proceder al pulido o limpieza adecuados de la superficie interior de los soportes de córnea o a su sustitución.

  Soporte de córnea: Diagrama despiezado

  

  Apéndice 5

  OPACÍMETRO

  El opacímetro es un dispositivo que mide la transmisión luminosa. Por ejemplo, en el dispositivo OP-KIT de Electro Design (Riom, Francia) utilizado en la validación del método de ensayo BCOP, se envía a una célula fotoeléctrica la luz de una lámpara halógena a través de un compartimento testigo (cámara vacía sin ventanas ni líquido) y se compara con la luz enviada a una célula fotoeléctrica a través del compartimento experimental, que alberga la cámara que contiene la córnea. Se compara la diferencia en la transmisión luminosa a partir de las células fotoeléctricas y se presenta un valor numérico de opacidad en un indicador digital. Se determina el número de unidades de opacidad. Es posible utilizar otros tipos de opacímetros con una configuración diferente (por ejemplo, que no requieran mediciones paralelas de los compartimentos testigo y experimental) cuando se haya demostrado que dan resultados similares a los del dispositivo validado.

  Las respuestas del opacímetro deben ser lineales a lo largo de una gama de lecturas de opacidad que incluya los valores de corte utilizados para las diferentes clasificaciones descritas por el modelo de predicción (es decir, hasta el valor de corte que determina la corrosividad / capacidad de irritación intensa). Para garantizar que las lecturas son lineales y exactas hasta la zona de 75-80 unidades de opacidad, es necesario calibrar el opacímetro utilizando una serie de calibradores. Los calibradores se introducen en la cámara de calibración (cámara para córneas diseñada para contener los calibradores) y se toman las lecturas en el opacímetro. La cámara de calibración está designada para mantener los calibradores a la misma distancia aproximadamente entre la luz y la célula fotoeléctrica a la que se colocarían las córneas durante las mediciones de la opacidad. Los valores de referencia y el punto de ajuste inicial dependen del tipo de dispositivo utilizado. La linealidad de las mediciones de la opacidad debe garantizarse mediante procedimientos adecuados (específicos de cada instrumento). Por ejemplo, para los dispositivos OP-KIT de Electro Design (Riom, Francia), el opacímetro se calibra en primer lugar a 0 unidades de opacidad utilizando la cámara de calibración sin ningún calibrador. A continuación se ponen en esta cámara tres calibradores diferentes, uno a uno, y se miden las opacidades correspondientes. A los calibradores 1, 2 y 3 deben corresponderles unas lecturas de opacidad iguales a sus valores establecidos de 75, 150, y 225 unidades de opacidad, respectivamente, ± 5 %.»

• 13) En la parte B, el capítulo B.48 se sustituye por el texto siguiente:

  « B.48
  
  Método de ensayo de ojo de pollo aislado para identificar: i) productos que provocan lesiones oculares graves y ii) productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves

  INTRODUCCIÓN

  El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo (TG) 438 de la OCDE (2013). El método de ensayo de ojo de pollo aislado (conocido por la siglas de su nombre en inglés, ICE), fue evaluado por el Comité de Coordinación Interagencias sobre la Validación de Métodos Alternativos estadounidense (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM), junto con el Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) y el Centro Japonés para la Validación de Métodos Alternativos (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM), en 2006 y 2010 (1) (2) (3). En la primera evaluación, se consideró que el ICE es un método de ensayo cientifícamente válido para su uso como ensayo de cribado para identificar productos (sustancias y mezclas) que provocan lesiones oculares graves (categoría 1), según se definen en el Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos (SGA) de las Naciones Unidas (1) (2) (3) y en el Reglamento (CE) n.º 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas (CLP) (1). En la segunda evaluación, el método de ensayo ICE se evaluó en cuanto a su utilidad como ensayo de cribado para identificar productos que no están clasificados por irritación ocular ni por lesiones oculares graves según se definen en el SGA de las Naciones Unidas (3) (4). Los resultados del estudio de validación y las recomendaciones del grupo de revisión por pares mantuvieron la recomendación original de utilizar el ICE para la clasificación de los productos que inducen lesiones oculares graves (categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas), ya que la base de datos disponible se ha mantenido sin cambios desde la validación original por el ICCVAM. En esa fase, no se sugirieron nuevas recomendaciones de ampliación del ámbito de aplicación del ICE para incluir también otras categorías. Se llevó a cabo una reevaluación del conjunto de datos in vitro e in vivo utilizados en el estudio de validación, con el propósito de evaluar la utilidad del ICE para identificar productos que no requieren clasificación por irritación ocular o lesiones oculares graves (5). Esta reevaluación llegó a la conclusión de que el método de ensayo ICE puede utilizarse también para identificar productos que no requieren clasificación por irritación ocular o lesiones oculares graves según se definen en el SGA de las Naciones Unidas (4) (5). El presente método de ensayo incluye los usos recomendados y las limitaciones del método de ensayo ICE sobre la base de estas evaluaciones. Las principales diferencias entre la versión inicial de 2009 y la versión actualizada de 2013 de las directrices de ensayo de la OCDE incluyen, entre otros elementos, el uso del método de ensayo ICE para identificar productos que no requieren clasificación según el sistema de clasificación del SGA de las Naciones Unidas, una actualización de varios aspectos del informe de ensayo, una actualización del apéndice 1 sobre definiciones, y una actualización del apéndice 2 sobre los productos de la prueba de aptitud.

  Actualmente se reconoce en general que, en un futuro próximo, ningún ensayo de irritación ocular in vitro podrá sustituir por sí solo al ensayo ocular de Draize in vivo para predecir toda la gama de irritación causada por las distintas categorías de productos. Sin embargo, unas combinaciones estratégicas de varios métodos de ensayo alternativos dentro de una estrategia de ensayos (escalonados) sí podrán sustituir al ensayo ocular de Draize (6). El enfoque descendente (7) está diseñado para utilizarse cuando, sobre la base de la información existente, se espera de un producto que tenga una alta capacidad de irritación, mientras que el enfoque ascendente (7) está diseñado para utilizarse cuando, sobre la base de la información existente, se espera de un producto que no cause irritación ocular suficiente para exigir una clasificación. El método de ensayo ICE es un procedimiento in vitro que puede utilizarse, en determinadas circunstancias y con limitaciones específicas como se contempla en los puntos 8 a 10, con fines de clasificación de peligros para los ojos y de etiquetado de productos. Si bien no se considera válido para sustituir por sí solo al ensayo in vivo con ojo de conejo, el método de ensayo ICE se recomienda como fase inicial en una estrategia de ensayo tal como el enfoque descendente sugerido por Scott et al. (7) para identificar los productos que provocan lesiones oculares graves, es decir, los productos que han de clasificarse en la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas, sin necesidad de hacer más pruebas (4). El método de ensayo ICE se recomienda también para identificar productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves, según se definen en el SGA de las Naciones Unidas (sin categoría) (4), por lo que puede utilizarse como fase inicial dentro de una estrategia de ensayos de enfoque ascendente (7). No obstante, un producto del que no se espere que cause lesiones oculares graves o que no esté clasificado por irritación ocular o lesiones oculares graves según el método de ensayo ICE tendría que someterse a ensayos adicionales (in vitro o in vivo) para establecer una clasificación definitiva. Además, las autoridades reguladoras competentes deben ser consultadas antes de utilizar el ICE en un enfoque ascendente en relación con otros regímenes de clasificación distintos del SGA de las Naciones Unidas.

  El objetivo del presente método de ensayo es describir los procedimientos utilizados para evaluar el posible peligro para los ojos de un producto problema en función de su capacidad de inducir o no toxicidad para un ojo enucleado de pollo. Los efectos tóxicos sobre la córnea se miden mediante: i) una evaluación cualitativa de la opacidad, ii) una evaluación cualitativa de las lesiones provocadas al epitelio sobre la base de la aplicación de fluoresceína en el ojo (retención de fluoresceína), iii) una medición cuantitativa del aumento del espesor (inflamación), y iv) una evaluación cualitativa de las lesiones morfológicas macroscópicas de la superficie. Las evaluaciones de la opacidad, la inflamación y las lesiones de la córnea tras la exposición de esta a un producto problema se efectúan por separado y después se combinan para llegar a una clasificación de la capacidad de irritación ocular.

  En el apéndice 1 se dan las definiciones pertinentes.

  CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES

  El presente método de ensayo se basa en el protocolo sugerido en el documento de orientación de la OCDE 160 (8), elaborado siguiendo el estudio internacional de validación del ICCVAM (1) (3) (9), con aportaciones del Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos, del Centro Japonés para la Validación de Métodos Alternativos, y del Departamento de Toxicología y Farmacología Aplicada de Calidad de la Vida de TNO de los Países Bajos (TNO Quality of Life Department of Toxicology and Applied Pharmacology). El protocolo se basa en la información obtenida a partir de protocolos publicados, así como del protocolo actualmente utilizado por TNO (10) (11) (12) (13) (14).

  Se ha estudiado una amplia gama de productos en la validación subyacente al presente método de ensayo, y la base de datos empíricos del estudio de validación contaba con 152 productos, de los que 72 eran sustancias y 80, mezclas (5). El método de ensayo es aplicable a sólidos, líquidos, emulsiones y geles. Los líquidos pueden ser acuosos o no acuosos; los sólidos pueden ser solubles o insolubles en agua. Aún no se ha efectuado ningún estudio de validación con gases y aerosoles.

  El método de ensayo ICE puede utilizarse para identificar los productos que provocan lesiones oculares graves, es decir, que deben clasificarse como productos de la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas (4). Cuando se utiliza para este fin, las limitaciones que se han detectado en el método de ensayo ICE están relacionadas con las elevadas tasas de falsos resultados positivos de alcoholes y con las elevadas tasas de falsos resultados negativos de sólidos y tensioactivos (1) (3) (9). Sin embargo, las tasas de falsos negativos en este contexto (productos de categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas identificados como que no pertenecen a esta categoría) no son críticas, ya que todos los productos problema que dan resultado negativo se someten posteriormente a otro u otros ensayos in vitro validados adecuadamente, o como última opción con conejos, en función de las exigencias normativas, utilizando una estrategia de ensayo secuencial en un enfoque de ponderación de las pruebas. Cabe señalar que los sólidos pueden dar lugar a condiciones de exposición variables y extremas en el ensayo in vivo de irritación ocular de Draize, lo cual puede derivar en resultados poco pertinentes sobre el verdadero potencial de irritación (15). Los investigadores pueden considerar la utilización de este método de ensayo con todos los tipos de productos, aceptándose un resultado positivo como indicativo de lesiones oculares graves, es decir, de clasificación en la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas sin ensayos adicionales. Sin embargo, los resultados positivos obtenidos con alcoholes deben interpretarse con precaución, debido al riesgo de sobrepredicción.

  Cuando se utiliza para identificar productos que inducen lesiones oculares graves (categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas), el método de ensayo ICE tiene una exactitud general del 86 % (120/140), una tasa de falsos positivos del 6 % (7/113), y una tasa de falsos negativos del 48 % (13/27), cuando se compara con los datos del método de ensayo in vivo con ojo de conejo, clasificados según el sistema de clasificación del SGA de las Naciones Unidas (4) (5).

  El método de ensayo ICE puede utilizarse también para identificar productos que no requieren clasificación por irritación ocular o lesiones oculares graves con arreglo al sistema de clasificación del SGA de las Naciones Unidas (4). Las autoridades reguladoras competentes deben ser consultadas antes de utilizar el ICE en un enfoque ascendente en relación con otros regímenes de clasificación. Este método de ensayo puede utilizarse con todos los tipos de productos, aceptándose un resultado negativo para no clasificar el producto por irritación ocular o lesiones oculares graves. Sin embargo, sobre la base de un solo resultado a partir de la base de datos de la validación, puede haber riesgo de infrapredicción de las pinturas antiincrustantes que contienen disolventes orgánicos (5).

  Cuando se utiliza para identificar productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves, el método de ensayo ICE tiene una exactitud general del 82 % (125/152), una tasa de falsos positivos del 33 % (26/79), y una tasa de falsos negativos del 1 % (1/73), cuando se compara con los datos del método de ensayo in vivo con ojo de conejo, clasificados según el SGA de las Naciones Unidas (4) (5). Cuando los productos problema de ciertas clases (en concreto, pinturas antiincrustantes que contienen disolventes orgánicos) se excluyen de la base de datos, el método de ensayo ICE tiene una exactitud del 83 % (123/149), una tasa de falsos positivos del 33 % (26/78), y una tasa de falsos negativos del 0 % (0/71) para el sistema de clasificación del SGA de las Naciones Unidas (4) (5).

  El método de ensayo ICE no se recomienda para la identificación de productos problema que deben clasificarse como irritantes oculares (es decir, de categoría 2 o categoría 2A del SGA de las Naciones Unidas) o de productos problema que deben clasificarse como moderadamente irritantes para los ojos (categoría 2B del SGA de las Naciones Unidas), dado el considerable número de productos de la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas clasificados de forma insuficiente en las categorías 2, 2A o 2B del SGA de las Naciones Unidas y de productos sin categoría del SGA de las Naciones Unidas clasificados de forma excesiva en las categorías 2, 2A o 2B del SGA de las Naciones Unidas. A tal fin, pueden resultar necesarias pruebas adicionales con otro método adecuado.

  Todos los procedimientos con ojos de pollo deben ajustarse a las normas y procedimientos aplicables de la instalación de ensayo en relación con la manipulación de materiales derivados del hombre o de animales, entre los que figuran los tejidos o los líquidos tisulares. Se recomienda observar las precauciones universales de laboratorio (16).

  Si bien el método de ensayo ICE no tiene en cuenta las lesiones de la conjuntiva y del iris que se evalúan en el método de ensayo de irritación ocular del conejo, sí atiende a los efectos en la córnea, que son un factor de primer orden de la clasificación in vivo cuando se considera la clasificación del SGA de las Naciones Unidas. Asimismo, aunque la reversibilidad de las lesiones de la córnea no puede evaluarse per se con el método de ensayo ICE, se ha propuesto, sobre la base de los estudios en ojo de conejo, que la evaluación de la profundidad inicial de la lesión de la córnea puede utilizarse para identificar ciertos tipos de efectos irreversibles (17). En particular, se necesitan más conocimientos científicos para comprender cómo se dan efectos irreversibles no relacionados con lesiones iniciales de alto nivel. Finalmente, el método de ensayo ICE no permite la evaluación del potencial de toxicidad sistémica asociado con la exposición ocular.

  El presente método de ensayo se actualizará periódicamente a la luz de la nueva información y los datos que se vayan considerando. Por ejemplo, la histopatología puede ser útil si se necesita una caracterización más completa de las lesiones de la córnea. Para evaluar esta posibilidad, se insta a los usuarios a conservar los ojos y a preparar muestras de histopatología que puedan utilizarse para compilar una base de datos y criterios de decisión con los que se pueda seguir mejorando la exactitud de este método. La OCDE ha elaborado un documento de orientación sobre el uso de métodos de ensayo de la toxicidad ocular in vitro, que incluye procedimientos detallados sobre la recogida de muestras de histopatología, así como información sobre dónde presentar las muestras o los datos de histopatología (8).

  Cuando algún laboratorio establezca inicialmente este ensayo, deben utilizarse los productos para demostrar la aptitud que se indican en el apéndice 2. Los laboratorios pueden utilizar estos productos para demostrar su competencia técnica en la aplicación del método de ensayo ICE antes de presentar, con fines de clasificación normativa de peligros, los datos obtenidos con este ensayo.

  PRINCIPIO DEL ENSAYO

  El método de ensayo ICE es un modelo organotípico con mantenimiento a corto plazo del ojo de pollo in vitro. En este método de ensayo, las lesiones provocadas por el producto problema se evalúan determinando la inflamación, la opacidad y la retención de fluoresceína en la córnea. Mientras que los dos últimos parámetros implican una evaluación cualitativa, el análisis de la inflamación de la córnea permite una evaluación cuantitativa. Cada medición se convierte en una puntuación cuantitativa utilizada para calcular un índice general de irritación, o bien se somete a una categorización cualitativa para asignarle una clasificación de peligro ocular in vitro, bien en la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas o bien sin clasificar en el SGA de las Naciones Unidas. Cualquiera de estos resultados puede utilizarse a continuación para predecir el potencial de causar lesiones oculares graves in vivo o la ausencia de requisito de clasificación en cuanto al peligro para los ojos de un producto problema (véanse los criterios de decisión). No obstante, no se puede dar ninguna clasificación a los productos de los que no se predice que causan lesiones oculares graves o que no se clasifican con el método de ensayo ICE (véase el punto 11).

  Fuente y edad de los ojos de pollo

  Tradicionalmente se han venido utilizando para este ensayo los ojos tomados de pollos obtenidos de mataderos donde se sacrifican para el consumo humano, con lo que se suprime la necesidad de disponer de animales de laboratorio. Solo se utilizan los ojos de animales sanos considerados adecuados para entrar en la cadena alimentaria humana.

  Aunque aún no se ha efectuado ningún estudio comparativo para evaluar la edad óptima de los pollos, la edad y el peso de los pollos usados tradicionalmente en este método de ensayo corresponden a los pollos tiernos que se suelen tratar en los mataderos de aves de corral (es decir, de unas siete semanas de edad y entre 1, 5 y 2,5 kg).

  Recogida y transporte de los ojos al laboratorio

  Las cabezas deben retirarse inmediatamente después de la sedación de los pollos, generalmente por choque eléctrico, y de la incisión del cuello para su sangrado. Las fuentes locales de pollos deben estar situadas cerca del laboratorio de forma que las cabezas puedan transferirse desde el matadero al laboratorio en poco tiempo, a fin de reducir al mínimo el deterioro y la contaminación bacteriana. Debe reducirse al mínimo el tiempo transcurrido entre la recogida de las cabezas de pollo y la colocación de los ojos en la cámara de superfusión tras su enucleación (lo normal es que este plazo no exceda de dos horas) a fin de garantizar que se cumplen los criterios de aceptación del ensayo. Todos los ojos utilizados en el ensayo deben proceder del mismo grupo de ojos recogidos un día concreto.

  Como los ojos se disecan en el laboratorio, las cabezas intactas se transportan desde el matadero a temperatura ambiente (normalmente entre 18 °C y 25 °C) en cajas de plástico humidificadas mediante telas mojadas con solución salina isotónica.

  Criterios de selección y número de los ojos utilizados en el ICE

  Se desechan los ojos que tienen una elevada tinción de fluoresceína de base (es decir, > 0,5) o una elevada puntuación de opacidad de la córnea (es decir, > 0,5) una vez han sido enucleados.

  Cada grupo de tratamiento y de testigo positivo en paralelo consiste en al menos tres ojos. El grupo de testigo negativo o el testigo del disolvente (si se utiliza un disolvente distinto de la solución salina) consiste en al menos un ojo.

  En el caso de materiales sólidos que dan un resultado de sin clasificar según el SGA, se recomienda realizar el ensayo con una segunda tanda de tres ojos para confirmar o descartar el resultado negativo.

  PROCEDIMIENTO

  Preparación de los ojos

  Se cortan los párpados cuidadosamente, procurando no dañar la córnea. Se evalúa rápidamente la integridad de la córnea mediante la aplicación de una gota de fluoresceína sódica al 2 % (p/v) a la superficie de la córnea durante unos segundos, seguida de lavado con solución salina isotónica. Los ojos tratados con fluoresceína se examinan a continuación con un microscopio de lámpara de hendidura para asegurarse de que la córnea está ilesa (es decir, tiene puntuaciones de retención de fluoresceína y de opacidad de la córnea ≤ 0,5).

  Los ojos que no presenten lesiones se extraen del cráneo, teniendo cuidado de no lesionar la córnea. El globo ocular se extrae de la órbita sujetando firmemente con pinzas quirúrgicas la membrana nictitante, y los músculos del ojo se cortan con unas tijeras curvas de punta roma. Es importante no causar lesiones a la córnea por una presión excesiva (es decir, artefactos de compresión).

  Cuando se retira el ojo de la órbita, debe quedar con él una porción visible del nervio óptico. Una vez retirado de la órbita, el ojo se pone en una gasa hidrófila y se retiran, cortándolos, la membrana nictitante y demás tejidos conjuntivos.

  El ojo enucleado se monta en un soporte de acero inoxidable, con la córnea situada verticalmente. El soporte se transfiere a continuación a la cámara de un aparato de superfusión (18), donde se posiciona de manera que toda la córnea reciba el goteo de solución salina isotónica (3-4 gotas por minuto o 0.1-0,15 ml/min). Las cámaras de los aparatos de superfusión deben estar termostatizadas a 32 ± 1,5 °C. El apéndice 3 incluye un diagrama de un aparato de superfusión normal y del soporte para los ojos, que pueden obtenerse comercialmente o bien construirse en el propio laboratorio. El aparato puede modificarse para cubrir las necesidades de un laboratorio concreto (por ejemplo, para albergar un número diferente de ojos).

  Una vez colocados en el aparato de superfusión, los ojos se vuelven a examinar con un microscopio de lámpara de hendidura para asegurarse de que no han sufrido ninguna lesión durante el proceso de disección. También debe medirse en este momento el espesor de la córnea en el vértice corneal, utilizando el medidor de profundidad con el microscopio de lámpara de hendidura. Deben sustituirse los ojos que presenten: i) una puntuación de retención de fluoresceína > 0,5; ii) una opacidad corneal > 0,5; o iii) cualquier otro signo de lesión. En cuanto a los ojos que no se hayan rechazado por ninguno de estos criterios, deberán rechazarse también los ojos con un espesor de la córnea que se desvíe en más de un 10 % del valor medio de todos los ojos. Los usuarios deben ser conscientes de que con los microscopios de lámpara de hendidura pueden obtenerse diferentes mediciones del espesor de la córnea con diferentes ajustes de la anchura de la hendidura. Esta debe fijarse en 0,095 mm.

  Una vez examinados y aprobados todos los ojos, se incuban durante unos 45 o 60 minutos para estabilizarlos con el sistema de ensayo antes de administrar el producto. Tras el periodo de estabilización, se registra una medición de referencia inicial del espesor y de la opacidad de la córnea que sirva como referencia de base (es decir, a tiempo = 0). La puntuación de fluoresceína determinada en el momento de la disección se utiliza como medición de base respecto a este parámetro.

  Aplicación del producto problema

  Inmediatamente después de efectuar las mediciones de referencia iniciales, se retira el ojo (en su soporte) del aparato de superfusión, se pone en posición horizontal y se aplica a la córnea el producto problema.

  Normalmente, los productos problema líquidos se estudian sin diluir, pero, en caso necesario, pueden someterse a dilución (por ejemplo, como parte del diseño del estudio). El disolvente preferido para disolver los productos problema es la solución salina fisiológica. Sin embargo, también pueden utilizarse otros disolventes en condiciones controladas, pero es necesario demostrar la idoneidad de los disolventes que sean distintos de la solución salina fisiológica.

  Los productos problema líquidos se aplican a la córnea de forma que quede cubierta con el producto problema toda la superficie de la córnea de forma homogénea; el volumen normal es de 0,03 ml.

  Cuando sea posible, los productos problema sólidos deben triturarse de la manera más fina posible con un mortero o con otro instrumento de trituración comparable. El polvo resultante se aplica a la córnea de forma que su superficie quede cubierta uniformemente con el producto problema; la cantidad normal es de 0,03 g.

  El producto problema (líquido o sólido) se aplica durante 10 segundos y después se retira del ojo lavando con solución salina isotónica (aproximadamente 20 ml) a temperatura ambiente. El ojo (en su soporte) se vuelve a poner a continuación en el aparato de superfusión, en la posición vertical inicial. En caso necesario, podrá efectuarse un lavado adicional tras la aplicación de 10 segundos y en momentos posteriores (por ejemplo, tras el descubrimiento de residuos del producto problema en la córnea). En general, la cantidad de solución salina utilizada de forma adicional para el lavado no es determinante, pero sí es importante la observación de la adherencia del producto problema a la córnea.

  Productos testigo

  En cada experimento se deben incluir testigos en paralelo negativos (o del disolvente/vehículo) y positivos.

  Cuando se estudian líquidos al 100 % o sólidos, se utiliza solución salina fisiológica como testigo negativo en paralelo en el método de ensayo ICE a fin de detectar cambios inespecíficos del sistema de ensayo y garantizar que las condiciones del ensayo no provocan inadecuadamente una respuesta de irritación.

  Cuando se estudian líquidos diluidos, se incluye en el método de ensayo un grupo de testigo en paralelo del disolvente/vehículo a fin de detectar cambios inespecíficos del sistema de ensayo y garantizar que las condiciones del ensayo no provocan inadecuadamente una respuesta de irritación. Como se indica en el punto 31, solo pueden utilizarse los disolventes/vehículos de los que se haya demostrado que carecen de efectos adversos sobre el sistema de ensayo.

  Se incluye como testigo positivo en paralelo en cada experimento un agente irritante ocular conocido, a fin de verificar que se provoca una respuesta adecuada. Como en el presente método se utiliza el ensayo ICE para identificar agentes corrosivos o irritantes intensos, el testigo positivo debe ser un producto de referencia que induzca una respuesta intensa con este método de ensayo. No obstante, para asegurar la posibilidad de evaluar la variabilidad de las respuestas del testigo positivo a lo largo del tiempo, no debe ser excesiva la intensidad de la respuesta. Debe generarse una cantidad suficiente de datos in vitro del testigo positivo, de forma que se pueda calcular una banda aceptable, definida estadísticamente, para el testigo positivo. Si no se dispone de datos anteriores adecuados con el método de ensayo ICE respecto a un testigo positivo determinado, es posible que deban efectuarse estudios para conseguir esta información.

  Pueden citarse como ejemplo de testigos positivos para productos problema líquidos el ácido acético al 10 % o el cloruro de benzalconio al 5 %, mientras que son ejemplos de testigos positivos para productos problema sólidos el hidróxido sódico o el imidazol.

  Es útil disponer de productos de referencia para evaluar el potencial de irritación ocular de productos desconocidos dentro de una clase específica de productos, o para evaluar la capacidad de irritación relativa de un irritante ocular dentro de una gama específica de respuestas de irritación.

  Parámetros medidos

  Las córneas tratadas se evalúan antes de su tratamiento y a los 30, 75, 120, 180 y 240 minutos (± 5 minutos) después del lavado tras el tratamiento. Esta cadencia permite conseguir un número adecuado de mediciones a lo largo del periodo de tratamiento de cuatro horas, dejando tiempo suficiente entre mediciones para que puedan efectuarse las observaciones requeridas con todos los ojos.

  Los parámetros evaluados son la opacidad, la inflamación, la retención de fluoresceína y los efectos morfológicos (por ejemplo, lesiones punteadas o aflojamiento del epitelio) de la córnea. A cada uno de los tiempos antes citados se determinan todos los parámetros, salvo la retención de fluoresceína (que se determina solo antes del tratamiento y a los 30 minutos tras la exposición al producto problema).

  Se recomienda tomar fotografías para documentar la opacidad, la retención de fluoresceína, los efectos morfológicos y, en su caso, la histopatología de la córnea.

  Tras el examen final a las cuatro horas, se insta a los usuarios a conservar los ojos en un fijador adecuado (por ejemplo, formol neutro amortiguado) para su eventual examen histopatológico; pueden verse más detalles en el punto 14 y la referencia (8).

  La inflamación de la córnea se determina mediante mediciones del espesor de la córnea efectuadas con un paquímetro óptico en un microscopio de lámpara de hendidura. Se expresa en porcentaje y se calcula con la fórmula siguiente a partir de las mediciones del espesor de la córnea:

  

  Se calcula el porcentaje medio de inflamación de la córnea de todos los ojos del ensayo a todos los tiempos de observación. A partir de la mayor puntuación media de inflamación de la córnea, observada a cualquiera de los tiempos seleccionados, se adjudica a cada producto problema una puntuación global de categoría (véase el punto 51).

  La opacidad de la córnea se evalúa utilizando el área de esta que se encuentra opacificada más densamente para establecer la puntuación tal como se muestra en el cuadro 1. Se calcula el valor medio de opacidad de la córnea de todos los ojos del ensayo a todos los tiempos de observación. A partir de la mayor puntuación media de opacidad de la córnea, observada a cualquiera de los tiempos seleccionados, se adjudica a cada producto problema una puntuación global de categoría (véase el punto 51).

  Cuadro 1.

  Puntuaciones de opacidad de la córnea.

  Puntuación	Observación
  0	Sin opacidad
  0,5	Opacidad muy débil
  1	Zonas diseminadas o difusas; los detalles del iris se aprecian con claridad.
  2	Zona translúcida fácilmente discernible; los detalles del iris están ligeramente oscurecidos.
  3	Opacidad de la córnea intensa; no se ve ningún detalle preciso del iris; el tamaño de la pupila es apenas discernible.
  4	Opacidad de la córnea completa; iris invisible

  La retención de fluoresceína se evalúa al tiempo de observación de 30 minutos únicamente, como se muestra en el cuadro 2. El valor medio de retención de fluoresceína de todos los ojos del ensayo se calcula entonces al tiempo de observación de 30 minutos, y se utiliza para obtener la puntuación global de categoría asignada a cada producto problema (véase el punto 51).

  Cuadro 2.

  Puntuaciones de retención de fluoresceína.

  Puntuación	Observación
  0	Sin retención de fluoresceína
  0,5	Tinción muy débil de células aisladas
  1	Tinción de células aisladas dispersas por toda el área tratada de la córnea
  2	Tinción densa de células aisladas focalizada o confluente
  3	Fluoresceína retenida en grandes áreas confluentes de la córnea

  Entre los efectos morfológicos figuran el «punteamiento» de las células del epitelio corneal, el «aflojamiento» del epitelio, la «rugosidad» de la superficie corneal y el «pegado» del producto problema a la córnea. Estas observaciones pueden presentar una intensidad variable y darse simultáneamente. La clasificación de estas observaciones es subjetiva, según la interpretación del investigador.

  DATOS E INFORME

  Evaluación de los datos

  Los resultados de la opacidad de la córnea, de la inflamación y de la retención de fluoresceína deben evaluarse por separado a fin de llegar a una clasificación ICE para cada parámetro. Las clases ICE de cada parámetro se combinan a continuación para generar una clasificación según la capacidad de irritación de cada producto problema.

  Criterios de decisión

  Una vez evaluado cada uno de los parámetros, pueden asignarse las clases ICE en función de unas bandas predeterminadas. La interpretación de la inflamación (cuadro 3), la opacidad (cuadro 4), y la retención de fluoresceína (cuadro 5) de la córnea utilizando cuatro clases ICE se efectúa según las siguientes escalas. Es importante señalar que las puntuaciones de inflamación de la córnea que figuran en el cuadro 3 se pueden aplicar solo si el espesor se mide con un microscopio de lámpara de hendidura (por ejemplo, Haag-Streit BP900) con dispositivo medidor de profundidad nº 1 y ajuste de la anchura de la hendidura a 9 , lo que equivale a 0,095 mm. Los usuarios deben ser conscientes de que con los microscopios de lámpara de hendidura pueden obtenerse diferentes mediciones del espesor de la córnea si son diferentes los ajustes de la anchura de la hendidura.

  Cuadro 3.

  Criterios de clasificación ICE según la inflamación de la córnea.

  Inflamación media de la córnea (%) (15)	Clase ICE
  0 a 5	I
  > 5 a 12	II
  > 12 a 18 (> 75 min tras el tratamiento)	II
  > 12 a 18 (≤ 75 min tras el tratamiento)	III
  > 18 a 26	III
  > 26 a 32 (> 75 min tras el tratamiento)	III
  > 26 a 32 (≤ 75 min tras el tratamiento)	IV
  > 32	IV

  Cuadro 4.

  Criterios de clasificación ICE según la opacidad.

  Máxima puntuación media de la opacidad (16)	Clase ICE
  0,0-0,5	I
  0,6-1,5	II
  1,6-2,5	III
  2,6-4,0	IV

  Cuadro 5.

  Criterios de clasificación ICE según la retención media de fluoresceína.

  Puntuación media de la retención de fluoresceína a los 30 minutos tras el tratamiento (17)	Clase ICE
  0,0-0,5	I
  0,6-1,5	II
  1,6-2,5	III
  2,6-3,0	IV

  La clasificación in vitro de un producto problema se evalúa leyendo la clasificación del SGA correspondiente a la combinación de categorías obtenidas con la inflamación de la córnea, la opacidad de la córnea y la retención de fluoresceína, tal como se describe en el cuadro 6.

  Cuadro 6.

  Clasificaciones in vitro globales.

  Clasificación del SGA de las Naciones Unidas	Combinaciones de los tres parámetros
  Sin categoría	3 × I 2 × I, 1 × II
  No puede hacerse ninguna predicción	Otras combinaciones
  Categoría 1	3 × IV   2 × IV, 1 × III   2 × IV, 1 × II (18)   2 × IV, 1 × I (18)   Opacidad de la córnea ≥ 3 a los 30 min (en al menos dos ojos)   Opacidad de la córnea = 4 a cualquier tiempo (en al menos dos ojos)   Aflojamiento intenso del epitelio (en al menos un ojo)

  Criterios de aceptación del estudio

  Se considera que un ensayo es aceptable si los testigos negativos o del vehículo/disolvente en paralelo y los testigos positivos en paralelo se identifican como sin clasificar en el SGA y en la categoría 1 del SGA, respectivamente.

  Informe del ensayo

  El informe del ensayo debe incluir la siguiente información, en caso de que corresponda a la realización del estudio:

  • Productos problema y testigo
    • - Denominación o denominaciones químicas, como la denominación estructural utilizada por el Chemical Abstracts Service (CAS), seguida por otras denominaciones, si se conocen;
    • - número de registro CAS, si se conoce;
    • - pureza y la composición de los productos problema/testigo (en porcentajes en peso), en la medida en que se disponga de esta información;
    • - propiedades físico-químicas pertinentes para la realización del estudio, como estado físico, volatilidad, pH, estabilidad, clase química o hidrosolubilidad;
    • - tratamiento de los productos problema y testigo antes del ensayo, en su caso (por ejemplo, calentamiento, trituración);
    • - estabilidad, si se conoce.
  • Información referente al promotor y al laboratorio
    • - Nombre y dirección del promotor, laboratorio y director del estudio;
    • - identificación de la fuente de los ojos (es decir, instalación en la que se han recogido).
  • Condiciones del método de ensayo
    • - Descripción del sistema de ensayo utilizado;
    • - microscopio de lámpara de hendidura utilizado (por ejemplo, modelo) y ajustes instrumentales de este;
    • - referencia a resultados históricos de testigos positivos y negativos y, si procede, a datos históricos que demuestren bandas aceptables de testigos de referencia en paralelo;
    • - procedimiento utilizado para garantizar la integridad (es decir, la exactitud y la fiabilidad) del método de ensayo a lo largo del tiempo (por ejemplo, ensayo periódico de productos de la prueba de aptitud).
  • Recogida y preparación de los ojos
    • - Edad y peso del animal donante y, si están disponibles, otras características específicas de los animales de los que se han extraído los ojos (por ejemplo, sexo, cepa);
    • - condiciones de almacenamiento y transporte de los ojos (por ejemplo, fecha y hora de recogida de los ojos, plazo transcurrido entre la recogida de las cabezas de pollo y la colocación de los ojos enucleados en la cámara de superfusión);
    • - preparación y montaje de los ojos, con inclusión de declaraciones sobre su calidad, temperatura de las cámaras de los ojos, y criterios de selección de los ojos utilizados para los ensayos.
  • Procedimiento
    • - Número de réplicas utilizadas;
    • - identidad de los testigos positivos y negativos utilizados (en su caso, también los testigos de disolvente y de referencia);
    • - dosis del producto problema, aplicación y tiempo de exposición utilizados;
    • - tiempos de observación (antes y después del tratamiento);
    • - Descripción de los criterios de evaluación y decisión seguidos;
    • - Descripción de los criterios de aceptación del estudio seguidos;
    • - Descripción de las eventuales modificaciones del procedimiento del ensayo.
  • Resultados
    • - Tabulación de las puntuaciones de inflamación, opacidad y retención de fluoresceína de la córnea, obtenidas en cada ojo y a cada tiempo de observación, incluidas las puntuaciones medias a cada tiempo de observación de todos los ojos estudiados;
    • - media más elevada de las puntuaciones observadas de inflamación, opacidad y retención de fluoresceína de la córnea (a cualquier tiempo), y su correspondiente clasificación ICE;
    • - descripción de otros eventuales efectos observados;
    • - la clasificación del SGA in vitro derivada;
    • - en su caso, fotografías del ojo.
  • Discusión de los resultados
  • Conclusión

  BIBLIOGRAFÍA

  • (1) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponible en: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.
  • (2) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Disponible en: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
  • (3) ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report - Current Status of in vitro Test Methods for Identifying Mild/Moderate Ocular Irritants: The Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Disponible en: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.
  • (4) Naciones Unidas (2011). Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos (SGA), cuarta edición revisada, Naciones Unidas, Nueva York y Ginebra, 2011. Disponible en: https://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/Spanish/ST-SG-AC10-30-Rev4sp.pdf.
  • (5) Streamlined Summary Document Supporting OECD Test Guideline 438 on the Isolated Chicken Eye for Eye Irritation/Corrosion. Series on Testing and Assessment no. 188 (Part 1 and Part 2), OECD, Paris.
  • (6) Capítulo B.5 del presente anexo, Toxicidad aguda: irritación/corrosión cutánea.
  • (7) Scott L, Eskes C, Hoffman S, Adriaens E, Alepee N, Bufo M, Clothier R, Facchini D, Faller C, Guest R, Hamernik K, Harbell J, Hartung T, Kamp H, Le Varlet B, Meloni M, Mcnamee P, Osborn R, Pape W, Pfannenbecker U, Prinsen M, Seaman C, Spielmann H, Stokes W, Trouba K, Vassallo M, Van den Berghe C, Van Goethem F, Vinardell P, Zuang V (2010). A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-up and Top-down Approaches. Toxicology In Vitro 24, 1-9.
  • (8) OCDE (2011). Guidance Document on “The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods”: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-Severe Irritants. Series on Testing and Assessment no. 160, OECD, Paris.
  • (9) ICCVAM (2006). Background review document: Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Disponible en: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm.
  • (10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.
  • (11) DB-ALM (INVITTOX) (2009). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET) / Isolated Chicken Eye Test, 13pp. Disponible en: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/.
  • (12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871-929.
  • (13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.
  • (14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.
  • (15) Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicology in Vitro 20,78-81.
  • (16) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Disponible en: http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf.
  • (17) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.
  • (18) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.

  Apéndice 1

  DEFINICIONES

  Exactitud : Grado de coincidencia entre los resultados obtenidos con el método de ensayo y los valores de referencia aceptados. Se trata de una medida del comportamiento del método de ensayo y es un aspecto de su “pertinencia”. Este término y el de “concordancia” se suelen usar indistintamente para indicar la proporción de resultados correctos de un método de ensayo.

  Producto de referencia : Producto utilizado como patrón para comparar con un producto problema. Los productos de referencia deben presentar las siguientes propiedades: i) un origen coherente y fiable; ii) similitud estructural y funcional con la clase de productos problema; iii) características físicas y químicas conocidas; iv) datos de apoyo sobre los efectos conocidos; y v) potencia conocida en la banda de la respuesta deseada.

  Planteamiento ascendente : Enfoque gradual utilizado para un producto del que se sospecha que no requiere clasificación por irritación ocular o lesiones oculares graves, que comienza con la determinación de los productos que no requieren clasificación (resultado negativo) frente a otros productos (resultado positivo).

  Producto : Sustancia o mezcla.

  Córnea : Parte transparente delantera del globo ocular que cubre el iris y la pupila y permite el paso de la luz al interior.

  Opacidad de la córnea : Medida del grado de opacidad de la córnea tras su exposición a un producto problema. Un aumento de la opacidad de la córnea indica que esta ha sufrido una lesión.

  Inflamación de la córnea : Medición objetiva en el ensayo ICE de la magnitud de la dilatación de la córnea tras su exposición a un producto problema. Se expresa en porcentaje y se calcula a partir de las mediciones del espesor de la córnea de base (antes de la administración del producto) y de los espesores registrados a intervalos regulares tras la exposición al producto problema en el ensayo ICE. El grado de inflamación de la córnea indica las lesiones que esta ha sufrido.

  Irritación ocular : Producción de cambios en el ojo, como consecuencia de la aplicación de un producto problema en la superficie anterior del ojo, que son totalmente reversibles en los 21 días siguientes a la aplicación. Intercambiable con “efectos reversibles en el ojo” y con “categoría 2 del SGA de las Naciones Unidas” (4).

  Tasa de falsos negativos : Proporción de todos los productos positivos identificados erróneamente como negativos por un método de ensayo. Es uno de los indicadores del comportamiento del método de ensayo.

  Tasa de falsos positivos : Proporción de todos los productos negativos identificados erróneamente como positivos por un método de ensayo. Es uno de los indicadores del comportamiento del método de ensayo.

  Retención de fluoresceína : Medición subjetiva en el ensayo ICE de la cantidad de fluoresceína sódica retenida por las células epiteliales de la córnea tras la exposición de esta a una sustancia problema. El grado de retención de fluoresceína indica las lesiones que ha sufrido el epitelio de la córnea.

  Peligro : Propiedad inherente de un agente o situación que tiene capacidad para provocar efectos adversos cuando un organismo, sistema o (sub)población se expone a dicho agente.

  Efectos irreversibles en el ojo : Véanse “lesiones oculares graves” y “categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas”.

  Mezcla : Mezcla o solución compuesta por dos o más sustancias que no reaccionan (4)

  Testigo negativo : Muestra replicada no tratada que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo. Esta muestra se somete al mismo proceso que las muestras tratadas con producto problema y otras muestras testigo para determinar si el disolvente interactúa con el sistema de ensayo.

  Sin clasificar : Sustancia que no está clasificada por irritación ocular (categoría 2 del SGA de las Naciones Unidas) ni por lesión ocular grave (categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas). Intercambiable con “sin categoría del SGA de las Naciones Unidas”.

  Testigo positivo : Muestra replicada que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo y que se trata con un producto del que se sabe que induce una respuesta positiva. Para asegurar la posibilidad de evaluar la variabilidad de las respuestas del testigo positivo a lo largo del tiempo, no debe ser excesiva la intensidad de la respuesta.

  Fiabilidad : Medida del grado en que un método de ensayo puede aplicarse de forma reproducible a lo largo del tiempo, en un mismo laboratorio y en distintos laboratorios, utilizando el mismo protocolo. Se evalúa calculando la reproducibilidad intra e interlaboratorios y la repetibilidad intralaboratorios.

  Efectos reversibles en el ojo : Véanse “irritación ocular” y “categoría 2 del SGA de las Naciones Unidas”.

  Lesiones oculares graves : Producción de una lesión tisular en el ojo o una degradación física severa de la vista, como consecuencia de la aplicación de un producto problema en la superficie anterior del ojo, y que no es totalmente reversible en los 21 días siguientes a la aplicación. Intercambiable con “efectos irreversibles en el ojo” y con “categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas” (4).

  Microscopio de lámpara de hendidura : Instrumento utilizado para examinar directamente el ojo con el aumento de un microscopio binocular creando una imagen estereoscópica en vertical. En el método de ensayo ICE, este instrumento se utiliza para ver las estructuras anteriores del ojo del pollo, así como para medir objetivamente el espesor de la córnea con ayuda de un medidor de profundidad.

  Testigo del disolvente/vehículo : Muestra no tratada que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo, incluido el disolvente o vehículo, y que se somete al mismo proceso que las muestras tratadas con producto problema y otras muestras testigo a fin de determinar la respuesta de base correspondiente a las muestras tratadas con el producto problema disuelto en el mismo disolvente o vehículo. Cuando se somete a ensayo con un testigo negativo en paralelo, esta muestra pone de manifiesto también si el disolvente o vehículo interactúa con el sistema de ensayo.

  Sustancia : Elementos químicos y sus compuestos en estado natural u obtenidos mediante cualquier proceso de producción, incluidos los aditivos necesarios para mantener la estabilidad del producto y las impurezas derivadas del proceso empleado, pero excluidos los disolventes que se puedan separar sin afectar a la estabilidad de la sustancia ni cambiar su composición (4).

  Tensioactivo : También denominado agente tensioactivo, es una sustancia, como un detergente, que puede reducir la tensión superficial de un líquido y, de este modo, permitir que forme espuma o penetre en los sólidos; se conoce también como agente humectante.

  Enfoque descendente : Enfoque gradual utilizado para un producto del que se sospecha que causa lesiones oculares graves, que comienza con la determinación de los productos que inducen lesiones oculares graves (resultado positivo) frente a otros productos (resultado negativo).

  Producto problema : Toda sustancia o mezcla sometida a ensayo con este método de ensayo.

  Estrategia de ensayos escalonados : Estrategia de ensayo por fases, en la que se revisa toda la información existente sobre un producto problema, siguiendo un orden especificado, en un proceso de ponderación de las pruebas en cada escalón, a fin de determinar si se dispone de información suficiente para tomar una decisión sobre la clasificación de un peligro, antes de pasar al escalón siguiente. Si puede establecerse la capacidad de irritación de un producto problema con la información disponible, no hace falta efectuar más ensayos. Si no puede establecerse la capacidad de irritación de un producto problema con la información disponible, se aplica un procedimiento secuencial de ensayos con animales por fases hasta que pueda efectuarse una clasificación inequívoca.

  Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos de las Naciones Unidas (SGA de la ONU) : Sistema que propone la clasificación de productos químicos (sustancias y mezclas) según tipos y niveles normalizados de peligros físicos, sanitarios y ambientales, y que hace referencia a los elementos correspondientes de comunicación, como pictogramas, palabras de advertencia, indicaciones de peligro, consejos de prudencia, y fichas de datos de seguridad, a efectos de proporcionar información sobre sus efectos adversos con el fin de proteger a la población (incluidos empresarios, trabajadores, transportistas, consumidores y personal de protección civil) y al medio ambiente (4)

  Categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas : Véase “lesiones oculares graves” o “efectos irreversibles en el ojo”.

  Categoría 2 del SGA de las Naciones Unidas : Véase “irritación ocular” o “efectos reversibles en el ojo”.

  Sin categoría del SGA de las Naciones Unidas : Sustancias que no cumplen los requisitos para clasificarse en la categoría 1 o 2 (2A o 2B) del SGA de las Naciones Unidas. Intercambiable con “sin clasificar”.

  Método de ensayo validado : Método de ensayo sobre el cual se han completado estudios de validación para determinar su pertinencia (incluida su exactitud) y su fiabilidad con un fin específico. Es importante señalar que un método de ensayo validado puede tener un comportamiento insuficiente en términos de exactitud y fiabilidad como para considerarse aceptable a efectos del fin propuesto.

  Ponderación de las pruebas : Proceso de consideración de los aspectos favorables y desfavorables de los distintos elementos de información a efectos de alcanzar y confirmar una conclusión en cuanto al peligro potencial de un producto.

  Apéndice 2 PRODUCTOS UTILIZADOS PARA DEMOSTRAR LA APTITUD CON EL MÉTODO DE ENSAYO ICE

  Antes de proceder al uso sistemático de un método de ensayo que siga este modelo, los laboratorios deben demostrar su aptitud técnica, identificando correctamente la clasificación de los trece productos recomendados del cuadro 1 en cuanto al peligro para los ojos. Estos productos se seleccionaron para representar la gama de respuestas en cuanto a los peligros para los ojos sobre la base de los resultados del ensayo in vivo con ojo de conejo (TG 405) y el sistema de clasificación SGA de las Naciones Unidas (es decir, categorías 1, 2A, 2B, o sin clasificar según dicho sistema) (4). Otros criterios de selección fueron el que los productos estuvieran disponibles en el mercado, que tuvieran datos de referencia in vivo de alta calidad y también datos in vitro de alta calidad obtenidos con el método de ensayo ICE. Se encuentran datos de referencia en el documento SSD (5) y en el documento de revisión de fondo del ICCVAM sobre el método de ensayo ICE (9).

  Cuadro 1

  Productos recomendados para demostrar la aptitud técnica con el método ICE

  Producto	CAS RN	Clase química (19)	Estado físico	Clasificación in vivo   (20)	Clasificación in vitro   (21)
  Cloruro de benzalconio (5 %)	8001-54-5	Compuesto onio	Líquido	Categoría 1	Categoría 1
  Clorhexidina	55-56-1	Amina, amidina	Sólido	Categoría 1	Categoría 1
  Ácido dibenzoil-L-tartárico	2743-38-6	Ácido carboxílico, éster	Sólido	Categoría 1	Categoría 1
  Imidazol	288-32-4	Heterociclo	Sólido	Categoría 1	Categoría 1
  Ácido tricloroacético (30 %)	76-03-9	Ácido carboxílico	Líquido	Categoría 1	Categoría 1
  Cloruro de 2,6-diclorobenzoílo	4659-45-4	Haluro de acilo	Líquido	Categoría 2 A	No se puede predecir (22) .
  Nitrato de amonio	6484-52-2	Sal inorgánica	Sólido	Categoría 2A (23)	No se puede predecir (22) .
  2-Metil-acetoacetato de etilo	609-14-3	Cetona, éster	Líquido	Categoría 2 B	No se puede predecir (22) .
  Dimetilsulfóxido	67-68-5	Compuestos orgánicos de azufre	Líquido	Sin categoría	Sin categoría
  Glicerol	56-81-5	Alcohol	Líquido	Sin categoría	Sin categoría (límite)
  Metilciclopentano	96-37-7	Hidrocarburo (cíclico)	Líquido	Sin categoría	Sin categoría
  n-Hexano	110-54-3	Hidrocarburo (acíclico)	Líquido	Sin categoría	Sin categoría
  Triacetina	102-76-1	Lípido	Líquido	Sin clasificar	Sin categoría
  Abreviaturas: CAS RN: número de registro del Chemical Abstracts Service.

  Apéndice 3 DIAGRAMAS DEL APARATO DE SUPERFUSIÓN Y DEL SOPORTE PARA LOS OJOS (Burton et al. (18) ofrecen descripciones genéricas adicionales del aparato de superfusión y del soporte para los ojos)

  

  N.º de elemento	Descripción	N.º de elemento	Descripción
  1	Salida de agua caliente	9	Compartimento
  2	Puerta corredera	10	Soporte para el ojo
  3	Aparato de superfusión	11	Ojo de pollo
  4	Instrumento de medición óptica	12	Salida de solución salina
  5	Entrada de agua caliente	13	Tornillo de tope
  6	Solución salina	14	Brazo superior ajustable
  7	Agua caliente	15	Brazo inferior fijo
  8	Entrada de solución salina	»

• 14) En la parte B, el capítulo B.49 se sustituye por el texto siguiente:

  « B.49
  
  Ensayo de micronúcleos en células de mamífero in vitro

  INTRODUCCIÓN

  El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE 487 (2016). Forma parte de una serie de métodos de ensayo sobre toxicología genética. Se ha elaborado un documento de la OCDE que aporta información sucinta sobre los ensayos de toxicología genética y una síntesis de los recientes cambios aportados a dichas directrices de ensayo (1).

  El ensayo de micronúcleos in vitro (MNvit) es un ensayo de genotoxicidad para la detección de micronúcleos (MN) en el citoplasma de células en interfase. Los micronúcleos pueden proceder de fragmentos cromosómicos acéntricos (es decir, que carecen de centrómero) o de cromosomas completos que no pueden migrar a los polos durante la anafase de la división celular. Por tanto, el ensayo MNvit es un método in vitro que proporciona una base completa para investigar in vitro el potencial de causar lesiones cromosómicas porque permite detectar tanto anéugenos como clastógenos (2) (3) en células que han sufrido división celular durante la exposición al producto problema o tras ella (véanse más detalles en el punto 13). Los micronúcleos representan una lesión que se ha transmitido a las células hijas, mientras que las aberraciones cromosómicas registradas en las células en metafase pueden no transmitirse. En ambos casos, los cambios pueden no ser compatibles con la supervivencia de las células.

  El presente método de ensayo permite el uso de protocolos con y sin citocalasina B (citoB), que es un inhibidor de la polimerización de la actina. La adición de citoB antes de la mitosis provoca la formación de células binucleadas, con lo que permite la identificación y análisis de micronúcleos solo en las células que han completado una única mitosis (4) (5). Este método de ensayo contempla también el uso de protocolos sin bloqueo de la citocinesis, siempre que haya pruebas de que la población celular analizada ha experimentado la mitosis.

  Además de utilizar el ensayo MNvit para identificar productos que inducen la formación de micronúcleos, el uso del etiquetado inmunoquímico de cinetocoros, o de la hibridación con sondas centroméricas o teloméricas [hibridación fluorescente in situ (FISH)], puede aportar también información adicional sobre los mecanismos del daño cromosómico y de la formación de micronúcleos (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17). Dichos procedimientos de etiquetado e hibridación pueden utilizarse cuando hay un aumento en la formación de micronúcleos y el investigador desea determinar si el aumento es consecuencia de fenómenos clastogénicos o aneugénicos.

  Debido a que los micronúcleos de las células en interfase pueden evaluarse de forma relativamente objetiva, el personal de laboratorio solamente tiene que determinar el número de células binucleadas cuando se emplea citoB y la incidencia de las células micronucleadas en todos los casos. Como resultado, los portaobjetos pueden evaluarse de forma relativamente rápida y el análisis puede automatizarse. Esto hace que sea factible evaluar miles en lugar de cientos de células por tratamiento, lo que aumenta la potencia del ensayo. Finalmente, como los micronúcleos pueden derivarse de cromosomas retardados, existe la posibilidad de detectar agentes inductores de aneuploidía que son difíciles de estudiar en ensayos convencionales de aberraciones cromosómicas como, por ejemplo, el del capítulo B.10 del presente anexo (18). Sin embargo, el ensayo MNvit descrito en el presente método de ensayo no permite diferenciar los productos que inducen cambios en el número de cromosomas o en la ploidía de aquellos que inducen efectos clastogénicos sin recurrir a técnicas especiales como la FISH mencionada en el punto 4.

  El ensayo MNvit es sólido y puede aplicarse a una diversidad de tipos celulares, y tanto en presencia como en ausencia de citoB. Hay muchos datos que apoyan la validez del ensayo MNvit recurriendo a diferentes tipos de células (cultivos de líneas celulares o cultivos primarios de células) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36). Aquí se incluyen, en particular, los estudios internacionales de validación coordinados por la Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (19) (20) (21) (22) (23) y los informes del International Workshop on Genotoxicity Testing (5) (17). Los datos disponibles también se han vuelto a evaluar en un estudio de validación retrospectiva con ponderación de los datos, por parte del Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (CEVMA) de la Comisión Europea (CE), y el método de ensayo ha sido avalado en cuanto a su validez científica por el Comité Científico Consultivo del CEVMA (ESAC) (37) (38) (39).

  El ensayo MNvit en células de mamífero puede emplear cultivos de líneas celulares o cultivos primarios de células humanas o de roedores. Como la frecuencia de fondo de la formación de micronúcleos influye en la sensibilidad del ensayo, se recomienda la utilización de tipos celulares con una frecuencia de fondo de micronúcleos que sea estable y definida. Las células utilizadas deben seleccionarse sobre la base de su capacidad de crecer bien en cultivo, la estabilidad de su cariotipo (incluido el número de cromosomas) y su frecuencia espontánea de micronúcleos (40). Por el momento, los datos de que se dispone no permiten formular recomendaciones firmes pero sugieren que es importante, a la hora de evaluar los peligros químicos, examinar la situación de la proteína p53, la estabilidad genética (cariotipo), la capacidad de reparación del ADN y el origen (roedores frente a hombre) de las células elegidas para el ensayo. Se recomienda, pues, a los usuarios de este método de ensayo que consideren la influencia de estas y otras características de las células sobre el comportamiento de una línea celular en cuanto a la detección de la inducción de la formación de micronúcleos, ya que la situación de los conocimientos en este ámbito está evolucionando.

  En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.

  CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES

  Los ensayos realizados in vitro suelen exigir la utilización de una fuente exógena de activación metabólica, salvo que las células sean competentes metabólicamente respecto a los productos problema. El sistema exógeno de activación metabólica no reproduce completamente las condiciones in vivo. Deben evitarse las condiciones que puedan conducir a resultados positivos falsos, que no reflejen la genotoxicidad de los productos problema; tales condiciones incluyen cambios en el pH (41) (42) (43) o en la osmolalidad, la interacción con el medio de cultivo (44) (45) o unos niveles excesivos de citotoxicidad (véase el punto 29).

  Para analizar la inducción de la formación de micronúcleos, es fundamental que haya habido mitosis en los cultivos tanto tratados como sin tratar. La fase que proporciona más información para evaluar la formación de micronúcleos es la de las células que han completado una sola mitosis durante el tratamiento con el producto problema, o después de este tratamiento. En caso de nanomateriales fabricados, es necesario recurrir a adaptaciones específicas del presente método de ensayo, pero estas no se describen aquí.

  Antes de la utilización del método de ensayo con una mezcla para obtener datos con fines reglamentarios, debe considerarse si podría proporcionar resultados adecuados a tal fin y, en caso afirmativo, por qué. Tales consideraciones no son necesarias si la reglamentación impone el ensayo de la mezcla.

  PRINCIPIO DEL ENSAYO

  Los cultivos celulares de origen humano o de otros mamíferos se exponen al producto problema tanto con fuente exógena de activación metabólica como sin ella, salvo que se utilicen células con una capacidad adecuada de metabolización (véase el punto 19).

  Durante la exposición al producto problema, o después de ella, las células se cultivan durante un tiempo suficiente para permitir que las lesiones cromosómicas u otros efectos sobre los ciclos o divisiones celulares provoquen la formación de micronúcleos en las células en interfase. Para la inducción de aneuploidía, es necesario normalmente que el producto problema esté presente durante la mitosis. Las células en interfase se recogen, se tiñen y se analizan para detectar la presencia de micronúcleos. Lo ideal es que los micronúcleos se evalúen solamente en las células que hayan completado la mitosis durante la exposición al producto problema o durante el período tras el tratamiento, en su caso. En los cultivos que se hayan tratado con un bloqueante de la citocinesis, esto se consigue fácilmente evaluando solo las células binucleadas. En ausencia de bloqueante de la citocinesis, es importante demostrar la probabilidad de que las células analizadas hayan experimentado la división celular, sobre la base de un aumento de la población celular, durante la exposición al producto problema o tras ella. En relación con todos los protocolos, es importante demostrar que ha habido proliferación celular en los cultivos tanto tratados como de testigo, y el grado de citotoxicidad o citostasis inducido por el producto problema debe estimarse en todos los cultivos que se examinan para evaluar la presencia de micronúcleos.

  DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

  Células

  Pueden utilizarse cultivos primarios de linfocitos de sangre periférica de hombre o de otros mamíferos (7) (20) (46) (47) y una serie de líneas celulares de roedor, tales como las células CHO, V 79, CHL/IU y L5178Y, o líneas celulares humanas tales como TK6 (19) (20) (21) (22) (23) (26) (27) (28) (29) (31) (33) (34) (35) (36) (véase el punto 6). Se han utilizado para el ensayo de micronúcleos otras líneas celulares, tales como las HT29 (48), Caco-2 (49), HepaRG (50) (51), HepG2 (52) (53), A549 y células primarias de embrión de hámster sirio (54), pero por el momento no se han validado ampliamente. Por tanto, el uso de estos tipos y líneas celulares debe justificarse por la demostración de su comportamiento en el ensayo, como se describe en la sección de criterios de aceptabilidad. Se ha informado de que la citoB puede afectar al crecimiento de las células L5178Y, por lo que no se recomienda utilizarla con esta línea celular (23). Cuando se utilizan células primarias, por razones de bienestar animal debe considerarse la utilización de células de origen humano, cuando sea viable y se tomen de conformidad con los principios éticos humanos y la reglamentación.

  Los linfocitos de sangre periférica humana deben obtenerse de individuos jóvenes (aproximadamente de 18 a 35 años de edad), no fumadores, sin enfermedades conocidas ni exposiciones recientes a agentes genotóxicos (por ejemplo, productos, radiaciones ionizantes) a niveles que puedan aumentar la incidencia de fondo de las células micronucleadas. Esto garantizaría una incidencia de fondo de las células micronucleadas baja y constante. La incidencia de base de las células micronucleadas aumenta con la edad y esta tendencia es más pronunciada en las mujeres que en los varones (55). Si se combinan células procedentes de más de un donante, debe especificarse el número de donantes. Es necesario demostrar que las células se han dividido entre el inicio de la administración del producto problema y la recolección de las células. Los cultivos celulares se mantienen en fase exponencial de crecimiento (líneas celulares) o se estimulan para que se dividan (cultivos primarios de linfocitos), a fin de exponer las células en diferentes fases del ciclo celular, ya que es posible que no se conozca la sensibilidad de las distintas fases celulares a los productos problema. Las células primarias que es preciso estimular con agentes mitogénicos para que se dividan dejan generalmente de estar sincronizadas durante la exposición al producto problema (por ejemplo, los linfocitos humanos tras una estimulación mitogénica de 48 horas). La utilización de células sincronizadas durante el tratamiento con el producto problema no es recomendable, pero puede aceptarse si está justificada.

  Medios y condiciones de cultivo

  Para el mantenimiento de los cultivos deben utilizarse medios de cultivo y condiciones de incubación adecuados (recipientes de cultivo, atmósfera humidificada y con 5 % de CO₂ en su caso, temperatura de 37 °C). Las líneas celulares deben examinarse sistemáticamente para comprobar la estabilidad del número modal de cromosomas y la ausencia de contaminación por Mycoplasma, y no deben utilizarse las células que se contaminen o que presenten un cambio en el número modal de cromosomas. Debe determinarse la duración del ciclo celular normal de las líneas celulares o cultivos primarios utilizados en el laboratorio de ensayo, la cual debe ser coherente con las características celulares publicadas.

  Preparación de los cultivos

  Líneas celulares: las células se propagan a partir de cultivos madre, se siembran en el medio de cultivo a una densidad tal que las células en suspensión o en monocapas sigan creciendo exponencialmente hasta el momento de la recolección (por ejemplo, debe evitarse la confluencia de las células cultivadas en monocapas).

  Linfocitos: se cultiva (p.ej., durante 48 horas en el caso de los linfocitos humanos) sangre completa tratada con anticoagulante (p. ej., heparina) o bien linfocitos separados en presencia de un mitógeno [p. ej., fitohemaglutinina (PHA) en el caso de los linfocitos humanos] a fin de inducir la división celular antes de la exposición al producto problema y a citoB.

  Activación metabólica

  Se debe recurrir a sistemas de metabolización exógenos cuando se utilizan células con una capacidad metabólica endógena inadecuada. El sistema utilizado con más frecuencia que se recomienda por defecto, salvo que se justifique otro sistema, es una fracción postmitocondrial (S9) a la que se añaden cofactores y que se obtiene a partir del hígado de roedores (generalmente ratas) tratados con inductores enzimáticos como el aroclor 1254 (56) (57) o una combinación de fenobarbital y b-naftoflavona (58) (59) (60). Esta última combinación no infringe el Convenio de Estocolmo sobre contaminantes orgánicos persistentes (61), y se ha visto que es tan efectiva como el aroclor 1254 para inducir oxidasas de función mixta (58) (59) (60). La fracción S9 se utiliza normalmente a concentraciones que varían entre el 1 y el 2 % (v/v), pero pueden aumentarse hasta el 10 % (v/v) en el medio de ensayo final. Debe evitarse durante el tratamiento el uso de productos que reduzcan el índice mitótico, especialmente productos que acomplejen el calcio (62). La elección del tipo y de la concentración del sistema exógeno de activación metabólica o del inductor metabólico utilizado puede estar influida por la clase de los productos que se someten a ensayo.

  Preparación del producto problema

  Los productos problema sólidos deben prepararse en disolventes adecuados y, si es conveniente, diluirse antes de tratar las células. Los productos problema líquidos pueden añadirse directamente al sistema de ensayo o diluirse antes del tratamiento del sistema de ensayo. Los productos problema gaseosos o volátiles deben someterse a ensayo aplicando modificaciones adecuadas a los protocolos normales, tales como el tratamiento en recipientes de cultivo sellados (63) (64) (65). La preparación del producto problema debe hacerse justo antes del tratamiento, salvo que se cuente con datos de estabilidad que avalen la posibilidad de su conservación.

  Condiciones del ensayo

  Disolventes

  El disolvente debe elegirse para optimizar la solubilidad de los productos problema sin tener impacto negativo en la realización del ensayo, es decir, cambiar el crecimiento celular, afectar a la integridad del producto problema, reaccionar con los recipientes de cultivo, o interferir con el sistema de activación metabólica. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente (o medio de cultivo) acuoso. Son disolventes bien establecidos el agua o el dimetilsulfóxido (DMSO). En general, los disolventes orgánicos no deben exceder del 1 % (v/v). Si se disuelve la citoB en DMSO, el conjunto de disolvente orgánico utilizado para el producto problema y para la citoB no debe superar el 1 % (v/v); en caso contrario, deben utilizarse testigos sin tratar, a fin de garantizar que el porcentaje de disolvente orgánico no tiene ningún efecto adverso. Los disolventes acuosos (solución salina o agua) no deben superar el 10 % (v/v) en el medio de tratamiento final. Si se utilizan disolventes distintos de los que están bien establecidos (por ejemplo, etanol o acetona), debe disponerse de datos justificativos que indiquen su compatibilidad con el sistema de ensayo y el producto problema, y su ausencia de toxicidad genética a la concentración utilizada. En ausencia de estos datos justificativos, es importante incluir testigos sin tratar (véase el apéndice 1), así como testigos del disolvente para demostrar que el disolvente elegido no induce efectos nocivos ni cromosómicos (p. ej., aneuploidía o clastogenicidad).

  Utilización de citoB como bloqueante de la citocinesis

  Una de las consideraciones más importantes en la realización del ensayo MNvit es la de velar por que las células que se examinen hayan completado la mitosis durante el tratamiento o en el período de incubación tras el mismo, en su caso. Así pues, el recuento de micronúcleos debe limitarse a las células que han experimentado la mitosis durante el tratamiento o después de este. La citoB es el agente más ampliamente utilizado para bloquear la citocinesis, ya que inhibe el ensamblaje de la actina, con lo que impide la separación de las células hijas tras la mitosis, y así se forman células binucleadas (6) (66) (67). El efecto del producto problema sobre la cinética de proliferación celular puede medirse simultáneamente, cuando se utiliza la citoB. La citoB debe utilizarse como bloqueante de la citocinesis cuando se utilizan linfocitos humanos, ya que la duración de los ciclos celulares es variable entre los donantes, y debido a que no todos los linfocitos responden a la estimulación con PHA. El uso de citoB no es obligatorio con los demás tipos de células si se puede establecer que han sufrido división como se describe en el punto 27. Por otra parte, la citoB no se utiliza generalmente cuando se evalúa la presencia de micronúcleos en las muestras utilizando métodos citométricos.

  La concentración adecuada de citoB debe determinarse en el laboratorio para cada tipo celular a fin de conseguir la frecuencia óptima de células binucleadas en los cultivos de testigo de disolvente y debe demostrarse que proporciona un buen rendimiento de células binucleadas para la evaluación. La concentración adecuada de citoB está generalmente entre 3 y 6 μg/ml (19).

  Medición de la proliferación celular y de la citotoxicidad, y selección de las concentraciones de tratamiento

  Al determinar la concentración máxima de producto problema, debe evitarse llegar a concentraciones que puedan producir respuestas positivas falsas, tales como las que provocan una citotoxicidad excesiva (véase el punto 29), precipitación en el medio de cultivo (véase el punto 30), o cambios marcados del pH o de la osmolalidad (véase el punto 9). Si el producto problema provoca un cambio marcado en el pH del medio en el momento de su adición, el pH puede ajustarse amortiguando el medio de tratamiento final para evitar resultados positivos falsos y mantener unas condiciones de cultivo adecuadas.

  Se mide la proliferación celular para asegurarse de que un número suficiente de células tratadas ha sufrido mitosis durante el ensayo y de que los tratamientos se efectúan a los niveles adecuados de citotoxicidad (véase el punto 29). La citotoxicidad debe determinarse en el experimento principal con y sin activación metabólica, utilizando un indicador adecuado de la muerte y del crecimiento de las células (véanse los puntos 26 y 27). Si bien la evaluación de la citotoxicidad en un ensayo preliminar inicial puede ser útil para definir mejor las concentraciones que deben utilizarse en el experimento principal, no es obligatorio efectuar un ensayo inicial. Si se lleva a cabo, no debe sustituir a la medición de la citotoxicidad en el experimento principal.

  El tratamiento de los cultivos con citoB, junto con la medición de las frecuencias relativas de células mononucleadas, binucleadas y multinucleadas en el cultivo, constituye un método exacto de cuantificación del efecto sobre la proliferación celular y de la actividad citotóxica o citostática de un tratamiento (6), y garantiza que solamente se evalúan al microscopio las células que se han dividido durante el tratamiento o después de este. Se recomienda utilizar el índice de proliferación con bloqueo citocinético (IPBC) (6) (27) (68) o el índice de replicación (IR) de, al menos, 500 células por cultivo (véanse las fórmulas en el apéndice 2) para estimar la actividad citotóxica y citostática de un tratamiento comparando los valores obtenidos en los cultivos tratados y en los testigos. La evaluación de otros indicadores de citotoxicidad (por ejemplo, integridad celular, apoptosis, necrosis, recuento de las células en metafase, ciclo celular) puede aportar información útil, pero no debe utilizarse en lugar del IPBC o del IR.

  En los estudios sin citoB, es necesario demostrar que las células en cultivo se han dividido, de modo que una parte sustancial de las células analizadas hayan sufrido división durante el tratamiento con el producto problema o tras él; en caso contrario, pueden obtenerse respuestas negativas falsas. Para evaluar la actividad citotóxica y citostática de un tratamiento, se recomienda recurrir a la medición de la duplicación relativa de la población (DRP) o del aumento relativo del recuento celular (ARRC) (17) (68) (69) (70) (71) (véanse las fórmulas en el apéndice 2). Con unos tiempos de muestreo ampliados (por ejemplo, tratamiento durante 1,5-2 veces la duración del ciclo celular normal y recolección después de otras 1,5-2 veces la duración del ciclo celular normal, lo que llevaría a tiempos de muestreo superiores a 3-4 veces la duración del ciclo celular normal en total, como se describe en los puntos 38 y 39), la DRP podría subestimar la citotoxicidad (71). En tales circunstancias, puede ser preferible medir el ARRC, o puede ser útil evaluar la citotoxicidad tras un tiempo igual a 1,5-2 veces la duración del ciclo celular normal. La evaluación de otros indicadores de citotoxicidad o citostasis (por ejemplo, integridad celular, apoptosis, necrosis, recuento de las células en metafase, índice de proliferación (IP), ciclo celular, puentes nucleoplásmicos o yemas nucleares) puede aportar información útil, pero no debe utilizarse en lugar de la DRP o del ARRC.

  Deben evaluarse al menos tres concentraciones de ensayo (sin incluir los testigos positivos y de disolvente) que cumplan los criterios de aceptabilidad (citotoxicidad apropiada, número de células, etc.). Cualquiera que sea el tipo de células (líneas celulares o cultivos primarios de linfocitos), pueden utilizarse a cada concentración de ensayo cultivos tratados replicados o sin replicar. Si bien se recomienda el uso de cultivos duplicados, también son aceptables los cultivos sin replicar, siempre que se examine el mismo número total de células, sea en cultivos duplicados o sin replicar. La utilización de cultivos sin replicar es especialmente pertinente cuando se evalúan más de tres concentraciones (véanse los puntos 44-45). Los resultados obtenidos en los cultivos replicados independientes a una concentración determinada se pueden poner en común para el análisis de los datos. En el caso de productos problema que muestren escasa o nula citotoxicidad, normalmente serán adecuados los intervalos de concentración de aproximadamente el doble o el triple. Cuando se produce citotoxicidad, las concentraciones de ensayo seleccionadas deben cubrir una gama a partir de la que provoca citotoxicidad según se describe en el punto 29, con inclusión en particular de las concentraciones a las que existe citotoxicidad moderada y débil o nula. Muchos productos problema presentan curvas de respuesta a la concentración de elevada pendiente y, con el fin de obtener datos a niveles bajos y moderados de citotoxicidad o de estudiar en detalle la relación entre dosis y respuesta, en tales casos es necesario recurrir a concentraciones más próximas entre sí o a más de tres concentraciones (cultivos replicados o sin replicar), en particular en situaciones en que se requiere una repetición del experimento (véase el punto 60).

  Si la concentración máxima se basa en la citotoxicidad, la concentración más elevada debe aspirar a provocar un 55 ± 5 % de citotoxicidad utilizando los parámetros recomendados de citotoxicidad (es decir, reducción del ARRC y de la DRP con líneas celulares cuando no se utiliza la citoB, y reducción del IPBC o del IR cuando se utiliza la citoB, al 45 ± 5 % del testigo negativo en paralelo) (72). Ha de tenerse cuidado al interpretar resultados positivos que solo se encuentren en el extremo superior de este intervalo de citotoxicidad del 55 ± 5 % (71).

  Para los productos problema poco solubles que no son citotóxicos a concentraciones inferiores a la concentración mínima insoluble, la mayor concentración analizada debe producir turbidez o precipitado visibles a simple vista o con ayuda de un microscopio invertido al final del tratamiento con el producto problema. Incluso si se produce citotoxicidad por encima de la concentración mínima insoluble, es aconsejable hacer el ensayo a una única concentración que produzca turbidez o precipitado visible porque este puede provocar efectos falsos. A la concentración que produce precipitado, se debe evitar que este interfiera con la realización del ensayo (por ejemplo, con la tinción o el examen celular). Puede ser útil determinar la solubilidad en el medio de cultivo antes de que efectuar el experimento.

  Si no se observa precipitado ni citotoxicidad limitante, la concentración de ensayo más elevada debe corresponder a la más baja de las siguientes: 10 mM, 2 mg/ml o 2 μl/ml (73) (74) (75). Si el producto problema no tiene una composición definida y se trata, por ejemplo, de sustancias de composición desconocida o variable, productos complejos de reacción o materiales biológicos (UVCB) (76), extractos medioambientales, etc., es posible que la concentración superior tenga que ser mayor (por ejemplo, 5 mg/ml), en ausencia de citotoxicidad suficiente, para aumentar la concentración de cada uno de los componentes. Conviene señalar, no obstante, que estos requisitos pueden variar en caso de medicamentos de uso humano (93).

  Testigos

  Se incluirán, para cada período de recolección, testigos negativos en paralelo (véase el punto 21), consistentes en el disolvente solo en el medio de tratamiento y sometidos al mismo proceso que los cultivos tratados.

  Es necesario disponer testigos positivos en paralelo a fin de demostrar la capacidad del laboratorio para detectar clastógenos y anéugenos en las condiciones establecidas en el protocolo de ensayo utilizado y la efectividad del sistema exógeno de activación metabólica, si procede. En el cuadro 1 a continuación se encuentran ejemplos de testigos positivos. Es posible utilizar como testigos positivos otros productos, si se justifica.

  Por el momento, no se conoce ningún anéugeno que necesite activación metabólica para su actividad genotóxica (17). Debido a que los ensayos de toxicidad genética con células de mamífero in vitro están suficientemente normalizados respecto a los tratamientos a corto plazo realizados en paralelo, con y sin activación metabólica, utilizando la misma duración del tratamiento, el uso de testigos positivos puede limitarse a un clastógeno que requiera activación metabólica. En este caso, una sola respuesta clastogénica de un testigo positivo demostrará tanto la actividad del sistema de activación metabólica como la sensibilidad del sistema de ensayo. No obstante, los tratamientos a largo plazo (sin fracción S9) deben tener su propio testigo positivo, ya que la duración del tratamiento será diferente de la del ensayo con activación metabólica. Si se selecciona un clastógeno como único testigo positivo en un tratamiento a corto plazo con y sin activación metabólica, debe seleccionarse un anéugeno para el tratamiento a largo plazo sin activación metabólica. Deben utilizarse testigos positivos tanto en cuanto a la clastogenicidad como en cuanto a la aneugenicidad con células competentes metabólicamente que no requieren S9.

  Cada testigo positivo debe utilizarse a una o varias concentraciones de las que quepa esperar que produzcan incrementos reproducibles y detectables respecto a los valores de fondo para demostrar la sensibilidad del sistema de ensayo (es decir, que los efectos sean claros, pero sin revelar inmediatamente al lector la identidad de los portaobjetos codificados), y la respuesta no debe verse comprometida por una citotoxicidad que exceda de los límites especificados en este método de ensayo.

  Cuadro 1.

  Productos de referencia recomendados para evaluar la competencia del laboratorio, y para la selección de los testigos positivos.

  Categoría	Producto	CAS RN
  1. Clastógenos activos sin activación metabólica
  	Metanosulfonato de metilo	66-27-3
  	Mitomicina C	50-07-7
  	N-Óxido de 4-nitroquinolina	56-57-5
  	Arabinósido de citosina	147-94-4
  2. Clastógenos que necesitan activación metabólica
  	Benzo(a)pireno	50-32-8
  	Ciclofosfamida	50-18-0
  3. Anéugenos
  	Colchicina	64-86-8
  	Vimblastina	143-67-9

  PROCEDIMIENTO

  Pauta de tratamiento

  Para maximizar la probabilidad de detectar un anéugeno o un clastógeno que actúe en una fase específica del ciclo celular, es importante que se trate con el producto problema un número suficiente de células que representen todas las diferentes fases de sus ciclos celulares. Todos los tratamientos deben iniciarse y terminarse mientras las células están en fase de crecimiento exponencial y las células deben seguir creciendo hasta el momento de la toma de muestras. Por tanto, la pauta de tratamiento de líneas celulares y de cultivos celulares primarios puede diferir en algunos aspectos respecto a la aplicada a los linfocitos que requieren estimulación mitogénica para empezar su ciclo celular (17). En el caso de los linfocitos, el enfoque más eficiente es iniciar el tratamiento con el producto problema a las 44-48 horas tras la estimulación con PHA, cuando las células se estén dividiendo de forma asíncrona (6).

  Los datos publicados (19) indican que la mayoría de los anéugenos y clastógenos se detectan con un corto período de tratamiento, de entre 3 y 6 horas, en presencia y ausencia de S9, seguido de la eliminación del producto problema, y con la toma de muestras a un tiempo equivalente a unas 1,5-2,0 veces la duración del ciclo celular normal desde el inicio del tratamiento (7).

  Sin embargo, para una evaluación a fondo, que sería necesaria para deducir un resultado negativo, deben aplicarse las tres condiciones experimentales siguientes, utilizando un tratamiento a corto plazo con y sin activación metabólica y un tratamiento a largo plazo sin activación metabólica (véanse los puntos 56, 57 y 58):

  • - Las células deben exponerse al producto problema sin activación metabólica durante 3 a 6 horas, y recolectarse cuando haya transcurrido un período de aproximadamente 1,5-2,0 veces la duración del ciclo celular normal desde el inicio del tratamiento (19).
  • - Las células deben exponerse al producto problema con activación metabólica durante 3 a 6 horas, y recolectarse cuando haya transcurrido un período de aproximadamente 1,5-2,0 veces la duración del ciclo celular normal desde el inicio del tratamiento (19).
  • - Las células deben exponerse continuamente sin activación metabólica hasta la recolección tras un período de aproximadamente 1,5-2,0 veces la duración del ciclo celular normal.

  En caso de que alguna de las anteriores condiciones experimentales conduzca a una respuesta positiva, puede no ser necesario investigar los otros regímenes de tratamiento.

  Si se sabe o se sospecha que el producto problema afecta a la duración del ciclo celular (por ejemplo, cuando se someten a ensayo análogos de nucleósidos), especialmente en el caso de células competentes para p53 (35) (36) (77), los tiempos de toma de muestras o de recuperación pueden ampliarse hasta un nuevo período de 1,5-2,0 veces la duración del ciclo celular normal (es decir, un total de 3,0 a 4,0 veces la duración del ciclo celular desde el inicio de los tratamientos a corto y a largo plazo). Estas opciones se refieren a situaciones en que puede haber preocupación respecto a posibles interacciones entre el producto problema y la citoB. Cuando se utilizan tiempos de muestreo ampliados (es decir, un total de 3,0 a 4,0 veces la duración del ciclo celular), conviene asegurarse de que las células se siguen dividiendo aún activamente. Por ejemplo, en el caso de los linfocitos, el crecimiento exponencial podría declinar a las 96 horas de la estimulación y pueden convertirse en confluentes los cultivos en monocapas.

  Las pautas sugeridas de tratamiento celular se resumen en el cuadro 2. Estas pautas generales de tratamiento pueden modificarse (lo que debería justificarse) en función de la estabilidad o reactividad del producto problema o de las características particulares de crecimiento de las células utilizadas.

  Cuadro 2.

  Tratamiento celular y tiempos de recogida para el ensayo MNvit

  Linfocitos, células primarias y líneas celulares tratadas con citoB	+ S9 Tratamiento prolongado	Tratar durante 3-6 horas en presencia de S9; retirar la fracción S9 y el medio de tratamiento; añadir medio fresco y citoB; recolectar cuando haya pasado 1,5-2,0 veces la duración del ciclo celular normal desde el inicio del tratamiento.
  	– S9 Tratamiento prolongado	Tratar durante 3-6 horas; retirar el medio de tratamiento; añadir medio fresco y citoB; recolectar cuando haya pasado 1,5-2,0 veces la duración del ciclo celular normal desde el inicio del tratamiento.
  	– S9 Tratamiento prolongado	Tratar durante 1,5-2,0 veces la duración del ciclo celular normal en presencia de citoB; recolectar al final del período de tratamiento.
  Líneas celulares tratadas sin citoB (igual que las pautas de tratamiento indicadas más arriba, salvo que no se añade citoB)

  En los cultivos de monocapas, es posible que haya células mitóticas (identificables por su forma redondeada y por despegarse de la superficie) al final del tratamiento de 3-6 horas. Como estas células mitóticas se despegan con facilidad, pueden perderse cuando se retira el medio que contiene el producto problema. Si hay pruebas de un aumento sustancial del número de células mitóticas en comparación con los testigos, lo que indica una probable detención mitótica, las células deben recogerse por centrifugación y volver a añadirse al cultivo, para evitar la pérdida de células que estén en mitosis, y que podrían presentar micronúcleos o aberraciones cromosómicas, en el momento de la recolección.

  Recolección de las células y preparación de los portaobjetos

  Cada cultivo debe recogerse y manipularse por separado. La preparación de las células puede implicar un tratamiento hipotónico, pero esta fase no es necesaria si se consigue de otra manera una extensión adecuada de las células. Pueden usarse distintas técnicas para la preparación de los portaobjetos, siempre que lleven a la obtención de preparaciones celulares de buena calidad para su evaluación. Deben seleccionarse células con la membrana celular intacta y el citoplasma intacto para poder detectar los micronúcleos y (en el método de bloqueo de la citocinesis) poder identificar de forma fiable las células binucleadas.

  Las preparaciones pueden teñirse siguiendo varios métodos, tales como la tinción de Giemsa o la aplicación de colorantes fluorescentes específicos del ADN. Si se emplean colorantes fluorescentes apropiados [p. ej., naranja de acridina (78) o Hoechst 33258 más pironina-Y (79)] pueden evitarse algunos de los artefactos que aparecen cuando se utiliza un colorante no específico del ADN. Pueden utilizarse anticuerpos anti-cinetocoros, la técnica FISH con sondas pancentroméricas de ADN, o el etiquetado in situ cebado con cebadores pancentroméricos específicos, junto con una tinción de contraste adecuada del ADN, para determinar el contenido de micronúcleos (se teñirán los cromosomas enteros, mientras que los fragmentos cromosómicos acéntricos quedarán sin teñir) si resulta interesante disponer de información sobre el mecanismo de su formación (16) (17). Pueden utilizarse otros métodos para diferenciar entre clastógenos y anéugenos, siempre que se haya comprobado que son efectivos y están validados. Por ejemplo, en el caso de ciertas líneas celulares, también podrían aportar información útil las mediciones de núcleos sub-2N como fenómenos de hipodiploidía utilizando técnicas tales como el análisis de imágenes, la citometría de barrido por láser o la citometría de flujo (80) (81) (82). Las observaciones morfológicas de los núcleos podrían aportan también indicaciones de posible aneuploidía. Por otra parte, un ensayo de aberraciones cromosómicas en metafase, preferiblemente con el mismo tipo de células y un protocolo de sensibilidad comparable, también podría ser una forma útil de determinar si los micronúcleos se deben a la rotura de cromosomas (sabiendo que la pérdida de cromosomas no se detectaría en el ensayo de aberraciones cromosómicas).

  Análisis

  Todos los portaobjetos, incluidos los de los testigos del disolvente, de la muestra sin tratar (en su caso) y los positivos, reciben un código independiente antes de analizar al microscopio las frecuencias de los micronúcleos. Conviene utilizar técnicas adecuadas para controlar todo eventual sesgo o deriva cuando se utilice un sistema de examen automatizado como, por ejemplo, la citometría de flujo, la citometría de barrido por láser o el análisis de imágenes. Con independencia del programa automatizado que se utilice para enumerar los micronúcleos, deben evaluarse de manera simultánea el IPBC, el IR, la DRP o el ARRC.

  En los cultivos tratados con citoB, deben analizarse las frecuencias de los micronúcleos en al menos 2 000 células binucleadas por cada concentración y testigo (83), divididas a partes iguales entre las réplicas, si se utilizan estas. En caso de realizarse un solo cultivo por dosis (véase el punto 28), deben evaluarse al menos 2 000 células binucleadas en ese cultivo único (83). Si para el examen a cada concentración se dispone de un número sustancialmente inferior a 1 000 células binucleadas por cultivo (en caso de cultivos duplicados), o a 2 000 (en caso de cultivos únicos), y si no se detecta un aumento significativo de la frecuencia de los micronúcleos, debe repetirse el ensayo utilizando más células, o unas concentraciones menos citotóxicas, según sea más conveniente. Ha de procurarse no tener en cuenta para el examen las células binucleadas con formas irregulares o en las que los dos núcleos difieran mucho por su tamaño. Por otra parte, no deben confundirse las células binucleadas con células multinucleadas mal extendidas. Las células que contengan más de dos núcleos principales no deben examinarse en cuanto a los micronúcleos, ya que la frecuencia de micronúcleos de base puede ser más elevada en estas células (84). Es aceptable el examen de células mononucleadas si se demuestra que el producto problema interfiere con la actividad de la citoB. Un segundo ensayo sin citoB podría ser útil en tales casos. El examen de células mononucleadas, además del de las células binucleadas, puede aportar información útil (85) (86), pero no es obligatorio realizarlo.

  En el caso de las líneas celulares estudiadas sin tratamiento con citoB, deben examinarse los micronúcleos en al menos 2 000 células por cada concentración y testigo (83), divididas a partes iguales entre las réplicas, si se utilizan estas. Cuando se utiliza un solo cultivo por concentración (véase el punto 28), deben examinarse al menos 2 000 células de este cultivo único. Si para el examen a cada concentración se dispone de un número sustancialmente inferior a 1 000 células por cultivo (en caso de cultivos duplicados), o a 2 000 (en caso de cultivos únicos), y si no se detecta un aumento significativo de la presencia de micronúcleos, debe repetirse el ensayo utilizando más células, o unas concentraciones menos citotóxicas, según sea más conveniente.

  Cuando se utiliza la citoB, para evaluar la proliferación celular hay que determinar el IPBC o el IR (véase el apéndice 2) basándose en un mínimo de 500 células por cultivo. Cuando se hacen los tratamientos en ausencia de citoB, es fundamental aportar pruebas de que las células del cultivo se han dividido, como se indica en los puntos 24-28.

  Competencia del laboratorio

  Con el fin de conseguir la suficiente experiencia con el ensayo antes de su uso para los ensayos sistemáticos, el laboratorio debe haber efectuado una serie de experimentos con productos positivos de referencia que actúen a través de mecanismos diferentes (como mínimo, uno con y otro sin activación metabólica, y uno que actúe a través de un mecanismo aneugénico, seleccionados de entre los productos químicos enumerados en el cuadro 1) y con diversos testigos negativos (incluidos los cultivos sin tratar y diferentes disolventes o vehículos). Las respuestas obtenidas con estos testigos positivos y negativos deben ser coherentes con la bibliografía. Esto no es aplicable a los laboratorios que tienen experiencia, esto es, que disponen de una base de datos históricos, según se define en los puntos 49-52.

  Debe investigarse una selección de productos testigo positivos (véase el cuadro 1) con tratamientos cortos y largos en ausencia de activación metabólica, y también con tratamientos cortos en presencia de activación metabólica, para demostrar su capacidad de detectar productos clastogénicos y aneugénicos, determinar la efectividad del sistema de activación metabólica y demonstrar la adecuación de los procedimientos de examen (análisis visual microscópico, citometría de flujo, citometría de barrido por láser o análisis de imágenes). Debe elegirse una gama de concentraciones de los productos seleccionados de forma que produzcan aumentos sobre el nivel de fondo relacionados con la concentración y reproducibles para demostrar la sensibilidad y el intervalo dinámico del sistema de ensayo.

  Datos sobre testigos históricos

  El laboratorio debe determinar:

  • - un intervalo y una distribución de los testigos positivos históricos,
  • - un intervalo y una distribución de los testigos negativos (sin tratar, disolventes) históricos.

  Cuando se obtengan datos por primera vez en relación con la distribución de testigos negativos históricos, los testigos negativos en paralelo deben ser coherentes con los datos publicados de los testigos negativos, si existen. Según se añadan más datos experimentales sobre la distribución de los testigos, los testigos negativos en paralelo deben situarse idealmente dentro de los límites de control del 95 % de dicha distribución (87) (88). La base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio debe constituirse en un principio con un mínimo de 10 experimentos, pero preferiblemente con al menos 20 experimentos realizados en condiciones experimentales comparables. Los laboratorios deben utilizar métodos de control de calidad, como gráficos de control [por ejemplo, gráficos C o gráficos de medias (88)], con el fin de determinar la variabilidad de sus datos sobre los testigos positivos y negativos, y de demostrar que la metodología está «controlada» en su laboratorio (83). En la bibliografía pueden encontrarse más recomendaciones sobre cómo conseguir y utilizar los datos históricos (es decir, criterios de inclusión y exclusión de datos en los datos históricos y criterios de aceptabilidad para un determinado experimento) (87).

  Cualquier cambio en el protocolo experimental debe considerarse en función de la coherencia de los datos con las bases de datos de testigos históricos existentes del laboratorio. Cualquier incoherencia importante debería dar lugar a la creación de una nueva base de datos de testigos históricos.

  Los datos sobre los testigos negativos deben consistir en la incidencia de células micronucleadas procedentes de un solo cultivo o de la suma de cultivos replicados como se describe en el punto 28. Lo ideal sería que los testigos negativos en paralelo estuvieran dentro de los límites de control del 95 % de la distribución de la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio (87) (88). Cuando hay datos de los testigos negativos en paralelo que quedan fuera de los límites de control del 95 %, su inclusión en la distribución de testigos históricos puede ser aceptable en la medida en que dichos datos no sean valores discrepantes extremos y haya pruebas de que el sistema de ensayo está «controlado» (véase el punto 50) y pruebas de la ausencia de fallos técnicos o humanos.

  DATOS E INFORME

  Presentación de los resultados

  Si se utiliza la técnica de bloqueo de la citocinesis, para la evaluación de la inducción de micronúcleos se emplearán solo las frecuencias de las células binucleadas con micronúcleos (independientemente del número de micronúcleos por célula). El resultado del número de células con uno, dos o más micronúcleos puede notificarse por separado, lo que puede aportar información útil, pero no es obligatorio hacerlo así.

  También deben medirse en paralelo la citotoxicidad o la citostasis para todos los cultivos tratados y los testigos negativos y positivos (16). Los valores del IPBC y del IR deben calcularse para todos los cultivos tratados y testigos, como medidas del retraso del ciclo celular cuando se utiliza el método de bloqueo de la citocinesis. En ausencia de citoB, debe utilizarse la DRP o el ARRC (véase el apéndice 2).

  Deben proporcionarse datos de cada cultivo. Además, se resumirán todos los datos en forma de cuadro.

  Criterios de aceptabilidad

  La aceptabilidad de un ensayo se basa en los criterios siguientes:

  • - El testigo negativo en paralelo se considera aceptable para añadirse a la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio de acuerdo con lo descrito en el punto 50.
  • - Los testigos positivos en paralelo (véase el punto 50) deben inducir respuestas compatibles con las obtenidas en la base de datos de testigos positivos históricos del laboratorio y producir un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo.
  • - Deben cumplirse los criterios de proliferación celular en el testigo del disolvente (puntos 25-27).
  • - Se han sometido a ensayo todas las condiciones experimentales, a menos que una haya dado lugar a resultados positivos (puntos 36-40).
  • - Es analizable un número apropiado de células y de concentraciones (puntos 28 y 44-46).
  • - Los criterios de selección de la concentración superior son coherentes con los descritos en los puntos 24-31.

  Evaluación e interpretación de los resultados

  Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente positivo si, en alguna de las condiciones experimentales examinadas (véanse los puntos 36-39):

  • - al menos una de las concentraciones de ensayo muestra un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo (89),
  • - el aumento está relacionado con la dosis en al menos una condición experimental cuando se evalúa con una prueba de tendencia adecuada (véase el punto 28),
  • - alguno de los resultados está fuera de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límites de control del 95 % según la distribución de Poisson; véase el punto 52).

  Cuando se cumplen todos estos criterios, el producto problema se considera capaz de inducir roturas, aumentos o pérdidas de cromosomas en este sistema de ensayo. En la bibliografía se encuentran también recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (90) (91) (92).

  Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente negativo si, en todas las condiciones experimentales examinadas (véanse los puntos 36-39):

  • - ninguna de las concentraciones de ensayo muestra un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo,
  • - no hay ningún aumento relacionado con la concentración cuando se evalúa con una prueba de tendencia adecuada,
  • - todos los resultados están dentro de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límites de control del 95 % según la distribución de Poisson; véase el punto 52).

  El producto problema se considera entonces incapaz de inducir roturas, aumentos o pérdidas de cromosomas en este sistema de ensayo. En la bibliografía se encuentran también recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (90) (91) (92).

  No se requiere ninguna verificación de una respuesta positiva o negativa clara.

  En caso de que la respuesta no sea ni claramente positiva ni claramente negativa como se describe más arriba, o a fin de ayudar a determinar la relevancia biológica de un resultado, los datos deben ser evaluados por expertos o mediante más investigaciones. Puede ser útil examinar células adicionales (en su caso) o realizar una repetición del experimento modificando las condiciones experimentales, como, por ejemplo, la separación entre concentraciones u otras condiciones de activación metabólica (es decir, concentración u origen de la fracción S9).

  En casos raros, incluso después de hacer más investigaciones, el conjunto de datos puede no permitir que se extraiga una conclusión de resultado positivo o negativo, por lo que se considerará dudoso.

  Los productos problema que inducen micronúcleos en el ensayo MNvit pueden deber esta propiedad a su capacidad de inducir rotura cromosómica, pérdida de cromosomas, o una combinación de ambas. Para determinar si el mecanismo de inducción de micronúcleos se debe a actividad clastogénica y/o aneugénica, pueden realizarse otros análisis utilizando anticuerpos anti-cinetocoro, sondas in situ específicas del centrómero, u otros métodos.

  Informe del ensayo

  El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

  • Producto problema:
    • - origen, número de lote, fecha límite de utilización, si se dispone de ellos;
    • - estabilidad del producto problema en sí, si se conoce;
    • - reactividad del producto problema con el disolvente o vehículo o con el medio de cultivo de las células;
    • - solubilidad y estabilidad del producto problema en el disolvente, si se conocen;
    • - medición del pH, osmolalidad y precipitado en el medio de cultivo al que se ha añadido el producto problema, según proceda.
  • Sustancia con un solo componente:
    • - aspecto físico, hidrosolubilidad, y propiedades fisicoquímicas pertinentes adicionales;
    • - identificación química, como nombre IUPAC o CAS, número CAS, código SMILES o InChI, fórmula estructural, pureza, identidad química de las impurezas según convenga y sea factible en la práctica, etc.
  • Sustancias de componentes múltiples, sustancias UVCB y mezclas:
    • - en la medida de lo posible, caracterizadas por la identidad química (véase más arriba), presencia cuantitativa y propiedades fisicoquímicas pertinentes de los componentes.
  • Disolvente:
    • - justificación de la elección del disolvente;
    • - porcentaje de disolvente en el medio de cultivo final.
  • Células:
    • - tipo y procedencia de las células utilizadas;
    • - idoneidad del tipo de células utilizado;
    • - ausencia de micoplasmas, en el caso de las líneas celulares;
    • - en el caso de las líneas celulares, información sobre la duración del ciclo celular o el índice de proliferación;
    • - cuando se utilicen linfocitos, sexo de los donantes de sangre, edad y cualquier información pertinente sobre los donantes, sangre completa o linfocitos aislados y mitógeno empleado;
    • - duración del ciclo celular normal (testigo negativo);
    • - número de pases, si se conoce, en el caso de las líneas celulares;
    • - métodos de mantenimiento de los cultivos celulares, en el caso de las líneas celulares;
    • - número modal de cromosomas, en el caso de las líneas celulares.
  • Condiciones de ensayo:
    • - identidad de la sustancia de bloqueo de la citocinesis (por ejemplo, citoB), si se utiliza, y su concentración, junto con la duración de la exposición de las células;
    • - concentración del producto problema, expresada como concentración final en el medio de cultivo (por ejemplo, μg o mg/ml, o mM, de medio de cultivo);
    • - justificación de la selección de las concentraciones y del número de cultivos, incluidos los datos de citotoxicidad y los límites de solubilidad;
    • - composición de los medios, concentración de CO₂ si procede, nivel de humedad;
    • - concentración (o volumen) del disolvente y del producto problema añadidos al medio de cultivo;
    • - temperatura y duración de la incubación;
    • - duración del tratamiento;
    • - momento de la recolección tras el tratamiento;
    • - densidad celular en el momento de la siembra, si procede;
    • - tipo y composición del sistema de activación metabólica: origen de la fracción S9, método de preparación de la mezcla S9, concentración o volumen de mezcla S9 y de fracción S9 en el medio de cultivo final, controles de calidad de la fracción S9 (p. ej., actividad enzimática, esterilidad, capacidad metabólica);
    • - productos testigo positivos y negativos, concentraciones finales, condiciones y duración de los períodos de tratamiento y de recuperación;
    • - métodos de preparación de los portaobjetos y técnica de tinción utilizados;
    • - criterios de examen de células micronucleadas (selección de las células analizables e identificación de micronúcleos);
    • - números de células analizadas;
    • - métodos de medición de la citotoxicidad;
    • - cualquier información adicional relativa a la citotoxicidad y método utilizado;
    • - criterios empleados para considerar si los resultados de los estudios son positivos, negativos o dudosos;
    • - métodos utilizados de análisis estadístico;
    • - métodos, tales como la utilización de anticuerpos anti-cinetocoro o de sondas pan-centroméricas específicas, para caracterizar si los micronúcleos contienen cromosomas completos o fragmentados, en su caso;
    • - métodos utilizados para determinar el pH, la osmolalidad y la precipitación.
  • Resultados:
    • - definición de células aceptables para el análisis;
    • - en ausencia de citoB, número de células tratadas y número de células recolectadas de cada cultivo cuando se utilizan líneas celulares;
    • - parámetro utilizado para medir la citotoxicidad como, por ejemplo, IPBC o IR en caso de aplicación de bloqueo citocinético, o ARRC o DRP cuando no se aplica este bloqueo; otras observaciones eventuales como, p. ej., confluencia celular, apoptosis, necrosis, recuento en metafase, frecuencia de células binucleadas;
    • - signos de precipitación y momento de la determinación;
    • - datos sobre el pH y la osmolalidad del medio de tratamiento, si se han determinado;
    • - distribución de las células mono, bi y multinucleadas si se utiliza un método de bloqueo de la citocinesis;
    • - número de células con micronúcleos, indicado por separado para cada cultivo tratado y de testigo, precisándose si corresponden a células binucleadas o mononucleadas, en su caso;
    • - relación concentración-respuesta, cuando sea posible;
    • - datos de los testigos negativos (disolvente) y positivos (concentraciones y disolventes) en paralelo;
    • - datos históricos de los testigos negativos (disolvente) y positivos, con intervalos, medias y desviación típica y límites de control del 95 % para la distribución, así como el número de datos;
    • - análisis estadístico; valores p, si se dispone de ellos.
  • Discusión de los resultados
  • Conclusiones

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  • (93) International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use.

  Apéndice 1

  DEFINICIONES

  Anéugeno : Producto o proceso que, por interacción con los componentes del aparato del ciclo de división celular mitótica y meiótica, produce la aneuploidía de células u organismos.

  Aneuploidía : Desviación respecto al número diploide (o haploide) normal de cromosomas que afecta a uno o varios cromosomas, pero no a dotaciones completas de cromosomas (poliploidía).

  Apoptosis : Muerte celular programada, caracterizada por una serie de fases que llevan a la desintegración de las células para formar partículas limitadas por membranas que se eliminan a continuación por fagocitosis o por liberación.

  Proliferación celular : Aumento del número de células como resultado de divisiones celulares mitóticas.

  Centrómero : Región del ADN del cromosoma en la que se mantienen juntas las dos cromátidas y a la que se unen lateralmente los dos cinetocoros.

  Producto : Sustancia o mezcla.

  Concentraciones : Se refiere a las concentraciones del producto problema en el medio de cultivo.

  Clastógeno : Producto o fenómeno que provoca aberraciones cromosómicas estructurales en poblaciones de células u organismos eucarióticos.

  Citocinesis : Proceso de división celular que sigue inmediatamente a la mitosis para formar dos células hijas, cada una de las cuales contiene un solo núcleo.

  Índice de proliferación con bloqueo citocinético (IPBC, o CBPI, por su nombre en inglés) : Relación entre el número de células de segunda división en la población tratada respecto al de células del testigo sin tratar (véase la fórmula en el apéndice 2).

  Citostasis : Inhibición del crecimiento celular (véase la fórmula en el apéndice 2).

  Citotoxicidad : Para los ensayos que siguen este método de ensayo y se realizan en presencia de citocalasina B, la citotoxicidad se identifica como una reducción del índice de proliferación con bloqueo citocinético (IPBC) o del índice de replicación (IR) de las células tratadas en comparación con el testigo negativo (véanse el punto 26 y el apéndice 2).

  Para los ensayos que siguen este método de ensayo y se realizan en ausencia de citocalasina B, la citotoxicidad se identifica como una reducción de la duplicación relativa de la población (DRP) o del aumento relativo del recuento de células (ARRC) de las células tratadas en comparación con el testigo negativo (véanse el punto 27 y el apéndice 2).

  Genotoxicidad : Término general que engloba todos los tipos de lesión del ADN o de los cromosomas, con inclusión de roturas, deleciones, adiciones, modificaciones y uniones de nucleótidos, reorganizaciones, mutaciones génicas, aberraciones cromosómicas y aneuploidía. No todos los tipos de efectos genotóxicos resultan en mutaciones o en lesiones cromosómicas estables.

  Células en interfase : Células que no se encuentran en fase mitótica.

  Cinetocoro : Estructura proteínica que se encuentra en el centrómero del cromosoma y a la cual se asocian las fibras del huso acromático durante la división celular para permitir el movimiento ordenado de los cromosomas hijos hacia los polos de las células hijas.

  Micronúcleos : Núcleos pequeños, adicionales a los núcleos celulares principales y separados de ellos, y producidos durante la telofase de la mitosis o de la meiosis por fragmentos cromosómicos o cromosomas enteros retardados.

  Mitosis : División del núcleo celular, generalmente compuesta por profase, prometafase, metafase, anafase y telofase.

  Índice mitótico : Relación entre el número de células en metafase y el número total de células observadas en una población celular; indica el grado de proliferación celular de dicha población.

  Mutágeno : Agente que provoca un cambio hereditario en una o varias secuencias de pares de bases del ADN en los genes o en la estructura de los cromosomas (aberraciones cromosómicas).

  No disyunción : Caso en que las cromátidas emparejadas no se separan ni se segregan adecuadamente para repartirse entre las células hijas en formación, lo que provoca en estas la presencia de unos números anormales de cromosomas.

  Situación de la proteína p53 : La proteína p53 participa en la regulación del ciclo celular, en la apoptosis y en la reparación del ADN. Las células deficientes en proteína p53 funcional, incapaces de detener el ciclo celular o de eliminar las células dañadas por apoptosis u otros mecanismos (por ejemplo, inducción de la reparación del ADN) en relación con funciones de la proteína p53 en respuesta a las lesiones del ADN, deben estar, en teoría, más expuestas a las mutaciones génicas o a las aberraciones cromosómicas.

  Poliploidía : Aberraciones cromosómicas numéricas en células u organismos que afectan a dotaciones completas de cromosomas, frente a las aberraciones que afectan solo a cromosomas sueltos (aneuploidía).

  Índice de proliferación (IP) : Método de medición de la citotoxicidad sin utilización de la citoB (véase la fórmula en el apéndice 2).

  Aumento relativo del recuento celular (ARRC, o RICC por su nombre en inglés) : Método de medición de la citotoxicidad sin utilización de la citoB (véase la fórmula en el apéndice 2).

  Duplicación relativa de la población (DRP) : Método de medición de la citotoxicidad sin utilización de la citoB (véase la fórmula en el apéndice 2).

  Índice de replicación (IR) : Relación entre el número de ciclos de división celular completados en un cultivo tratado y el del testigo sin tratar, durante el tiempo de exposición y la recuperación (véase la fórmula en el apéndice 2).

  Fracción hepática S9 : Sobrenadante de homogeneizado de hígado después de centrifugación a 9 000 g, es decir, extracto de hígado crudo.

  Mezcla S9 : Mezcla de la fracción hepática S9 y de cofactores necesarios para la actividad metabólica de las enzimas.

  Testigo del disolvente : Término general para definir los cultivos testigo que reciben solo el disolvente utilizado para disolver el producto problema.

  Producto problema : Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

  Testigos sin tratar : Cultivos que no reciben tratamiento (es decir, ni producto problema ni disolvente), pero que se someten al mismo proceso en paralelo que los cultivos que reciben el producto problema.

  Apéndice 2 FÓRMULAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD

  Cuando se utiliza citoB , la evaluación de la citotoxicidad debe basarse en el índice de proliferación con bloqueo citocinético (IPBC) o en el índice de replicación (IR) (17) (69). El IPBC indica el número medio de núcleos por célula, y puede utilizarse para calcular la proliferación celular. El IR indica el número relativo de ciclos celulares por célula durante el período de exposición a la citoB en los cultivos tratados respecto al de los cultivos testigo y puede utilizarse para calcular el porcentaje de citostasis:

  % de citostasis = 100 - 100{(IPBC_T - 1) ÷ (IPBC_C - 1)}

  y:

  T = cultivo tratado con el producto problema

  C = cultivo testigo

  donde:

  

  Así pues, un IPBC de 1 (todas las células son mononucleadas) es equivalente a un 100 % de citostasis.

  Citostasis = 100 - IR

  

  T = cultivos tratados

  C = cultivos testigo

  Así pues, un IR del 53 % significa que, respecto al número de células que se han dividido para formar células binucleadas y multinucleadas en el cultivo testigo, solo el 53 % de este número se ha dividido en el cultivo tratado, es decir, hay un 47 % de citostasis.

  Cuando no se utiliza citoB , se recomienda evaluar la citotoxicidad sobre la base del aumento relativo del recuento celular (ARRC) o de la duplicación relativa de la población (DRP) (69), ya que ambos parámetros tienen en cuenta la proporción de la población celular que se ha dividido.

  

  

  donde:

  N.º de duplicaciones de la población = [log (número de células tras el tratamiento ÷ número de células al inicio)] ÷ log 2

  Así pues, un ARRC o una DRP del 53 % indica un 47 % de citotoxicidad o citostasis.

  Si se utiliza el índice de proliferación (IP), es posible evaluar la citotoxicidad mediante el recuento de los clones formados por una célula (cl1), dos células (cl2), de tres a cuatro células (cl4) y de cinco a ocho células (cl8):

  

  El IP se viene utilizando como parámetro válido y fiable de citotoxicidad también con líneas celulares cultivadas in vitro en ausencia de citoB (35) (36) (37) (38) y puede considerarse un parámetro adicional útil.

  En cualquier caso, el número de células antes del tratamiento debe ser el mismo en el caso de los cultivos testigo tratados y negativos.

  Si bien el recuento celular relativo (RCR, número de células en los cultivos tratados dividido por el número de células en los cultivos testigo) se había utilizado como parámetro de citotoxicidad en el pasado, ya no se recomienda porque puede subestimar la citotoxicidad.

  Cuando se utilizan sistemas de examen automático, por ejemplo, la citometría de flujo, la citometría de barrido por láser o el análisis de imágenes, el número de células en la fórmula puede sustituirse por el número de núcleos.

  En los cultivos de testigos negativos, la duplicación de la población o el índice de replicación deberán ser compatibles con el requisito de muestrear las células después del tratamiento durante un tiempo equivalente a unas 1,5-2,0 veces la duración del ciclo celular normal.»

• 15) En la parte B se añaden los capítulos siguientes:

  « B.59
  
  Sensibilización cutánea in chemico: ensayo directo de reactividad peptídica (DPRA)

  INTRODUCCIÓN

  El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 442C (2015). Un sensibilizante cutáneo es una sustancia que induce una respuesta alérgica por contacto con la piel, tal como se define en el Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos de las Naciones Unidas (SGA de la ONU) (1) y en el Reglamento (CE) n.º 1272/2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas (CLP) de la Unión Europea (UE) (24) . El presente método de ensayo proporciona un procedimiento in chemico (ensayo directo de reactividad peptídica, DPRA por su nombre en inglés) utilizado para apoyar la discriminación entre los sensibilizantes cutáneos y los no sensibilizantes de conformidad con el SGA de las Naciones Unidas y el CLP.

  Existe un acuerdo general sobre los principales fenómenos biológicos subyacentes a la sensibilización cutánea. Los actuales conocimientos acerca de los mecanismos biológicos y químicos asociados con la sensibilización cutánea se han resumido en forma de una ruta de resultados adversos (Adverse Outcome Pathway, AOP) (2), desde el fenómeno molecular desencadenante, pasando por los fenómenos intermedios, hasta el efecto adverso, en concreto la dermatitis alérgica de contacto en seres humanos o la hipersensibilidad de contacto en roedores. Dentro de la AOP de la sensibilización cutánea, el fenómeno molecular desencadenante es la unión covalente de sustancias electrofílicas a los centros nucleofílicos de las proteínas de la piel.

  Tradicionalmente, la evaluación de la sensibilización cutánea se hacía con animales de laboratorio. Los métodos clásicos con cobayas, como el ensayo de maximización con cobayas de Magnusson y Kligman (GMPT) y el ensayo de Buehler [método B.6 (3)], estudian tanto la fase de inducción como la de desencadenamiento de la sensibilización cutánea. Un ensayo con múridos, el ensayo con ganglios linfáticos locales [LLNA, método B.42 (4)], y sus dos modificaciones no radiactivas, el LLNA: DA [método B.50 (5)] y el LLNA: BrdU-ELISA [método B.51 (6)], que evalúan exclusivamente la respuesta de inducción, también han conseguido aceptación porque, sobre los ensayos con cobayas, tienen la ventaja de respetar más el bienestar de los animales y de permitir una medición objetiva de la fase de inducción de la sensibilización cutánea.

  Más recientemente, algunos métodos farmacodinámicos in chemico e in vitro se han considerado científicamente válidos para la evaluación del peligro de sensibilización cutánea que representan los productos. Sin embargo, será necesario recurrir a combinaciones de métodos alternativos sin animales (in silico, in chemico, in vitro) dentro de un enfoque integrado de pruebas y evaluación (IATA) para poder sustituir por completo los ensayos con animales que se utilizan en la actualidad, habida cuenta de la limitada cobertura en cuanto a los mecanismos de la AOP de cada uno de los métodos de ensayo actualmente disponibles sin animales (2) (7).

  Se propone el DPRA para abordar el fenómeno molecular desencadenante de la AOP de la sensibilización cutánea, que es la reactividad proteínica, cuantificando la reactividad de los productos problema frente a péptidos sintéticos modelo que contienen lisina o bien cisteína (8). Los valores de reducción porcentual de los péptidos que contienen cisteína y lisina se utilizan para clasificar las sustancias en una de los cuatro clases de reactividad en apoyo de la discriminación entre los sensibilizantes cutáneos y los no sensibilizantes (9).

  El DPRA se ha evaluado en un estudio de validación dirigido por el laboratorio de referencia de la Unión Europea para las alternativas a los ensayos con animales (LRUE del CEVMA) y sujeto posteriormente a revisión inter pares independiente por el Comité Científico Consultivo del CEVMA (ESAC) (10) y se considera científicamente válido como parte de un enfoque IATA para apoyar la discriminación entre los sensibilizantes cutáneos y los no sensibilizantes con fines de clasificación de peligro y etiquetado. En la bibliografía se recogen ejemplos del uso de datos del DPRA en combinación con otra información (11) (12) (13) (14).

  En el apéndice I se dan las definiciones pertinentes.

  CONSIDERACIONES INICIALES, APLICABILIDAD Y LIMITACIONES

  La correlación de la reactividad proteínica con el potencial de sensibilización cutánea está bien establecida (15) (16) (17). No obstante, dado que la unión a proteínas representa solamente uno de los fenómenos clave, aunque sea el fenómeno molecular desencadenante de la AOP de la sensibilización cutánea, la información sobre la reactividad proteínica obtenida con métodos de ensayo y otros no experimentales puede no ser suficiente por sí sola para llegar a una conclusión sobre la ausencia de potencial de sensibilización cutánea de los productos. Por lo tanto, los datos obtenidos con este método de ensayo deben considerarse en el contexto de enfoques integrados, como los enfoques IATA, combinándolos con otra información complementaria, por ejemplo derivada de ensayos in vitro que aborden otros fenómenos clave de la AOP de la sensibilización cutánea, así como de métodos no experimentales, incluida la extrapolación a partir de análogos químicos.

  El presente método de ensayo se puede utilizar en combinación con otra información complementaria, para apoyar la discriminación entre sensibilizantes cutáneos (es decir, categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas o del CLP) y no sensibilizantes en el contexto de un enfoque IATA. El presente método de ensayo no puede utilizarse por sí solo para clasificar sensibilizantes cutáneos en las subcategorías 1A y 1B definidas por el SGA de las Naciones Unidas o el CLP, ni para predecir la potencia de decisiones sobre evaluación de seguridad. Sin embargo, en función del marco normativo, un resultado positivo con el DPRA podrá utilizarse por sí solo para la clasificación de un producto en la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas o del CLP.

  Está comprobado que el método de ensayo DPRA es transferible a laboratorios con experiencia en los análisis con cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). El nivel de reproducibilidad de las predicciones que cabe esperar del método de ensayo es del orden del 85 % dentro de un laboratorio y del 80 % entre laboratorios (10). Los resultados obtenidos en el estudio de validación (18) y en estudios publicados (19) en general indican que la exactitud del DPRA en cuanto a la discriminación de los sensibilizantes (es decir, cat. 1 del SGA de las Naciones Unidas o del CLP) y los no sensibilizantes es del 80 % (N=157) con una sensibilidad del 80 % (88/109) y una especificidad del 77 % (37/48) en comparación con los resultados del LLNA. Es más probable que el DPRA subestime los productos que muestran una potencia de sensibilización cutánea baja o moderada (es decir, subcategoría 1B del SGA de las Naciones Unidas o del CLP) que los productos que presentan una potencia de sensibilización cutánea elevada (es decir, subcategoría 1A del SGA de las Naciones Unidas o del CLP) (18) (19). Sin embargo, los valores de la exactitud aquí indicados para el DPRA utilizado como único método de ensayo solo son indicativos, ya que el método de ensayo debe considerarse en combinación con otras fuentes de información en el contexto de un enfoque IATA y de conformidad con las disposiciones del punto 9 anterior. Además, a la hora de evaluar los métodos de ensayo de la sensibilización cutánea sin animales, debe tenerse en cuenta que el ensayo LLNA y otros ensayos con animales pueden no reflejar plenamente la situación en la especie de interés, es decir, los seres humanos. Sobre la base de los datos disponibles en general, se ha demostrado que el DPRA es aplicable a productos problema que abarcan una gran variedad de grupos funcionales orgánicos, mecanismos de reacción, potencias de sensibilización cutánea (determinada en estudios in vivo) y propiedades fisicoquímicas (8) (9) (10) (19). En conjunto, esta información indica la utilidad del DPRA para contribuir a la identificación del peligro de sensibilización cutánea.

  El término «producto problema» se utiliza en el presente método de ensayo para referirse a lo que se somete a ensayo y no está relacionado con la aplicabilidad del DPRA al ensayo de sustancias o mezclas. El presente método de ensayo no es aplicable a los compuestos metálicos, de los que se sabe que reaccionan con proteínas por mecanismos distintos de la unión covalente. El producto problema debe ser soluble en un disolvente adecuado a una concentración final de 100 mM (véase el punto 18). No obstante, los productos problema que no sean solubles a dicha concentración pueden someterse a ensayo a concentraciones solubles más bajas. En tal caso, un resultado positivo podría seguir utilizándose para apoyar la identificación del producto problema como sensibilizante cutáneo, pero de un resultado negativo no podría deducirse ninguna conclusión firme sobre la falta de reactividad. Se dispone actualmente de información limitada sobre la aplicabilidad del DPRA a las mezclas de composición conocida (18) (19). Sin embargo, se considera que el DPRA es técnicamente aplicable al ensayo de las sustancias con componentes múltiples y mezclas de composición conocida (véase el punto 18). Antes de la utilización de este método de ensayo con una mezcla para obtener datos con fines reglamentarios, debe considerarse si podría proporcionar resultados adecuados a tal fin y, en caso afirmativo, por qué. Tales consideraciones no son necesarias si la reglamentación impone el ensayo de la mezcla. El actual modelo de predicción no puede utilizarse con mezclas complejas de composición desconocida o con sustancias de composición desconocida o variable, productos complejos de reacción o materiales biológicos (es decir, sustancias UVCB) debido a la proporción molar definida del producto problema y del péptido. Con este fin, deberá desarrollarse un nuevo modelo de predicción basado en un enfoque gravimétrico. En los casos en que haya pruebas sobre la inaplicabilidad del método de ensayo a otras categorías específicas de productos, el método de ensayo no deberá utilizarse con tales categorías específicas de productos.

  El presente método de ensayo es un método in chemico que no incluye ningún sistema metabólico. Los productos que requieren bioactivation enzimática para realizar su potencial de sensibilización cutánea (es decir, pro-haptenos) no pueden detectarse por este método de ensayo. Se señala que los productos que se hacen sensibilizantes después de una transformación abiótica (es decir, pre-haptenos) son detectados correctamente en algunos casos por este método de ensayo (18). En vista de lo anterior, los resultados obtenidos con el método de ensayo deben interpretarse en el contexto de las limitaciones señaladas y en relación con otras fuentes de información en el marco de un enfoque IATA. Los productos problema que no se unan covalentemente al péptido sino que fomenten su oxidación (es decir, la dimerización de la cisteína) podrían provocar una posible sobreestimación de la reducción del péptido, con el consiguiente riesgo de predicciones positivas falsas o de la adscripción a una clase de reactividad más elevada (véanse los puntos 29 y 30).

  Tal como se describe, el DPRA apoya la discriminación entre los sensibilizantes cutáneos y los no sensibilizantes. No obstante, podrá contribuir también a la evaluación de la potencia sensibilizante (11) cuando se utilice en enfoques integrados, como los enfoques IATA. Sin embargo, es necesario seguir trabajando, preferentemente a partir de datos humanos, para determinar de qué modo los resultados del DPRA pueden informar sobre la evaluación de la potencia.

  PRINCIPIO DEL ENSAYO

  El DPRA es un método in chemico que cuantifica la concentración restante de péptido que contiene cisteína o lisina tras 24 horas de incubación a 25 ± 2,5 °C con el producto problema. Los péptidos sintéticos contienen fenilalanina a fin de ayudar en la detección. La concentración relativa del péptido se mide mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) con elución en gradiente y detección por UV a 220 nm. Los valores porcentuales de reducción del péptido con cisteína y lisina se calculan a continuación y se utilizan en un modelo de predicción (véase el punto 29) que permite asignar el producto problema a una de las cuatro clases de reactividad utilizadas para apoyar la discriminación entre sensibilizantes y no sensibilizantes.

  Antes de proceder al uso sistemático del método descrito en el presente método de ensayo, los laboratorios deben demostrar su competencia técnica, utilizando las diez sustancias recomendadas al efecto en el apéndice 2.

  PROCEDIMIENTO

  El presente método de ensayo se basa en el protocolo n.º 154 DB-ALM del DPRA (20), que representa el protocolo utilizado en el estudio de validación coordinado por el LRUE del CEVMA. Se recomienda que se siga este protocolo cuando se aplique y utilice el método en el laboratorio. A continuación se recoge una descripción de los principales componentes y procedimientos del DPRA. Si se utiliza una configuración alternativa de HPLC, debe demostrarse su equivalencia con la configuración validada descrita en el protocolo DB-ALM (por ejemplo, sometiendo a ensayo las sustancias para la competencia que figuran en el apéndice 2).

  Preparación de los péptidos que contienen cisteína o lisina

  Las soluciones madre de péptidos sintéticos que contienen cisteína (Ac-RFAACAA-COOH) y lisina (Ac-RFAAKAA-COOH), de pureza superior al 85 % y preferiblemente en la gama de 90-95 %, deben prepararse justo antes de su incubación con el producto problema. La concentración final del péptido con cisteína debe ser de 0,667 mM en solución amortiguadora de fosfato de pH 7,5, mientras que la concentración final del péptido con lisina debe ser de 0,667 mM en solución amortiguadora de acetato de amonio de pH 10,2. La secuencia de tandas de HPLC debe establecerse de forma que se mantenga el tiempo de análisis con HPLC por debajo de 30 horas. Con la configuración de HPLC utilizada en el estudio de validación y descrita en este método de ensayo, pueden acogerse en una misma tanda de HPLC hasta 26 muestras analíticas (que incluyen el producto problema, el testigo positivo y el número adecuado de testigos de disolvente en función del número de disolventes distintos utilizados en el ensayo, cada uno ensayado por triplicado). Todas las réplicas analizadas en la misma tanda deben utilizar las misma soluciones madre de péptidos con cisteína y lisina. Se recomienda comprobar los diferentes lotes de péptidos antes de su utilización para garantizar que su solubilidad es adecuada.

  Preparación del producto problema

  La solubilidad del producto problema en un disolvente adecuado debe evaluarse antes de realizar el ensayo siguiendo el procedimiento de solubilización descrito en el protocolo DB-ALM del DPRA (20). Un disolvente adecuado debe disolver completamente el producto problema. Dado que en el DPRA se incuba con péptidos de cisteína o de lisina un gran exceso de producto problema, la inspección visual de la formación de una solución clara se considera suficiente para determinar que está disuelto el producto problema (y todos sus componentes en el caso de someter a ensayo una sustancia de componentes múltiples o una mezcla). Son disolventes adecuados el acetonitrilo, el agua, la mezcla 1:1 de agua y acetonitrilo, el isopropanol, la acetona o la mezcla 1:1 de acetona y acetonitrilo. Pueden utilizarse otros disolventes siempre y cuando no afecten a la estabilidad del péptido controlada con testigos de referencia C (es decir, muestras constituidas por el péptido solo, disuelto en el disolvente adecuado; véase el apéndice 3). Como última opción, si el producto problema no es soluble en ninguno de estos disolventes, se debe intentar solubilizarlo en 300 μl de DMSO y diluir la solución resultante con 2 700 μl de acetonitrilo y, si el producto problema no es soluble en esta mezcla, se debe intentar solubilizar la misma cantidad de producto problema en 1 500 μl de DMSO y diluir la solución resultante con 1 500 μl de acetonitrilo. El producto problema debe pesarse previamente en frascos de vidrio y disolverse inmediatamente antes del ensayo en un disolvente apropiado a fin de preparar una solución 100 mM. Con las mezclas y las sustancias de componentes múltiples de composición conocida, deben determinarse una única pureza, sumando la proporción de sus componentes (excepto el agua), y un único peso molecular aparente, considerando los distintos pesos moleculares de cada componente de la mezcla (excepto el agua) y sus respectivas proporciones. La pureza y el peso molecular aparente resultantes deben utilizarse a continuación en el cálculo del peso de producto problema necesario para preparar una solución 100 mM. En el caso de los polímeros de los que no pueda determinarse un peso molecular predominante, podría considerarse el peso molecular del monómero (o el peso molecular aparente de los distintos monómeros que constituyen el polímero) para preparar una solución 100 mM. Sin embargo, cuando se someten a ensayo mezclas, sustancias de componentes múltiples o polímeros de composición conocida, debe considerarse la posibilidad de someter a ensayo también el producto puro. En el caso de los líquidos, el producto puro debe someterse a ensayo tal cual, sin dilución previa, incubándolo a las proporciones molares de 1:10 y 1:50 con los péptidos de cisteína y lisina, respectivamente. En el caso de los sólidos, el producto problema se debe disolver a la máxima concentración soluble en el mismo disolvente utilizado para preparar la solución de concentración aparente 100 mM. Debe entonces someterse a ensayo tal cual, sin diluir más, incubándolo a las proporciones molares de 1:10 y 1:50 con los péptidos de cisteína y lisina, respectivamente. Unos resultados concordantes (reactivos o no reactivos) entre la solución de concentración aparente 100 mM y el producto puro deben permitir la deducción de una conclusión firme sobre el resultado.

  Preparación del testigo positivo, de los testigos de referencia y de los testigos de coelución

  El aldehído cinámico (CAS 104-55-2; ≥ 95 % de pureza de grado alimentario) debe utilizarse como testigo positivo (TP) a una concentración de 100 mM en acetonitrilo. Pueden utilizarse otros testigos positivos adecuados que den preferentemente valores de reducción en la gama media, si se dispone de datos históricos para obtener criterios de aceptación de tandas comparables. Por otra parte, también han de incluirse testigos de referencia (es decir, muestras que contengan únicamente el péptido disuelto en el disolvente adecuado) en la secuencia de tandas de HPLC y se utilizan para comprobar la idoneidad del sistema de HPLC antes del análisis (testigos de referencia A), la estabilidad de los testigos de referencia a lo largo del tiempo (testigos de referencia B) y que el disolvente utilizado para disolver el producto problema no afecta a la reducción porcentual del péptido (testigos de referencia C) (véase el apéndice 3). El testigo de referencia apropiado para cada producto se utiliza para calcular la reducción porcentual del péptido correspondiente a ese producto (véase el punto 26). Además, respecto a cada uno de los productos problema analizados, debe incluirse en la secuencia de tandas un testigo de coelución constituido por el producto problema solo, a fin de detectar la posible coelución del producto problema con el péptido de lisina o de cisteína.

  Incubación del producto problema con las soluciones del péptido de lisina y de cisteína

  Las soluciones del péptido de cisteína y de lisina deben incubarse en frascos de vidrio del automuestreador con el producto problema a las proporciones de 1:10 y 1:50 respectivamente. Si se observa un precipitado inmediatamente después de la adición de la solución del producto problema a la solución de péptido, debido a la baja hidrosolubilidad del producto problema, no se puede estar seguro de qué proporción del producto problema permanece en la solución para reaccionar con el péptido. Por consiguiente, en ese caso, un resultado positivo puede ser útil todavía, pero un resultado negativo es incierto y debe interpretarse con la debida diligencia (véase también lo dispuesto en el punto 11 sobre el ensayo de productos insolubles hasta una concentración de 100 mM). La solución de reacción debe quedarse en la oscuridad y a 25 ± 2,5 °C durante 24 ± 2 horas antes del análisis con HPLC. Cada producto problema debe analizarse por triplicado con ambos péptidos. Se inspeccionarán visualmente unas muestras antes del análisis con HPLC. Si se observa precipitado o separación de fases, pueden centrifugarse las muestras a baja velocidad (100-400 x g) para llevar el precipitado hasta el fondo del frasco como precaución, ya que la presencia de grandes cantidades de precipitado puede obstruir los tubos o columnas de HPLC. Si se observa precipitación o separación de fases tras el período de incubación, es posible subestimar la reducción del péptido, por lo que en caso de resultado negativo no puede extraerse con la confianza suficiente ninguna conclusión sobre la falta de reactividad.

  Preparación de la curva patrón de calibración de HPLC

  Debe obtenerse una curva patrón de calibración para los péptidos, tanto para el de cisteína como para el de lisina. Deben prepararse patrones de los péptidos en una solución del 20 % o 25 % de acetonitrilo: solución amortiguadora, utilizando solución amortiguadora de fosfato (pH 7,5) para el péptido de cisteína y solución amortiguadora de acetato de amonio (pH 10,2) para el péptido de lisina. Utilizando diluciones en serie de la solución madre de péptido (0,667 mM), deben prepararse seis soluciones de calibración para cubrir la gama de 0,534 a 0,0167 mM. Debe incluirse también en la curva patrón de calibración un blanco de la solución amortiguadora de dilución. Las curvas de calibración adecuadas deben tener un valor r² > 0,99.

  Preparación de la HPLC y análisis

  La idoneidad del sistema de HPLC debe verificarse antes de efectuar el análisis. La reducción de los péptidos se determina mediante HPLC combinada con un detector de UV (detector por red de fotodiodos o detector de absorbancia de longitud de onda fija con señal de 220 nm). La columna correspondiente se instala en el sistema de HPLC. La configuración de HPLC descrita en el protocolo validado utiliza como columna preferida una Zorbax SB-C-18 de 2,1 mm × 100 mm × 3,5 micras. Con esta columna de HPLC de fase inversa, todo el sistema debe equilibrarse a 30 °C con un 50 % de fase A (0,1 % (v/v) de ácido trifluoroacético en agua) y un 50 % de fase B (0,085 % (v/v) de ácido trifluoroacético en acetonitrilo) durante al menos 2 horas antes de pasar la tanda. El análisis con HPLC debe efectuarse utilizando un caudal de 0,35 ml/min y un gradiente lineal del 10 % al 25 % de acetonitrilo durante 10 minutos, seguido de un rápido incremento hasta el 90 % de acetonitrilo para eliminar otros materiales. Deben inyectarse volúmenes iguales de cada patrón, muestra y testigo. La columna debe volver a equilibrarse entre inyecciones en las condiciones iniciales durante 7 minutos. Si se utiliza una columna de HPLC de fase inversa diferente, puede ser necesario ajustar los parámetros de configuración descritos anteriormente, para garantizar la adecuada elución e integración de los péptidos de cisteína y lisina, incluido el volumen de inyección, que podrá variar en función del sistema utilizado (normalmente en la banda de 3-10 μl). Si se utiliza una configuración alternativa de HPLC, es importante demostrar su equivalencia con la configuración validada descrita anteriormente (por ejemplo, sometiendo a ensayo las sustancias para la competencia que figuran en el apéndice 2). La absorbancia se mide a 220 nm. En caso de que se utilice un detector por red de fotodiodos, debe registrarse también la absorbancia a 258 nm. Debe señalarse que algunos lotes de acetonitrilo pueden tener un impacto negativo en la estabilidad de los péptidos, y esto ha de evaluarse cuando se utilice un nuevo lote de acetonitrilo. La relación entre el área del pico 220 y el área del pico 258 puede utilizarse como indicador de coelución. Respecto a cada muestra, una relación en la banda de 90 % < relación media (25) de las áreas de las muestras testigo <100 % puede constituir una buena indicación de que no ha habido coelución.

  Puede haber productos problema que favorezcan la oxidación del péptido de cisteína. El pico del péptido de cisteína dimerizado puede ser objeto de seguimiento visual. En los casos en que resulte que se ha producido dimerización, esto debe indicarse, ya que es posible sobrestimar la reducción porcentual del péptido, lo que llevaría a falsas predicciones positivas o a la asignación a una clase de reactividad más elevada (véanse los puntos 29 y 30).

  El análisis con HPLC de los péptidos de cisteína y de lisina puede realizarse simultáneamente (si se dispone de dos sistemas de HPLC) o en días distintos. Si el análisis se realiza en días distintos, todas las soluciones del producto problema deben prepararse de nuevo para los dos ensayos cada día. El análisis debe programarse para garantizar que la inyección de la primera muestra comienza entre 22 y 26 horas después de la mezcla del producto problema con la solución de péptido. La secuencia de tandas de HPLC debe establecerse de forma que se mantenga el tiempo de análisis con HPLC por debajo de 30 horas. Con la configuración de HPLC utilizada en el estudio de validación y descrita en este método de ensayo, pueden analizarse hasta 26 muestras en una sola tanda de HPLC (véase también el punto 17). En el apéndice 3 se encuentra un ejemplo de secuencia de análisis con HPLC.

  DATOS E INFORME

  Evaluación de los datos

  La concentración de péptido de cisteína o de lisina se determina por fotometría a 220 nm en cada muestra midiendo el área del pico (área bajo la curva, AUC) de los picos adecuados y se calcula la concentración de péptido utilizando la curva de calibración lineal obtenida con los patrones.

  La reducción porcentual de los péptidos en cada muestra se determina midiendo el área del pico y dividiéndola por la media del área del pico de los testigos de referencia C pertinentes (véase el apéndice 3), con arreglo a la fórmula descrita a continuación.

  

  Criterios de aceptación

  Para que una tanda se considere válida, deben cumplirse los siguientes criterios:

  • a) las curvas patrón de calibración deben tener un valor r² > 0,99.
  • b) el valor medio de la reducción porcentual de los péptidos de las tres réplicas del testigo positivo con aldehído cinámico debe situarse entre el 60,8 % y el 100 % en el caso del péptido de cisteína, y entre el 40,2 % y el 69,0 % en el del péptido de lisina, y la desviación típica máxima (SD) de las réplicas del testigo positivo debe ser < 14,9 % para la reducción porcentual de cisteína y < 11,6 % para la reducción porcentual de lisina, y
  • c) la concentración media de péptido en los testigos de referencia A debe ser de 0,50 ± 0,05 mM, y el coeficiente de variación (CV) de las áreas de los picos de los péptidos en los nueve testigos de referencia B y C en acetonitrilo debe ser < 15,0 %.

  En caso de que no se cumpla uno o varios de estos criterios, la tanda debe repetirse.

  Para que los resultados de un producto problema se consideren válidos, deben cumplirse los siguientes criterios:

  • a) la desviación típica máxima de las réplicas del producto problema debe ser < 14,9 % para la reducción porcentual de cisteína y < 11,6 % para la reducción porcentual de lisina,
  • b) la media de la concentración de péptidos de los tres testigos de referencia C en el disolvente adecuado debe ser 0,50 ± 0,05 mM. Si no se cumplen estos criterios, los datos deberán descartarse y la tanda repetirse con ese producto problema concreto.

  Modelo de predicción

  Se calcula la reducción porcentual media de cisteína y de lisina para cada producto problema. Una reducción negativa se considera «0» al calcular la media. Utilizando el modelo de predicción cisteína 1:10/lisina 1:50 que se muestra en el cuadro 1, ha de aplicarse el umbral del 6,38 % de reducción media de los péptidos para apoyar la discriminación entre los sensibilizantes cutáneos y los no sensibilizantes en el marco de un enfoque IATA. La aplicación del modelo de predicción para asignar un producto problema a una clase de reactividad (es decir, reactividad baja, moderada y elevada) puede quizás resultar útil para informar sobre la evaluación de la potencia en el marco de un enfoque IATA.

  Cuadro 1:

  Modelo de predicción (26) cisteína 1:10/lisina 1:50

  Media de la reducción porcentual de cisteína y lisina	Clase de reactividad	Predicción del DPRA (27)
  0 % ≤ reducción porcentual media ≤ 6,38 %	Reactividad nula o mínima	Negativa
  6,38 % < reducción porcentual media ≤ 22,62 %	Reactividad baja	Positiva
  22,62 % < reducción porcentual media ≤ 42,47 %	Reactividad moderada
  42,47 % < reducción porcentual media ≤ 100 %	Reactividad elevada

  Puede haber casos en los que el producto problema (la sustancia o uno o varios de los componentes de una sustancia de componentes múltiples o de una mezcla) absorba significativamente a 220 nm y tenga el mismo tiempo de retención que el péptido (coelución). La coelución puede resolverse ajustando ligeramente la configuración de la HPLC para separar más el tiempo de elución del producto problema y el del péptido. Si se utiliza una configuración alternativa de HPLC para resolver la coelución, se debe demostrar su equivalencia con la configuración validada (por ejemplo, sometiendo a ensayo las sustancias para la competencia que figuran en el apéndice 2). Cuando se produce coelución, no puede integrarse el pico del péptido y resulta imposible calcular la reducción porcentual del péptido. Si se produce coelución de tales productos problema tanto con el péptido de cisteína como con el de lisina, el análisis debe considerarse «no concluyente». En los casos en que solo se produce coelución con el péptido de lisina, puede utilizarse el modelo de predicción cisteína 1:10 indicado en el cuadro 2.

  Cuadro 2:

  Modelo de predicción (28) cisteína 1:10

  Reducción porcentual de cisteína (cis)	Clase de reactividad	Predicción del DPRA (29)
  0 % ≤ reducción porcentual de cis ≤ 13,89 %	Reactividad nula o mínima	Negativa
  13,89 % reducción porcentual de cis ≤ 23,09 %	Reactividad baja	Positiva
  23,09 % reducción porcentual de cis ≤ 98,24 %	Reactividad moderada
  98,24 % reducción porcentual de cis ≤ 100 %	Reactividad elevada

  Es posible que haya otros casos en los que sea incompleto el solapamiento entre el tiempo de retención del producto problema y el de alguno de los péptidos. En tales casos, pueden calcularse los valores de reducción porcentual de los péptidos, y se pueden utilizar en el modelo de predicción cisteína 1:10/lisina 1:50; sin embargo, la asignación del producto problema a una clase de reactividad no puede efectuarse con exactitud.

  Debe ser suficiente un único análisis de un producto problema con HPLC tanto para el péptido de cisteína como para el de lisina, si el resultado es inequívoco. Sin embargo, en casos de resultados próximos al umbral utilizado para discriminar entre resultados positivos y negativos (es decir, resultados límite), puede ser necesario efectuar más ensayos. En las situaciones en las que la reducción porcentual media está comprendida en el intervalo del 3 % al 10 % con el modelo de predicción cisteína 1:10/lisina 1:50 o la reducción porcentual de cisteína está comprendida en el intervalo del 9 % al 17 % con el modelo de predicción cisteína 1:10, debe considerarse la conveniencia de efectuar una segunda tanda, así como una tercera en caso de resultados discordantes entre las dos primeras.

  Informe del ensayo

  El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

  • Producto problema
    • - Sustancia con un solo componente
      • - Identificación química, como nombre o nombres IUPAC o CAS, número o números CAS, código SMILES o InChI, fórmula estructural, y/u otros identificadores;
      • - Aspecto físico, hidrosolubilidad, peso molecular, y otras propiedades fisicoquímicas pertinentes, en la medida de lo posible;
      • - Pureza, identidad química de las impurezas según convenga y sea factible en la práctica, etc.;
      • - Tratamiento antes del ensayo, en su caso (p. ej., calentamiento, trituración);
      • - Concentración o concentraciones estudiadas;
      • - Condiciones de almacenamiento y estabilidad en la medida de lo posible.
    • - Sustancia de componentes múltiples, sustancia UVCB y mezcla:
      • - Caracterización, en la medida de lo posible, mediante, por ejemplo, la identidad química (véase más arriba), pureza, presencia cuantitativa y propiedades fisicoquímicas pertinentes de los componentes (véase más arriba), en la medida de lo posible;
      • - Aspecto físico, hidrosolubilidad, y otras propiedades fisicoquímicas pertinentes, en la medida de lo posible;
      • - Peso molecular o peso molecular aparente en el caso de mezclas/polímeros de composición conocida u otra información pertinente para la realización del estudio;
      • - Tratamiento antes del ensayo, en su caso (p. ej., calentamiento, trituración);
      • - Concentración o concentraciones estudiadas;
      • - Condiciones de almacenamiento y estabilidad en la medida de lo posible.
  • Testigos
    • - Testigo positivo
      • - Identificación química, como nombre o nombres IUPAC o CAS, número o números CAS, código SMILES o InChI, fórmula estructural, y/u otros identificadores;
      • - Aspecto físico, hidrosolubilidad, peso molecular, y otras propiedades fisicoquímicas pertinentes, en la medida de lo posible;
      • - Pureza, identidad química de las impurezas según convenga y sea factible en la práctica, etc.;
      • - Tratamiento antes del ensayo, en su caso (p. ej., calentamiento, trituración);
      • - Concentración o concentraciones estudiadas;
      • - Condiciones de almacenamiento y estabilidad en la medida de lo posible;
      • - Referencia a los resultados de los testigos positivos históricos que demuestren unos criterios adecuados de aceptación de las tandas, si procede.
    • - Disolvente o vehículo
      • - Disolvente/vehículo utilizado y proporción de sus componentes, si procede;
      • - Identificación química, como nombre o nombres IUPAC o CAS, número o números CAS, y/u otros identificadores;
      • - Pureza, identidad química de las impurezas según convenga y sea factible en la práctica, etc.;
      • - Aspecto físico, peso molecular, y propiedades fisicoquímicas pertinentes adicionales en el caso de que se utilicen disolventes/vehículos distintos de los especificados en el método de ensayo y en la medida de lo posible;
      • - Condiciones de almacenamiento y estabilidad en la medida de lo posible;
      • - Justificación de la elección del disolvente para cada producto problema;
      • - Respecto al acetonitrilo, resultados del ensayo de impacto en la estabilidad de los péptidos.
  • Preparación de los péptidos, testigo positivo y producto problema
    • - Caracterización de las soluciones de péptidos (proveedor, lote, peso exacto del péptido, volumen añadido para la solución madre);
    • - Caracterización de la solución de testigo positivo (peso exacto de sustancia de testigo positivo, volumen añadido para la solución problema);
    • - Caracterización de las soluciones de producto problema (peso exacto de producto problema, volumen añadido para la solución problema).
  • Ajustes instrumentales de la HPLC y análisis
    • - Tipo de instrumento de HPLC, columna de HPLC y precolumna, detector, automuestreador;
    • - Parámetros pertinentes para el análisis con HPLC, como la temperatura de la columna, volúmenes de inyección, caudal y gradiente.
  • Idoneidad del sistema
    • - Área del pico del péptido a 220 nm de cada réplica de patrón y de testigo de referencia A;
    • - Curva de calibración lineal representada gráficamente y valor de r² notificado;
    • - Concentración de péptidos de cada réplica de los testigos de referencia A;
    • - Concentración media de péptidos (mM) de los tres testigos de referencia A, SD y CV;
    • - Concentración de péptidos de los testigos de referencia A y C.
  • Secuencia de análisis
    • - Respecto a los testigos de referencia:
      • - Área del pico del péptido a 220 nm de cada réplica de B y C;
      • - Área media del pico del péptido a 220 nm de los nueve testigos de referencia B y C en acetonitrilo, SD y CV (para la estabilidad de los testigos de referencia a lo largo del tiempo del análisis);
      • - Respecto a cada disolvente utilizado, área media del pico del péptido a 220 nm de los tres testigos de referencia C adecuados (para el cálculo de la reducción porcentual de los péptidos);
      • - Respecto a cada disolvente utilizado, concentración de péptido (mM) en los tres testigos de referencia C adecuados;
      • - Respecto a cada disolvente utilizado, concentración media de péptido (mM) en los tres testigos de referencia C, SD y CV adecuados.
    • - Respecto al testigo positivo:
      • - Área del pico del péptido a 220 nm de cada réplica;
      • - Reducción porcentual del péptido de cada réplica;
      • - Reducción porcentual media del péptido de las tres réplicas, SD y CV.
    • - Respecto a cada producto problema:
      • - Aparición de precipitado en la mezcla de reacción al final del período de incubación, si se ha observado; si el precipitado se centrifuga o se vuelve a solubilizar;
      • - Presencia de coelución;
      • - Descripción de cualesquiera otras observaciones pertinentes, si procede;
      • - Área del pico del péptido a 220 nm de cada réplica;
      • - Reducción porcentual del péptido de cada réplica;
      • - Reducción porcentual media del péptido de las tres réplicas, SD y CV;
      • - Valores de reducción porcentual media de cisteína y de lisina;
      • - Modelo de predicción utilizado y predicción del DPRA.
  • Ensayos de competencia
    • - En su caso, procedimiento utilizado para demostrar la competencia del laboratorio en cuanto a la utilización del método de ensayo (por ejemplo, mediante el ensayo de sustancias para la competencia) o para demostrar que el método de ensayo proporciona resultados reproducibles a lo largo del tiempo.
  • Discusión de los resultados
    • - Discusión de los resultados obtenidos con el método de ensayo DPRA;
    • - Discusión de los resultados obtenidos con el método de ensayo en el contexto de un enfoque IATA si se dispone de otra información pertinente.

  Conclusión

  BIBLIOGRAFÍA

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  • (13) Nukada et al. (2013). Data integration of non-animal tests for the development of a test battery to predict the skin sensitizing potential and potency of chemicals. Toxicology in vitro 27:609 618.
  • (14) Ball et al (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regulatory Toxicology and Pharmacology 60:389-400.
  • (15) Landsteiner and Jacobs (1936). Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds. Journal of Experimental Medicine 64:625-639.
  • (16) Dupuis and Benezra (1982). Allergic contact dermatitis to simple chemicals: a molecular approach. New York & Basel: Marcel Dekker Inc.
  • (17) Lepoittevin et al. (1998). Allergic contact dermatitis: the molecular basis. Springer, Berlin.
  • (18) LRUE del CEVMA (2012). Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) Validation Study Report 74pp. Accessible at: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra
  • (19) Natsch et al. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, published online, 9 April 2013, DOI:10.1002/jat.2868.
  • (20) DB-ALM (INVITTOX) Protocol 154: Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing 17pp. Accessible at: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/
  • (21) OCDE (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment, No. 34. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, France.
  • (22) FDA (Food and Drug Administration (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation 22pp. Accessible at: www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidance/ucm070107.pdf - 138
  • (23) ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87).

  Apéndice 1

  DEFINICIONES

  Exactitud : Grado de coincidencia entre los resultados obtenidos con el método de ensayo y los valores de referencia aceptados. Se trata de una medida del comportamiento del método de ensayo y es un aspecto de su »pertinencia«. Este término y el de »concordancia« se suelen usar indistintamente para indicar la proporción de resultados correctos de un método de ensayo (21).

  Ruta de resultados adversos (AOP, Adverse Outcome Pathway) : Secuencia de fenómenos desde la estructura química de un producto o grupo de productos similares diana, pasando por el fenómeno molecular desencadenante, hasta un resultado in vivo de interés (2).

  Curva de calibración : Relación entre el valor de la respuesta experimental y la concentración analítica (también denominada curva patrón) de una sustancia conocida.

  Producto : Sustancia o mezcla.

  Coeficiente de variación : Medida de la variabilidad que se calcula para un grupo de datos replicados dividiendo la desviación típica por la media. Puede multiplicarse por 100 para expresarlo como porcentaje.

  Peligro : Propiedad inherente de un agente o situación que tiene capacidad para provocar efectos adversos cuando un organismo, sistema o (sub)población se expone a dicho agente.

  Enfoque integrado de pruebas y evaluación (IATA, Integrated Approach to Testing and Assessment) : Enfoque estructurado para la identificación del peligro (potencial), caracterización del peligro (potencia) o evaluación de la seguridad (potencial/potencia y exposición) de un producto o grupo de productos, que integra y pondera de forma estratégica todos los datos pertinentes para fundamentar una decisión reglamentaria relativa a posibles peligros o riesgos o a la necesidad de realizar ensayos más específicos y, por tanto, mínimos.

  Fenómeno molecular desencadenante : Perturbación de un sistema biológico inducida por un producto a nivel molecular y caracterizada como el fenómeno inicial de la ruta de resultados adversos.

  Mezcla : Mezcla o solución compuesta por dos o más sustancias que no reaccionan en ella (1).

  Sustancia con un solo componente: Sustancia, definida por su composición cuantitativa, en la que un solo componente principal representa al menos el 80 % (p/p).

  Sustancia de componentes múltiples: Sustancia, definida por su composición cuantitativa, en la que hay varios componentes principales presentes a una concentración ≥ 10 % (p/p) y < 80 % (p/p). Una sustancia de componentes múltiples es el resultado de un proceso de fabricación. La diferencia entre mezcla y sustancia de componentes múltiples es que una mezcla se obtiene mezclando dos o más sustancias sin reacción química, mientras que una sustancia de componentes múltiples es el resultado de una reacción química.

  Testigo positivo: Réplica que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo y que se trata con una sustancia de la que se sabe que induce una respuesta positiva. Para asegurar la posibilidad de evaluar la variabilidad de las respuestas del testigo positivo a lo largo del tiempo, no debe ser excesiva la magnitud de la respuesta positiva.

  Testigo de referencia: Muestra no tratada que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo, incluido el disolvente o vehículo, y que se somete al mismo proceso que las muestras tratadas con el producto problema y otras muestras testigo a fin de determinar la respuesta de base correspondiente a las muestras tratadas con el producto problema disuelto en el mismo disolvente o vehículo. Cuando se somete a ensayo con un testigo negativo en paralelo, esta muestra pone de manifiesto también si el disolvente o vehículo interactúa con el sistema de ensayo.

  Pertinencia: Descripción de la relación del ensayo con el efecto de interés y de si es significativo y útil para un objetivo concreto. Es el grado en que el ensayo mide o predice correctamente el efecto biológico de interés. La pertinencia incorpora la consideración de la exactitud (concordancia) de un método de ensayo (21).

  Fiabilidad: Medida del grado en que un método de ensayo puede aplicarse de forma reproducible a lo largo del tiempo, en un mismo laboratorio y en distintos laboratorios, utilizando el mismo protocolo. Se evalúa calculando la reproducibilidad intra e interlaboratorios y la repetibilidad intralaboratorios (21).

  Reproducibilidad: Coincidencia entre los resultados obtenidos en el ensayo del mismo producto utilizando el mismo protocolo de ensayo (véase »Fiabilidad«) (21).

  Sensibilidad: Proporción de todos los productos activos/positivos que se clasifican correctamente mediante el método de ensayo. Es una medida de la exactitud de un método de ensayo que produce resultados categoriales, y un factor importante en la evaluación de la pertinencia de un método de ensayo (21).

  Especificidad: Proporción de todos los productos inactivos/negativos que se clasifican correctamente mediante el método de ensayo. Es una medida de la exactitud de un método de ensayo que produce resultados categoriales, y un factor importante en la evaluación de la pertinencia de un método de ensayo (21)

  Sustancia: Elementos químicos y sus compuestos en estado natural u obtenidos mediante cualquier proceso de producción, incluidos los aditivos necesarios para mantener la estabilidad del producto y las eventuales impurezas derivadas del proceso empleado, pero excluidos los disolventes que se puedan separar sin influir en la estabilidad de la sustancia ni cambiar su composición (1).

  Idoneidad del sistema: Determinación del comportamiento de un instrumento (por ejemplo, sensibilidad) mediante el análisis de un patrón de referencia antes de aplicarlo al lote analítico (22).

  Producto problema: El término »producto problema« se utiliza para hacer referencia a lo que se somete a ensayo.

  Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos de las Naciones Unidas (SGA de la ONU): Sistema que propone la clasificación de productos químicos (sustancias y mezclas) según tipos y niveles normalizados de peligros físicos, sanitarios y ambientales, y que hace referencia a los elementos correspondientes de comunicación, como pictogramas, palabras de advertencia, indicaciones de peligro, consejos de prudencia, y fichas de datos de seguridad, a efectos de proporcionar información sobre sus efectos adversos con el fin de proteger a la población (incluidos empresarios, trabajadores, transportistas, consumidores y personal de protección civil) y al medio ambiente (1).

  UVCB: Sustancias de composición desconocida o variable, productos complejos de reacción o materiales biológicos.

  Método de ensayo válido: Método de ensayo del que se considera que tiene suficiente pertinencia y fiabilidad con un fin específico y que se basa en principios sólidos desde el punto de vista científico. Un método de ensayo nunca es válido en un sentido absoluto, sino únicamente en relación con un fin determinado (21).

  Apéndice 2 SUSTANCIAS UTILIZADAS PARA DEMOSTRAR LA COMPETENCIA

  Sensibilización cutánea in chemico: Ensayo directo de reactividad peptídica

  Antes de proceder al uso sistemático de este método de ensayo, los laboratorios deben demostrar su competencia técnica mediante la correcta obtención de la predicción del DPRA prevista respecto a las diez sustancias recomendadas al efecto en el cuadro 1, y la obtención de valores de reducción de cisteína y lisina que estén dentro de la gama de referencia con ocho de las diez sustancias utilizadas para demostrar la competencia en relación con cada péptido. Estas sustancias para la competencia se han seleccionado a fin de representar la gama de respuestas de los peligros de sensibilización cutánea. Otros criterios de selección son su disponibilidad comercial, la disponibilidad de datos de referencia in vivo de alta calidad y de datos de alta calidad obtenidos in vitro con el DPRA, y que se hayan utilizado en el estudio de validación coordinado por el LRUE del CEVMA para demostrar el éxito de la aplicación del método de ensayo en los laboratorios participantes.

  Cuadro 1:

  Sustancias recomendadas para demostrar la competencia técnica respecto al ensayo directo de reactividad peptídica

  Sustancias para la competencia	CAS RN	Estado físico	Predicción in vivo   (30)	Predicción del DPRA (31)	Intervalo (32) de reducción porcentual del péptido de cisteína	Intervalo (32) de reducción porcentual del péptido de lisina
  2,4-Dinitroclorobenceno	97-00-7	Sólido	Sensibilizante (extremo)	Positiva	90-100	15-45
  Oxazolona	15646-46-5	Sólido	Sensibilizante (extremo)	Positiva	60-80	10-55
  Formaldehído	50-00-0	Líquido	Sensibilizante (fuerte)	Positiva	30-60	0-24
  Bencilidenacetona	122-57-6	Sólido	Sensibilizante (moderado)	Positiva	80-100	0-7
  Farnesal	19317-11-4	Líquido	Sensibilizante (débil)	Positiva	15-55	0-25
  2,3-Butanodiona	431-03-8	Líquido	Sensibilizante (débil)	Positiva	60-100	10-45
  1-Butanol	71-36-3	Líquido	No sensibilizante	Negativa	0-7	0-5,5
  6- Metilcumarina	92-48-8	Sólido	No sensibilizante	Negativa	0-7	0-5,5
  Ácido láctico	50-21-5	Líquido	No sensibilizante	Negativa	0-7	0-5,5
  4-Metoxiacetofenona	100-06-1	Sólido	No sensibilizante	Negativa	0-7	0-5,5

  Apéndice 3 EJEMPLOS DE SECUENCIA DE ANÁLISIS

  Patrones de calibración y testigos de referencia	STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 Amortiguador de dilución Testigo de referencia A, rep 1 Testigo de referencia A, rep 2 Testigo de referencia A, rep 3
  Testigos de coelución	Testigo de coelución 1 para el producto problema 1 Testigo de coelución 2 para el producto problema 2
  Testigos de referencia	Testigo de referencia B, rép. 1 Testigo de referencia B, rép. 2 Testigo de referencia B, rép. 3
  Primera serie de réplicas	Testigo de referencia C, rép. 1 Aldehído cinámico, rép. 1 Muestra 1, rép. 1 Muestra 2, rép. 1
  Segunda serie de réplicas	Testigo de referencia C, rép. 2 Aldehído cinámico, rép. 2 Muestra 1, rép. 2 Muestra 2, rép. 2
  Tercera serie de réplicas	Testigo de referencia C, rép. 3 Aldehído cinámico, rép. 3 Muestra 1, rép. 3 Muestra 2, rép. 3
  Testigos de referencia	Testigo de referencia B, rép. 4 Testigo de referencia B, rép. 5 Testigo de referencia B, rép. 6
  Deben incluirse en la secuencia de análisis tres series de testigos de referencia (es decir, muestras constituidas únicamente por el péptido disuelto en el disolvente adecuado): -Testigo de referencia A: utilizado para comprobar la idoneidad del sistema de HPLC. -Testigo de referencia B: incluido al principio y al final de la secuencia de análisis para comprobar la estabilidad de los testigos de referencia a lo largo del tiempo de análisis. -Testigo de referencia C: incluido en la secuencia de análisis a fin de verificar que el disolvente utilizado para disolver el producto problema no afecta a la reducción porcentual del péptido.

  B.60
  
  Sensibilización cutánea in vitro: Método de ensayo de la luciferasa ARE-Nrf2

  INTRODUCCIÓN

  El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 442D (2015). Un sensibilizante cutáneo es una sustancia que induce una respuesta alérgica por contacto con la piel, tal como se define en el Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos de las Naciones Unidas (SGA de la ONU) (1) y en el Reglamento (CE) n.º 1272/2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas (CLP) de la Unión Europea (UE) (33) . El presente método de ensayo proporciona un procedimiento in vitro (ensayo de la luciferasa ARE-Nrf2) utilizado para apoyar la discriminación entre los sensibilizantes cutáneos y los no sensibilizantes de conformidad con el SGA de la ONU (1) y el CLP.

  Existe un acuerdo general sobre los principales fenómenos biológicos subyacentes a la sensibilización cutánea. Los actuales conocimientos acerca de los mecanismos biológicos y químicos asociados con la sensibilización cutánea se han resumido en forma de una ruta de resultados adversos (Adverse Outcome Pathway, AOP) (2), que va desde el fenómeno molecular desencadenante, pasando por los fenómenos intermedios, hasta el efecto adverso para la salud, es decir la dermatitis alérgica de contacto en seres humanos o la hipersensibilidad de contacto en roedores (2) (3). El fenómeno molecular desencadenante es la unión covalente de sustancias electrofílicas a los centros nucleofílicos de las proteínas de la piel. El segundo fenómeno clave en esta AOP tiene lugar en los queratinocitos e incluye las respuestas inflamatorias, así como la expresión génica relacionada con rutas específicas de comunicación celular, tales como las rutas dependientes del elemento de respuesta antioxidante/electrófilo (ARE, antioxidant/electrophile response element). El tercer fenómeno clave es la activación de las células dendríticas, normalmente evaluada por la expresión de marcadores específicos de la superficie celular, quimiocinas y citocinas. El cuarto fenómeno clave es la proliferación de linfocitos T, que se evalúa indirectamente en el ensayo con ganglios linfáticos locales de múridos (4).

  Tradicionalmente, la evaluación de la sensibilización cutánea se hacía con animales de laboratorio. Los métodos clásicos con cobayas, como el ensayo de maximización con cobayas de Magnusson y Kligman (GMPT) y el ensayo de Buehler [método B.6 (5)], estudian tanto la fase de inducción como la de desencadenamiento de la sensibilización cutánea. Un ensayo con múridos, el ensayo con ganglios linfáticos locales [LLNA, método B.42 (4)], y sus dos modificaciones no radiactivas, el LLNA: DA [método B.50 (6)] y el LLNA: BrdU-ELISA [método B.51 (7)], que evalúan exclusivamente la respuesta de inducción, también han conseguido aceptación porque, sobre los ensayos con cobayas, tienen ventaja en relación tanto con el bienestar de los animales como con la medición objetiva de la fase de inducción de la sensibilización cutánea.

  Más recientemente, algunos métodos farmacodinámicos in chemico e in vitro se han considerado científicamente válidos para la evaluación del peligro de sensibilización cutánea que representan los productos. Sin embargo, será necesario recurrir a combinaciones de métodos alternativos sin animales (in silico, in chemico, in vitro) dentro de un enfoque integrado de pruebas y evaluación (IATA) para poder sustituir por completo los ensayos con animales que se utilizan en la actualidad, habida cuenta de la limitada cobertura en cuanto a los mecanismos de la AOP de cada uno de los métodos de ensayo actualmente disponibles sin animales (2) (3).

  Se propone el presente método de ensayo (ensayo de la luciferasa ARE-Nrf2) para abordar el segundo fenómeno clave, como se explica en el punto 2. Se ha notificado que los sensibilizantes cutáneos inducen genes que están regulados por el elemento de respuesta antioxidante (ARE) (8) (9). Las pequeñas sustancias electrofílicas tales como los sensibilizantes cutáneos pueden actuar sobre la proteína sensora Keap1 (proteína 1 asociada a ECH y de tipo Kelch) mediante, por ejemplo, la modificación covalente de su residuo de cisteína, lo que da lugar a que se disocie del factor de transcripción Nrf2 (factor nuclear 2 relacionado con el factor eritroide-2). El Nrf2 disociado puede entonces activar genes dependientes del ARE, como los genes que codifican las enzimas de destoxificación de fase II (8) (10) (11).

  En la actualidad, el único ensayo de la luciferasa ARE-Nrf 2 in vitro correspondiente al presente método de ensayo es el ensayo KeratinoSens^TM para el cual se han completado estudios de validación (9) (12) (13), seguidos de una revisión independiente inter pares dirigida por el laboratorio de referencia de la Unión Europea para las alternativas a los ensayos con animales (LRUE del CEVMA) (14). El ensayo KeratinoSens^TM fue considerado científicamente válido para utilizarse como parte de un enfoque IATA, en apoyo de la discriminación entre los sensibilizantes cutáneos y los no sensibilizantes con fines de clasificación de peligro y etiquetado (14). Los laboratorios que deseen aplicar el método de ensayo pueden obtener la línea celular recombinante utilizada en el ensayo KeratinoSens^TM estableciendo un acuerdo de licencia con el creador del método de ensayo (15).

  En el apéndice 1 se dan las definiciones pertinentes.

  CONSIDERACIONES INICIALES, APLICABILIDAD Y LIMITACIONES

  Dado que la activación de la ruta Keap1-Nrf2-ARE aborda únicamente el segundo fenómeno clave de la AOP de la sensibilización cutánea, resulta poco probable que la información obtenida con los métodos de ensayo basados en la activación de esta ruta sea suficiente por sí sola para permitir una conclusión sobre el potencial de sensibilización cutánea de los productos. Por lo tanto, los datos obtenidos con el presente método de ensayo deben considerarse en el contexto de enfoques integrados, como los enfoques IATA, combinándolos con otra información complementaria, por ejemplo derivada de ensayos in vitro que aborden otros fenómenos clave de la AOP de la sensibilización cutánea, así como de métodos no experimentales, incluida la extrapolación a partir de análogos químicos. En la bibliografía se recogen ejemplos del uso del método de la luciferasa ARE-Nrf2 en combinación con otra información (13) (16) (17) (18) (19).

  El presente método de ensayo se puede utilizar para apoyar la discriminación entre sensibilizantes cutáneos (es decir, categoría 1 del SGA de la ONU o del CLP) y no sensibilizantes en el contexto de un enfoque IATA. El presente método de ensayo no puede utilizarse por sí solo para subcategorizar los sensibilizantes cutáneos en las subcategorías 1A y 1B definidas por el SGA de la ONU o el CLP, ni para predecir la potencia de las decisiones sobre la evaluación de la seguridad. Sin embargo, en función del marco normativo, un resultado positivo podrá utilizarse por sí solo para la clasificación de un producto en la categoría 1 del SGA de la ONU o del CLP.

  Sobre la base del conjunto de datos obtenidos del estudio de validación y de ensayos internos utilizados para la revisión inter pares independiente del método de ensayo, el ensayo KeratinoSens^TM resultó ser transferible a laboratorios con experiencia en cultivo celular. El nivel de reproducibilidad de las predicciones que cabe esperar del método de ensayo es del orden del 85 % dentro de un laboratorio y entre laboratorios (14). La exactitud (77 % - 155/201), la sensibilidad (78 % - 71/91) y la especificidad (76 % - 84/110) del ensayo KeratinoSens^TM para discriminar los sensibilizantes cutáneos (es decir, Cat. 1 del SGA de la ONU o del CLP) de los no sensibilizantes en comparación con los resultados del LLNA se calcularon teniendo en cuenta todos los datos presentados al LRUE del CEVMA para la evaluación y revisión inter pares del método de ensayo (14). Estas cifras son similares a las publicadas recientemente sobre la base de ensayos internos de unas 145 sustancias (77 % de exactitud, 79 % de sensibilidad, 72 % de especificidad) (13). Es más probable que el ensayo KeratinoSens^TM subestime los productos que muestran una potencia de sensibilización cutánea baja o moderada (es decir, subcategoría 1B del SGA de la ONU o del CLP) que los productos que presentan una potencia de sensibilización cutánea elevada (es decir, subcategoría 1A del SGA de la ONU o del CLP) (13) (14). En conjunto, esta información indica la utilidad del ensayo KeratinoSens^TM para contribuir a la identificación del peligro de sensibilización cutánea. Sin embargo, los valores de la exactitud aquí indicados para el ensayo KeratinoSens^TM utilizado como único método de ensayo solo son indicativos, ya que el método de ensayo debe considerarse en combinación con otras fuentes de información en el contexto de un enfoque IATA y de conformidad con las disposiciones del punto 9 anterior. Por otra parte, a la hora de evaluar los métodos de ensayo de la sensibilización cutánea sin animales, debe tenerse en cuenta que el LLNA y otros ensayos con animales pueden no reflejar plenamente la situación en la especie de interés, es decir, los seres humanos.

  El término «producto problema» se utiliza en el presente método de ensayo para referirse a lo que se somete a ensayo y no está relacionado con la aplicabilidad del método de ensayo de la luciferasa ARE-Nrf2 al ensayo de sustancias o mezclas. Sobre la base de los datos disponibles actualmente, se ha demostrado que el ensayo KeratinoSens^TM es aplicable a productos problema que abarcan una variedad de grupos funcionales orgánicos, mecanismos de reacción, potencias de sensibilización cutánea (determinada con estudios in vivo) y propiedades fisicoquímicas (9) (12) (13) (14). Se han sometido a ensayo principalmente sustancias con un solo componente, aunque también existe una cantidad limitada de datos sobre ensayos de mezclas (20). Sin embargo, el método de ensayo es técnicamente aplicable a los ensayos de sustancias de componentes múltiples y de mezclas. No obstante, antes de la utilización de este método de ensayo con una mezcla para obtener datos con fines reglamentarios, debe considerarse si podría proporcionar resultados adecuados a tal fin y, en caso afirmativo, por qué. Tales consideraciones no son necesarias si la reglamentación impone el ensayo de la mezcla. Por otra parte, al ensayar sustancias de componentes múltiples o mezclas, deben tenerse en cuenta las posibles interferencias de componentes citotóxicos con las respuestas obtenidas. El método de ensayo es aplicable a productos problema solubles o que formen una dispersión estable (es decir, un coloide o una suspensión en que el producto problema no sedimente ni se separe del disolvente para formar distintas fases) en agua o en DMSO (incluyendo todos los componentes del producto problema en caso de que se realice el ensayo de una sustancia de componentes múltiples o una mezcla). Los productos problema que no cumplan estas condiciones a la concentración final más elevada requerida de 2 000 μM (véase el punto 22) pueden someterse a ensayo a concentraciones más bajas. En tal caso, los resultados que reúnan los criterios de positividad descritos en el punto 39 pueden utilizarse para apoyar la identificación del producto problema como sensibilizante cutáneo, mientras que un resultado negativo obtenido con concentraciones < 1 000 μM debe considerarse como no concluyente (véase el modelo de predicción en el punto 39). En general, se han sometido a ensayo con éxito sustancias con Log P de hasta 5, mientras que las sustancias extremamente hidrófobas con Log P por encima de 7 se encuentran fuera de la aplicabilidad conocida del método de ensayo (14). Sobre las sustancias cuyo Log P está comprendido entre 5 y 7, solo se dispone de información limitada.

  Los resultados negativos deben interpretarse con cautela, ya que las sustancias con reactividad exclusiva frente a los residuos de lisina pueden detectarse como negativas por el método de ensayo. Por otra parte, debido a la limitada capacidad metabólica de la línea celular utilizada (21) y debido a las condiciones experimentales, pueden obtenerse también resultados negativos con los pro-haptenos (es decir, productos que requieren activación enzimática, por ejemplo mediante enzimas P450) y pre-haptenos (es decir, productos activados por auto-oxidación), en particular con una baja velocidad de oxidación. Los productos problema que no actúan como sensibilizantes pero que, no obstante, provocan agresión química pueden dar lugar, en cambio, a resultados positivos falsos (14). Por otra parte, no siempre es posible someter a ensayo de forma fiable los productos problema muy citotóxicos. Por último, los productos problema que interfieran con la enzima luciferasa pueden afectar a la actividad de esta en ensayos con células, provocando inhibición o aumento aparentes de la luminiscencia (22). Por ejemplo, se ha informado de que las concentraciones de fitoestrógenos superiores a 1 μM interfieren con las señales de luminiscencia en otros ensayos de luciferasa con gen marcador debido a la sobreactivación del gen marcador de la luciferasa (23). Como consecuencia, debe examinarse detenidamente la expresión de la luciferasa obtenida a altas concentraciones de fitoestrógenos o de productos similares sospechosos de provocar la sobreactivación fitoestrogenoide del gen marcador de la luciferasa (23). En los casos en que haya pruebas sobre la inaplicabilidad del método de ensayo a otras categorías específicas de productos problema, el método de ensayo no deberá utilizarse con tales categorías específicas.

  Además del apoyo a la discriminación entre los sensibilizantes cutáneos y los no sensibilizantes, el ensayo KeratinoSens^TM también ofrece información sobre la relación concentración-respuesta que puede contribuir potencialmente a la evaluación de la potencia de sensibilización cuando se utiliza en enfoques integrados, como los IATA (19). Sin embargo, es necesario seguir trabajando, preferentemente a partir de datos fiables obtenidos con seres humanos, para determinar cómo el ensayo KeratinoSens^TM puede contribuir a la evaluación de la potencia (24) y a la subcategorización de los sensibilizantes de acuerdo con el SGA de la ONU o del CLP.

  PRINCIPIO DEL ENSAYO

  El método de ensayo de la luciferasa ARE-Nrf2 utiliza una línea celular adherida inmortalizada derivada de queratinocitos humanos HaCaT transinfectados de forma estable con un plásmido seleccionable. La línea celular contiene el gen de la luciferasa bajo el control transcripcional de un promotor constitutivo fusionado con un elemento ARE de un gen conocido por elevar su expresión ante la presencia de sensibilizantes por contacto (25) (26). La señal de la luciferasa refleja la activación, provocada por los sensibilizantes, de los genes dependientes de Nrf2 endógeno, y se ha demostrado que la señal de la luciferasa en la línea celular recombinante depende del Nrf2 (27). Esto permite la medición cuantitativa (mediante detección de la luminiscencia) de la inducción del gen de la luciferasa, utilizando sustratos de luciferasa bien conocidos que producen luz, como indicador de la actividad del factor de transcripción Nrf2 en las células tras su exposición a sustancias electrofílicas.

  Los productos problema se consideran positivos en el ensayo KeratinoSens™ si provocan de forma estadísticamente significativa la inducción de la actividad de la luciferasa por encima de un determinado umbral (es decir, un factor multiplicador > 1,5 o un incremento del 50 %), por debajo de una concentración definida que no afecte de forma significativa a la viabilidad celular (es decir, de menos de 1 000 μM y a una concentración en la que la viabilidad celular se sitúe por encima del 70 % (9) (12)). Con este fin, se determina el factor multiplicador máximo de la inducción de la actividad de la luciferasa respecto al testigo de disolvente (negativo) (I_máx). Por otra parte, como se exponen las células a una serie de concentraciones de los productos problema, la concentración necesaria para una inducción estadísticamente significativa de la actividad de la luciferasa por encima del umbral (es decir, valor EC_1,5) se interpolará a partir de la curva dosis-respuesta (para el cálculo, véase el punto 32). Por último, debe procederse a medir en paralelo la citotoxicidad con el fin de evaluar si se dan niveles de inducción de la actividad de la luciferasa a concentraciones subcitotóxicas.

  Antes de proceder al uso sistemático del ensayo de la luciferasa ARE-Nrf2 según el presente método de ensayo, los laboratorios deben demostrar su competencia técnica, utilizando las diez sustancias recomendadas al efecto en el apéndice 2.

  Se dispone de normas de comportamiento (28) para facilitar la validación de métodos de ensayo de la luciferasa ARE-Nrf2 in vitro nuevos o modificados, similares al ensayo KeratinoSens™, las cuales permiten la oportuna modificación del presente método de ensayo para su inclusión. La mutua aceptación de datos (MAD) con arreglo al acuerdo de la OCDE solo estará garantizada respecto a métodos de ensayo validados de conformidad con dichas normas de comportamiento, si estos métodos de ensayo han sido revisados e incluidos en las correspondientes directrices de ensayo por la OCDE.

  PROCEDIMIENTO

  En la actualidad, el único método que se acoge al presente método de ensayo es el ensayo KeratinoSens^TM científicamente válido (9) (12) (13) (14). Se dispone de procedimientos normalizados de trabajo (Standard Operating Procedures, SOP) para el ensayo KeratinoSens^TM y deben emplearse cuando se aplica y utiliza el método de ensayo en el laboratorio (15). Los laboratorios que deseen aplicar el método de ensayo pueden obtener la línea celular recombinante utilizada en el ensayo KeratinoSens^TM estableciendo un acuerdo de licencia con el creador del método de ensayo. En los siguientes puntos se ofrece una descripción de los principales componentes y procedimientos del método de ensayo de la luciferasa Are-Nrf 2.

  Preparación de los cultivos de queratinocitos

  Debe utilizarse una línea celular transgénica con una inserción estable del gen marcador de la luciferasa bajo el control del elemento ARE (por ejemplo, la línea celular de KeratinoSens™). Una vez recibidas, las células se propagan (por ejemplo, se someten a 2-4 pases) y se conservan congeladas como una población homogénea. Las células de esta población original pueden propagarse hasta un número máximo de pases (que es de 25 en el caso de KeratinoSens™) y se emplean para los ensayos sistemáticos utilizando el medio adecuado de mantenimiento (en el caso de KeratinoSens™, se trata de DMEM con suero y geneticina).

  Para el ensayo, las células deben tener una confluencia de entre el 80 y el 90 %, y debe velarse por que las células nunca se cultiven hasta su confluencia total. Un día antes del ensayo, se recolectan las células y se distribuyen en placas de 96 pocillos (10 000 células/pocillo en el caso del KeratinoSens^TM). Debe prestarse atención para evitar la sedimentación de las células durante la siembra, a fin de garantizar la distribución de un número homogéneo de células en todos los pocillos. Si no se hace así, este paso podría ocasionar una elevada variabilidad entre pocillos. En cada repetición se utilizan tres réplicas para las mediciones de la actividad de la luciferasa, y una réplica en paralelo para el ensayo de la viabilidad celular.

  Preparación del producto problema y de las sustancias testigo

  El producto problema y las sustancias testigo se preparan el día del ensayo. Para el ensayo de KeratinoSens^TM, se disuelven los productos problema en dimetilsulfóxido (DMSO) a la concentración final deseada (por ejemplo, 200 mM). Las soluciones en DMSO pueden considerarse auto-esterilizantes, por lo que no es necesaria su esterilización por filtración. Los productos problema insolubles en DMSO se disuelven en agua o medio de cultivo estéril, y las soluciones se esterilizan, por ejemplo mediante filtración. En el caso de un producto problema que no tenga peso molecular (PM) definido, se prepara una solución madre a una concentración por defecto (40 mg/ml o 4 % (p/v) en el ensayo de KeratinoSens^TM). En caso de que se utilicen disolventes distintos del DMSO, el agua o el medio de cultivo, debe proporcionarse una justificación científica suficiente.

  A partir de las soluciones madre del producto problema en DMSO, se realizan diluciones seriadas con DMSO para obtener doce concentraciones principales del producto problema (de 0,098 a 200 mM en el ensayo de KeratinoSens^TM). En caso de que el producto problema sea insoluble en DMSO, las diluciones para obtener las concentraciones principales se realizan con agua estéril o medio de cultivo estéril. Independiente del disolvente utilizado, las concentraciones principales se vuelven a diluir a continuación con un factor de dilución de 25 en medio de cultivo que contenga suero, y, por último, se utilizan para el tratamiento con un factor de dilución adicional de 4, de forma que las concentraciones finales de producto problema se encuentren en el intervalo de 0,98 a 2 000 μM en el ensayo de KeratinoSens^TM. Se pueden aplicar otras concentraciones previa justificación (por ejemplo, en caso de citotoxicidad o escasa solubilidad).

  El testigo negativo (disolvente) utilizado en el ensayo de KeratinoSens^TM es DMSO (nº CAS 67-68-5, pureza ≥ 99 %), para el cual se preparan seis pocillos por placa. Se somete a la misma dilución descrita para las concentraciones principales en el punto 22, de modo que la concentración final del testigo negativo (disolvente) sea del 1 %, de la que se sabe que no afecta a la viabilidad de las células y corresponde a la misma concentración de DMSO que se encuentra en el producto problema y en el testigo positivo. En caso de productos problema insolubles en DMSO, cuyas diluciones se han realizado en agua, el nivel de DMSO en todos los pocillos de la solución problema final debe ajustarse al 1 %, como para los demás productos problema y sustancias testigo.

  El testigo positivo utilizado en el caso del ensayo de KeratinoSens^TM es el aldehído cinámico (n.º CAS 14371-10-9, pureza ≥ 98 %), del cual se prepara una serie de cinco concentraciones principales en el intervalo de 0,4 a 6,4 mM en DMSO (a partir de una solución madre de 6,4 mM), que se diluyen como se describe para las concentraciones principales en el punto 22, de forma que la concentración final del testigo positivo se encuentre en el intervalo de 4 a 64 μM. Pueden utilizarse otros testigos positivos adecuados que den preferentemente valores de EC_1,5 en la gama media, si se dispone de datos históricos para obtener criterios comparables de aceptación de las tandas.

  Aplicación del producto problema y de las sustancias testigo

  Para deducir una predicción (positiva o negativa), con cada producto problema y sustancia testigo positivo es necesario hacer un solo experimento, compuesto al menos de dos repeticiones independientes, con tres réplicas en cada una de ellas (es decir, n = 6). En caso de resultados discordantes entre las dos repeticiones independientes, debe realizarse una tercera repetición con tres réplicas (es decir, n = 9). Cada repetición independiente se realiza un día diferente con nueva solución madre de los productos problema y células recolectadas de forma independiente. No obstante, las células pueden proceder del mismo pase.

  Después de la siembra, según se describe en el punto 20, las células se cultivan durante 24 horas en placas de microvaloración de 96 pocillos. A continuación se retira el medio y se sustituye por medio de cultivo fresco (150 μl de medio de cultivo con suero pero sin geneticina en el caso de KeratinoSens^TM) al que se añaden 50 μl de las soluciones de producto problema y de las sustancias testigo diluidas con un factor de 25. Debe dejarse vacío al menos un pocillo por placa (sin células y sin tratamiento) para evaluar los valores de fondo.

  A continuación se incuban las placas tratadas, durante unas 48 horas a 37 ± 1ºC en presencia de un 5 % de CO₂ en el ensayo de KeratinoSens^TM. Deben tomarse precauciones para evitar la evaporación de los productos problema volátiles y la contaminación cruzada entre pocillos por productos problema, por ejemplo cubriendo las placas con una hoja antes de la incubación con los productos problema.

  Mediciones de la actividad de la luciferasa

  Tres elementos son fundamentales para garantizar una lectura adecuada de la luminiscencia:

  • - la elección de un luminómetro sensible,
  • - la utilización de un formato de placa con suficiente altura para evitar la contaminación lumínica cruzada; y
  • - la utilización de un sustrato de la luciferasa con un rendimiento lumínico suficiente para garantizar una sensibilidad suficiente y una baja variabilidad.

  Antes de los ensayos, debe efectuarse un experimento de control, dispuesto tal como se describe en el apéndice 3, para cerciorarse de que se cumplen estos tres puntos.

  Tras el período de exposición de 48 horas con el producto problema y las sustancias testigo en el ensayo de KeratinoSens^TM, las células se lavan con una solución salina amortiguadora de fosfato, y se añade a cada pocillo la solución amortiguadora de lisis correspondiente para las lecturas de luminiscencia durante 20 minutos a temperatura ambiente.

  A continuación se ponen las placas con el lisado celular en el luminómetro para el proceso de lectura, que en el ensayo de KeratinoSens^TM se programa de la forma siguiente: i) se añade el sustrato de la luciferasa a cada pocillo (es decir, 50 μl), ii) se espera 1 segundo, y iii) se integra la actividad de la luciferasa durante 2 segundos. Debe justificarse, en su caso, la utilización de una configuración diferente, por ejemplo en función del modelo de luminómetro utilizado. Además, también puede utilizarse un sustrato brillante, siempre que el experimento de control de la calidad del apéndice 3 se complete con éxito.

  Evaluación de la citotoxicidad

  Para el ensayo de viabilidad celular de KeratinoSens^TM, después del periodo de exposición de 48 horas se sustituye el medio por medio fresco que contiene MTT [bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,5-difeniltetrazolio, azul de tiazolilo; n.º CAS 298-93-1) y las células se incuban durante 4 horas a 37 °C en presencia de 5 % de CO₂. A continuación, se retira el medio con MTT y las células se lisan (p. ej., añadiendo a cada pocillo solución de SDS al 10 %) hasta el día siguiente. Después de agitar, se mide la absorción a 600 nm con un fotómetro.

  DATOS E INFORME

  Evaluación de los datos

  En el ensayo de KeratinoSens^TM se calculan los siguientes parámetros:

  • - el valor máximo del factor multiplicador medio de la inducción de la actividad de la luciferasa (I_máx) observado a cualquier concentración del producto problema y del testigo positivo;
  • - el valor de EC_1,5, que representa la concentración a la cual el factor multiplicador de la inducción de la actividad de la luciferasa supera el umbral de 1,5 (es decir, aumento del 50 % en la actividad de la luciferasa); y
  • - los valores de concentración IC₅₀ e IC₃₀, correspondientes a una reducción de la viabilidad celular del 50 % y del 30 %.
  • - El factor multiplicador de la inducción de la actividad de la luciferasa se calcula mediante la ecuación 1, y el factor multiplicador máximo general de la inducción (I_máx) se calcula como la media aritmética de las distintas repeticiones.

  Ecuación 1:

  

  donde

  L_muestra es la lectura de la luminiscencia del pocillo del producto problema

  L_blanco es la lectura de la luminiscencia del pocillo del blanco, sin células ni tratamiento

  L_disolvente es la lectura de luminiscencia media de los pocillos que contienen células y testigo de disolvente (negativo)

  La EC_1,5 se calcula por interpolación lineal según la ecuación 2, y la EC_1,5 general se calcula como la media geométrica de las distintas repeticiones.

  Ecuación 2:

  

  donde

  C_a es la concentración mínima en μM con factor multiplicador de la inducción > 1,5

  C_b es la concentración máxima en μM con factor multiplicador de la inducción < 1,5

  I_a es el factor multiplicador de la inducción medido a la concentración mínima con factor multiplicador de la inducción > 1,5 (media de tres pocillos replicados)

  I_b es el factor multiplicador de la inducción medido a la concentración máxima con factor multiplicador de la inducción < 1,5 (media de tres pocillos replicados)

  La viabilidad se calcula mediante la ecuación 3:

  Ecuación 3:

  

  donde

  V_muestra es la lectura de la absorbancia con MTT en el pocillo del producto problema

  V_blanco es la lectura de la absorbancia con MTT en el pocillo del blanco, sin células ni tratamiento

  V_disolvente es la lectura de la absorbancia media con MTT en los pocillos que contienen células y testigo de disolvente (negativo)

  Las IC₅₀ e IC₃₀ se calculan por interpolación lineal según la ecuación 4, y las IC₅₀ e IC₃₀ generales se calculan como la media geométrica de las distintas repeticiones.

  Ecuación 4:

  

  donde

  X es el porcentaje de reducción a la concentración que debe calcularse (50 y 30 para IC₅₀ e IC₃₀)

  C_a es la concentración mínima en μM con una reducción > x % en la viabilidad

  C_b es la concentración máxima en μM con una reducción < x % en la viabilidad

  V_a es el % de viabilidad a la concentración mínima con una reducción > x % en la viabilidad

  V_b es el % de viabilidad a la concentración máxima con una reducción < x % en la viabilidad

  Para cada concentración que presente un factor de inducción de la actividad de la luciferasa > 1,5, se calcula la significación estadística (por ejemplo, mediante una prueba t de Student de dos colas), comparando los valores de luminiscencia de las tres muestras replicadas con los valores de luminiscencia de los pocillos de testigo de disolvente (negativo) para determinar si la inducción de la actividad de la luciferasa es estadísticamente significativa (p < 0,05). La concentración mínima con factor de inducción de la actividad de la luciferasa > 1,5 es el valor que determina el valor de EC_1,5. Se comprueba en cada caso si este valor es inferior al valor de IC₃₀, lo que indica que hay menos del 30 % de reducción de la viabilidad celular a la concentración que determina la EC_1,5.

  Se recomienda comprobar los datos visualmente con ayuda de gráficos. Si no se observa una curva dosis-respuesta clara, o si la curva dosis-respuesta obtenida es bifásica (es decir, cruza dos veces el umbral de 1,5), el experimento debe repetirse para comprobar si esto es específico del producto problema o se debe a un artefacto experimental. En caso de que la respuesta bifásica sea reproducible en un experimento independiente, debe indicarse el menor valor de EC_1,5 (la concentración cuando se cruza el umbral de 1,5 por primera vez).

  En los raros casos en que se observa un factor de inducción estadísticamente no significativo por encima de 1,5, seguido de una concentración más elevada con factor de inducción estadísticamente significativo, los resultados de esta repetición se consideran válidos y positivos solo si el factor de inducción estadísticamente significativo por encima de 1,5 se ha obtenido con una concentración no citotóxica.

  Por último, en el caso de productos problema que presenten un factor de inducción igual o superior a 1,5 ya a la concentración de ensayo mínima de 0,98 μM, el valor de EC_1,5 < 0,98 se establece en función de la inspección visual de la curva dosis-respuesta.

  Criterios de aceptación

  Deben cumplirse los siguientes criterios de aceptación cuando se use el ensayo de KeratinoSens^TM. En primer lugar, el factor de inducción de la actividad de la luciferasa obtenido con el testigo positivo, el aldehído cinámico, debe estar de forma estadísticamente significativa por encima del umbral de 1,5 (por ejemplo, utilizando una prueba T) a al menos una de las concentraciones ensayadas (de 4 a 64 μM).

  En segundo lugar, el valor de EC_1,5 debe estar situado en el margen de dos desviaciones típicas respecto a la media histórica de la instalación de ensayo (por ejemplo, entre 7 μM y 30 μM sobre la base del conjunto de datos de la validación) y estos valores deben actualizarse periódicamente. Además, el factor medio de inducción en las tres réplicas con aldehído cinámico a 64 μM debe situarse entre 2 y 8. Si este último criterio no se cumple, deberá comprobarse cuidadosamente la relación dosis-respuesta del aldehído cinámico, y los ensayos podrán aceptarse solo si existe una clara relación dosis-respuesta con un aumento de la inducción de la actividad de la luciferasa al incrementar las concentraciones del testigo positivo.

  Por último, el coeficiente medio de variación de la lectura de la luminiscencia del testigo negativo de DMSO (disolvente) debe ser inferior al 20 % en cada repetición consistente en seis pocillos ensayados por triplicado. Si la variabilidad es superior, los resultados deben desecharse.

  Interpretación de los resultados y modelo de predicción

  Una predicción de KeratinoSens^TM se considera positiva si las siguientes cuatro condiciones se cumplen en su totalidad en 2 repeticiones de 2 o en las mismas 2 repeticiones de 3; de lo contrario, la predicción de KeratinoSens^TM se considera negativa (figura 1):

  • 1. El factor de inducción I_máx es superior (>) a 1,5 y presenta una diferencia estadísticamente significativa respecto al testigo de disolvente (negativo) (determinado mediante una prueba t de Student, desapareada, de dos colas);
  • 2. La viabilidad celular es superior (>) al 70 % a la concentración mínima con factor de inducción de la actividad de la luciferasa por encima de 1,5 (es decir, a la concentración que determina la EC_1,5);
  • 3. El valor de EC_1,5 es inferior (<) a 1 000 μM (o < 200 μg/ml en el caso de los productos problema sin peso molecular definido);
  • 4. Hay una relación dosis-respuesta general visible en cuanto a la inducción de la luciferasa (o una respuesta bifásica mencionada en el punto 33).

  Si en una determinada repetición se cumplen las tres primeras condiciones, pero no puede observarse una clara relación dosis-respuesta para la inducción de la luciferasa, entonces el resultado de dicha repetición debe considerarse no concluyente y podrá ser necesario proceder a efectuar más ensayos (figura 1). Además, un resultado negativo obtenido con concentraciones < 1 000 μM (o < 200 μg/ml en caso de productos problema sin peso molecular definido) también ha de considerarse no concluyente (véase el punto 11).

  Figura 1:

  Modelo de predicción utilizado en el ensayo de KeratinoSens^TM. Las predicciones del ensayo de KeratinoSens^TM deben tenerse en cuenta en el marco de un enfoque IATA y de conformidad con las disposiciones de los puntos 9 y 11.

  

  En algunos raros casos, los productos problema que inducen la actividad de la luciferasa muy cerca de los niveles citotóxicos pueden ser positivos en algunas repeticiones a niveles no citotóxicos (es decir, a la concentración que determina la EC_1,5 por debajo (<) de la IC₃₀), y en otras repeticiones solo a niveles citotóxicos (es decir, a la concentración que determina la EC_1,5 por encima (>) de la IC₃₀). Tales productos problema se volverán a someter a ensayo con un análisis de la relación dosis-respuesta más estrecho utilizando un factor de dilución inferior (por ejemplo, factor de dilución de 1,33 o Ö2 (= 1,41) entre pocillos), para determinar si la inducción se ha producido o no a niveles citotóxicos (9).

  Informe del ensayo

  El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

  • Producto problema
    • - Sustancia con un solo componente
      • - Identificación química, como nombre o nombres IUPAC o CAS, número o números CAS, código SMILES o InChI, fórmula estructural, y/u otros identificadores;
      • - Aspecto físico, hidrosolubilidad, solubilidad en DMSO, peso molecular, y otras propiedades fisicoquímicas pertinentes, en la medida de lo posible;
      • - Pureza, identidad química de las impurezas según convenga y sea factible en la práctica, etc.;
      • - Tratamiento antes del ensayo, en su caso (p. ej., calentamiento, trituración);
      • - Concentración o concentraciones estudiadas;
      • - Condiciones de almacenamiento y estabilidad en la medida de lo posible.
    • - Sustancia de componentes múltiples, sustancia UVCB y mezcla:
      • - Caracterización, en la medida de lo posible, mediante, por ejemplo, la identidad química (véase más arriba), pureza, presencia cuantitativa y propiedades fisicoquímicas pertinentes de los componentes (véase más arriba), en la medida de lo posible;
      • - Aspecto físico, hidrosolubilidad, solubilidad en DMSO, y otras propiedades fisicoquímicas pertinentes, en la medida de lo posible;
      • - Peso molecular o peso molecular aparente en el caso de mezclas/polímeros de composición conocida u otra información pertinente para la realización del estudio;
      • - Tratamiento antes del ensayo, en su caso (p. ej., calentamiento, trituración);
      • - Concentración o concentraciones estudiadas;
      • - Condiciones de almacenamiento y estabilidad en la medida de lo posible.
  • Testigos
    • - Testigo positivo
      • - Identificación química, como nombre o nombres IUPAC o CAS, número o números CAS, código SMILES o InChI, fórmula estructural, y/u otros identificadores;
      • - Aspecto físico, hidrosolubilidad, solubilidad en DMSO, peso molecular, y otras propiedades fisicoquímicas pertinentes, en la medida de lo posible y en los casos aplicables;
      • - Pureza, identidad química de las impurezas según convenga y sea factible en la práctica, etc.;
      • - Tratamiento antes del ensayo, en su caso (p. ej., calentamiento, trituración);
      • - Concentración o concentraciones estudiadas;
      • - Condiciones de almacenamiento y estabilidad en la medida de lo posible;
      • - Referencia a los resultados de los testigos positivos históricos que demuestren unos criterios adecuados de aceptación de las tandas, si procede.
    • - Testigo negativo (vehículo)
      • - Identificación química, como nombre o nombres IUPAC o CAS, número o números CAS, y/u otros identificadores;
      • - Pureza, identidad química de las impurezas según convenga y sea factible en la práctica, etc.;
      • - Aspecto físico, peso molecular, y otras propiedades fisicoquímicas pertinentes en el caso de que se utilicen testigos negativos /vehículos distintos de los especificados en el presente método de ensayo y en la medida de lo posible;
      • - Condiciones de almacenamiento y estabilidad en la medida de lo posible;
      • - Justificación de la elección del disolvente para cada producto problema.
  • Condiciones del método de ensayo
    • - Nombre y dirección del promotor, laboratorio y director del estudio;
    • - Descripción del método de ensayo utilizado;
    • - Línea celular utilizada, sus condiciones de almacenamiento y su origen (por ejemplo, instalación en la que se ha obtenido);
    • - Número de pases y nivel de confluencia de las células utilizadas en el ensayo;
    • - Método de recuento de células utilizado para la siembra antes del ensayo, y medidas adoptadas para garantizar la homogeneidad de la distribución del número de células (véase el punto 20);
    • - Luminómetro utilizado (por ejemplo, modelo), incluidos los ajustes instrumentales, sustrato de luciferasa utilizado, y demostración de las mediciones adecuadas de luminiscencia sobre la base del ensayo de control descrito en el apéndice 3;
    • - Procedimiento utilizado para demostrar la competencia del laboratorio en cuanto a la utilización del método de ensayo (por ejemplo, mediante el ensayo de sustancias de la prueba de la competencia) o para demostrar que el método de ensayo proporciona resultados reproducibles a lo largo del tiempo.
  • Procedimiento de ensayo
    • - Número de repeticiones y réplicas utilizadas;
    • - Concentraciones del producto problema, procedimiento de aplicación y tiempo de exposición utilizado (si es diferente del recomendado)
    • - Descripción de los criterios de evaluación y decisión seguidos;
    • - Descripción de los criterios de aceptación del estudio seguidos;
    • - Descripción de las eventuales modificaciones del procedimiento del ensayo.
  • Resultados
    • - Tabulación de I_max, EC_1,5 y de los valores de la viabilidad (es decir, IC₅₀, IC₃₀) obtenidos con el producto problema y con el testigo positivo en cada repetición, así como los valores medios (I_max: media aritmética; EC_1,5 y valores de la viabilidad: media geométrica) y la desviación típica calculados con los datos obtenidos en las distintas repeticiones y una indicación de la calificación del producto problema según el modelo de predicción;
    • - Coeficiente de variación obtenido con las lecturas de luminiscencia del testigo negativo, en cada experimento;
    • - Gráfico que muestre las curvas dosis-respuesta en cuanto a la inducción de la actividad de la luciferasa y la viabilidad;
    • - Descripción de cualesquiera otras observaciones pertinentes, si procede.
  • Discusión de los resultados
    • - Discusión de los resultados obtenidos con el método de ensayo KeratinoSens^TM;
    • - Consideración de los resultados obtenidos con el método de ensayo en el contexto de un enfoque IATA si se dispone de otra información pertinente.
  • Conclusión

  BIBLIOGRAFÍA

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  • (5) Capítulo B.6 del presente anexo, Sensibilización de la piel.
  • (6) Capítulo B.50 del presente anexo, Sensibilización cutánea: ensayo con ganglios linfáticos locales: DA.
  • (7) Capítulo B.51 del presente anexo: Sensibilización cutánea: ensayo con ganglios linfáticos locales: BrdU-ELISA.
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  Apéndice 1

  DEFINICIONES

  Exactitud : Grado de coincidencia entre los resultados obtenidos con el método de ensayo y los valores de referencia aceptados. Se trata de una medida del comportamiento del método de ensayo y es un aspecto de su «pertinencia«. Este término y el de «concordancia« se suelen usar indistintamente para indicar la proporción de resultados correctos de un método de ensayo (29).

  Ruta de resultados adversos (AOP, Adverse Outcome Pathway) : Secuencia de fenómenos desde la estructura química de un producto o grupo de productos similares diana, pasando por el fenómeno molecular desencadenante, hasta un resultado in vivo de interés (2).

  ARE : Elemento de respuesta antioxidante (antioxidant response element), también denominado EpRE (electrophile response element, elemento de respuesta electrófilo), es un elemento de respuesta constatado en la región anterior del promotor de muchos genes citoprotectores y de fase II. Cuando está activado por Nfr2, sirve de mediador para la inducción transcripcional de estos genes.

  Producto : Sustancia o mezcla.

  Coeficiente de variación : Medida de la variabilidad que se calcula para un grupo de datos replicados dividiendo la desviación típica por la media. Puede multiplicarse por 100 para expresarlo como porcentaje.

  EC_1,5 : Concentración interpolada correspondiente a un factor de inducción de luciferasa igual a 1,5.

  IC₃₀ : Concentración que provoca la reducción de la viabilidad celular en un 30 %.

  IC₅₀ : Concentración que provoca la reducción de la viabilidad celular en un 50 %.

  Peligro : Propiedad inherente de un agente o situación que tiene capacidad para provocar efectos adversos cuando un organismo, sistema o (sub)población se expone a dicho agente.

  Enfoque integrado de pruebas y evaluación (IATA, Integrated Approach to Testing and Assessment) : Enfoque estructurado para la identificación del peligro (potencial), caracterización del peligro (potencia) o evaluación de la seguridad (potencial/potencia y exposición) de un producto o grupo de productos, que integra y pondera de forma estratégica todos los datos pertinentes para fundamentar una decisión reglamentaria relativa a posibles peligros o riesgos o a la necesidad de realizar ensayos más específicos y, por tanto, mínimos.

  I_máx : Factor de inducción máximo de la actividad de la luciferasa frente al testigo de disolvente (negativo) medido a cualquier concentración del producto problema.

  Keap1 : Proteína 1 asociada a ECH y de tipo Kelch (Kelch-like ECH-associated protein 1), es una proteína sensora que puede regular la actividad del Nrf2. En ausencia de inducción, la proteína sensora Keap1 actúa sobre el factor de transcripción Nrf2 para la ubiquitinización y degradación proteolítica en el proteasoma. La modificación covalente de los residuos reactivos de cisteína de Keap1 por pequeñas moléculas puede provocar que el Nrf2 se disocie de Keap1 (8) (10) (11).

  Mezcla : Mezcla o solución compuesta por dos o más sustancias que no reaccionan en ella (1).

  Sustancia con un solo componente : Sustancia, definida por su composición cuantitativa, en la que un solo componente principal representa al menos el 80 % (p/p).

  Sustancia de componentes múltiples : Sustancia, definida por su composición cuantitativa, en la que hay varios componentes principales presentes a una concentración ≥ 10 % (p/p) y < 80 % (p/p). Una sustancia de componentes múltiples es el resultado de un proceso de fabricación. La diferencia entre mezcla y sustancia de componentes múltiples es que una mezcla se obtiene mezclando dos o más sustancias sin reacción química, mientras que una sustancia de componentes múltiples es el resultado de una reacción química.

  Nrf2 : Factor nuclear 2 similar al factor 2 derivado de eritroide, es un factor de transcripción que participa en la ruta de la respuesta antioxidante. Cuando el Nrf2 no está ubiquitinizado, se concentra en el citoplasma y se transloca al núcleo, donde se combina con el ARE en la región anterior del promotor de muchos genes citoprotectores, con lo que se inicia su transcripción (8) (10) (11).

  Testigo positivo : Réplica que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo y que se trata con una sustancia de la que se sabe que induce una respuesta positiva. Para asegurar la posibilidad de evaluar la variabilidad de las respuestas del testigo positivo a lo largo del tiempo, no debe ser excesiva la magnitud de la respuesta positiva.

  Pertinencia : Descripción de la relación del ensayo con el efecto de interés y de si es significativo y útil para un objetivo concreto. Es el grado en que el ensayo mide o predice correctamente el efecto biológico de interés. La pertinencia incorpora la consideración de la exactitud (concordancia) de un método de ensayo (29).

  Fiabilidad : Medida del grado en que un método de ensayo puede aplicarse de forma reproducible a lo largo del tiempo, en un mismo laboratorio y en distintos laboratorios, utilizando el mismo protocolo. Se evalúa calculando la reproducibilidad intra e interlaboratorios y la repetibilidad intralaboratorios (29).

  Reproducibilidad : Coincidencia entre los resultados obtenidos en el ensayo del mismo producto utilizando el mismo protocolo de ensayo (véase «Fiabilidad«) (29).

  Sensibilidad : Proporción de todos los productos activos/positivos que se clasifican correctamente mediante el método de ensayo. Es una medida de la exactitud de un método de ensayo que produce resultados categoriales, y un factor importante en la evaluación de la pertinencia de un método de ensayo (29).

  Testigo del disolvente/vehículo : Réplica que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo, a excepción del producto problema, pero incluido el disolvente que se utiliza. Se emplea para determinar la respuesta de base respecto a las muestras tratadas con el producto problema disuelto en el mismo disolvente.

  Especificidad : Proporción de todos los productos inactivos/negativos que se clasifican correctamente mediante el método de ensayo. Es una medida de la exactitud de un método de ensayo que produce resultados categoriales, y un factor importante en la evaluación de la pertinencia de un método de ensayo (29).

  Sustancia : Elementos químicos y sus compuestos en estado natural u obtenidos mediante cualquier proceso de producción, incluidos los aditivos necesarios para mantener la estabilidad del producto y las eventuales impurezas derivadas del proceso empleado, pero excluidos los disolventes que se puedan separar sin influir en la estabilidad de la sustancia ni cambiar su composición (1).

  Producto problema : El término «producto problema« se utiliza para hacer referencia a lo que se somete a ensayo.

  Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos de las Naciones Unidas (SGA de la ONU) : Sistema que propone la clasificación de productos químicos (sustancias y mezclas) según tipos y niveles normalizados de peligros físicos, sanitarios y ambientales, y que hace referencia a los elementos correspondientes de comunicación, como pictogramas, palabras de advertencia, indicaciones de peligro, consejos de prudencia, y fichas de datos de seguridad, a efectos de proporcionar información sobre sus efectos adversos con el fin de proteger a la población (incluidos empresarios, trabajadores, transportistas, consumidores y personal de protección civil) y al medio ambiente (1).

  UVCB : Sustancias de composición desconocida o variable, productos complejos de reacción o materiales biológicos.

  Método de ensayo válido : Método de ensayo del que se considera que tiene suficiente pertinencia y fiabilidad con un fin específico y que se basa en principios sólidos desde el punto de vista científico. Un método de ensayo nunca es válido en un sentido absoluto, sino únicamente en relación con un fin determinado (29).

  Apéndice 2

  SUSTANCIAS UTILIZADAS PARA DEMOSTRAR LA COMPETENCIA

  Sensibilización cutánea in vitro: Método de ensayo de la luciferasa ARE-Nrf2

  Antes de proceder al uso sistemático de este método de ensayo, los laboratorios deben demostrar su competencia técnica mediante la correcta obtención de la predicción del KeratinoSens™ prevista respecto a las diez sustancias recomendadas al efecto en el cuadro 1, y la obtención de valores de EC_1,5 e IC₅₀ que estén dentro de la gama de referencia respectiva con al menos ocho de las diez sustancias utilizadas para demostrar la competencia. Estas sustancias de la prueba de la competencia se han seleccionado a fin de representar la gama de respuestas correspondientes a los peligros de sensibilización cutánea. Otros criterios de selección son la disponibilidad comercial, la disponibilidad de referencias in vivo de alta calidad, y la disponibilidad de datos in vitro de alta calidad obtenidos con el ensayo de KeratinoSens^TM.

  Cuadro 1

  Sustancias recomendadas para demostrar la competencia técnica con el ensayo de KeratinoSens^TM

  Sustancias de la prueba de la competencia	CAS RN	Estado físico	Predicción in vivo   (34)	Predicción de KeratinoSensTM   (35)	Gama de referencia de EC1,5 (μM ) (36)	Gama de referencia de IC50 (μM ) (36)
  Isopropanol	67-63-0	Líquido	No sensibilizante	Negativa	> 1 000	> 1 000
  Ácido salicílico	69-72-7	Sólido	No sensibilizante	Negativa	> 1 000	> 1 000
  Ácido láctico	50-21-5	Líquido	No sensibilizante	Negativa	> 1 000	> 1 000
  Glicerol	56-81-5	Líquido	No sensibilizante	Negativa	> 1 000	> 1 000
  Alcohol cinámico	104-54-1	Sólido	Sensibilizante (escaso)	Positiva	25 — 175	> 1 000
  Dimetacrilato de etilenglicol	97-90-5	Líquido	Sensibilizante (escaso)	Positiva	5 — 125	≤ 500
  2-Mercaptobenzotiazol	149-30-4	Sólido	Sensibilizante (moderado)	Positiva	25 — 250	≤ 500
  Metildibromo-glutaronitrilo	35691-65-7	Sólido	Sensibilizante (intenso)	Positiva	> 20	20 — 100
  Sulfato de 4-metilaminofenol	55-55-0	Sólido	Sensibilizante (intenso)	Positiva	> 12,5	20 — 200
  2,4-Dinitro-clorobenceno	97-00-7	Sólido	Sensibilizante (extremo)	Positiva	> 12,5	5 — 20

  Apéndice 3

  CONTROL DE CALIDAD DE LAS MEDICIONES DE LUMINISCENCIA

  Experimento de base para garantizar unas mediciones óptimas de la luminiscencia en el ensayo de KeratinoSens^TM

  Los tres parámetros siguientes son esenciales para garantizar la obtención de resultados fiables con el luminómetro:

  • - tener sensibilidad suficiente para dar un fondo estable en los pocillos de testigo;
  • - no presentar gradiente a lo largo de la placa debido a largos períodos de lectura; y
  • - no tener contaminación luminosa en pocillos adyacentes a los pocillos muy activos.

  Antes del ensayo, se recomienda velar por que las mediciones de luminiscencia sean adecuadas, comprobando una placa testigo dispuesta como se describe más abajo (análisis por triplicado).

  Disposición de la placa del primer experimento de formación

  	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
  A	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO
  B	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO
  C	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO
  D	EGDMA 0,98	EGDMA 1,95	EGDMA 3,9	EGDMA 7,8	EGDMA 15,6	EGDMA 31,25	EGDMA 62,5	EGDMA 125	EGDMA 250	EGDMA 500	EGDMA 1 000	EGDMA 2 000
  E	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO
  F	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO
  G	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO
  H	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	DMSO	CA 4	CA 8	CA 16	CA 32	CA 64	Blanco

  EGDMA= dimetacrilato de etilenglicol (nº CAS: 97-90-5), sustancia fuertemente inductora

  CA= aldehído cinámico, referencia positiva (nº CAS: 104-55-2)

  El análisis de control de la calidad debe demostrar:

  • - una clara relación dosis-respuesta en la fila D, con factor de inducción por encima del fondo I_máx > 20 (en la mayoría de los casos, se alcanzan valores de I_máx entre 100 y 300);
  • - sin relación dosis-respuesta en las filas C y E (ningún factor de inducción superior a 1,5 (idealmente, no superior a 1,3) debido a la posible contaminación lumínica especialmente cerca de los pocillos fuertemente activos de la fila del EGDMA;
  • - sin diferencia estadísticamente significativa entre las filas A, B, C, E, F y G (es decir, sin gradiente en la placa); y
  • - la variabilidad en cualquiera de las filas A, B, C, E, F y G y en los pocillos con DMSO de la fila H debe ser inferior al 20 % (es decir, fondo estable).

  B.61
  
  Método de ensayo de pérdida de fluoresceína para detectar agentes corrosivos e irritantes intensos para los ojos

  INTRODUCCIÓN

  El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo (TG) de la OCDE 460 (2012). El método de ensayo de pérdida de fluoresceína (FL, fluorescein leakage) es un procedimiento in vitro que puede utilizarse, en determinadas circunstancias y con limitaciones específicas, para clasificar los productos (sustancias y mezclas) como agentes corrosivos e irritantes intensos para los ojos, según se definen en el Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos de las Naciones Unidas (SGA de la ONU) (categoría 1), en el Reglamento (CE) n.º 1272/2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas (CLP) (31) (categoría 1), y en la Agencia de Protección del Medio Ambiente de los Estados Unidos (EPA) (categoría I) (1) (2). A efectos de este método de ensayo, se entiende por «agentes irritantes intensos para los ojos» los productos que provocan lesiones tisulares en el ojo como consecuencia de la administración del producto, las cuales no son reversibles en el plazo de 21 días, o una grave reducción física de la vista, mientras que «agentes corrosivos para los ojos» son los productos que causan lesiones tisulares irreversibles en el ojo. Estos productos se clasifican en la categoría 1 del SGA de la ONU, en la categoría 1 del CLP de la UE, o en la categoría I de la EPA.

  Si bien el método de ensayo FL no se considera válido para sustituir completamente al ensayo in vivo con ojo de conejo, sí se recomienda utilizarlo como parte de una estrategia de ensayos escalonados para la clasificación y el etiquetado reglamentarios. Así pues, se recomienda el método FL como un primer paso dentro de un enfoque descendente para identificar agentes corrosivos o irritantes intensos para los ojos, específicamente para ciertos tipos de productos (es decir, sustancias hidrosolubles y mezclas) (3) (4).

  Actualmente se reconoce en general que, en un futuro próximo, ningún ensayo de irritación ocular in vitro podrá sustituir por sí solo al ensayo ocular in vivo [método de ensayo B.5 (5)] para hacer predicciones en toda la gama de irritación causada por las distintas clases de productos. Sin embargo, unas combinaciones estratégicas de varios métodos de ensayo alternativos dentro de una estrategia de ensayos (escalonados) sí podrán sustituir al ensayo ocular in vivo (4). El enfoque descendente (4) está diseñado para utilizarse cuando, sobre la base de la información existente, se espera que un producto tenga un alto potencial de irritación.

  Sobre la base del modelo de predicción detallado en el punto 35, el método FL, dentro de un ámbito de aplicación limitado, puede identificar los productos como agentes corrosivos o irritantes intensos para los ojos (categoría 1 del SGA de la ONU; categoría 1 del CLP de la UE; categoría I de la EPA de los EE.UU.), sin necesidad de realizar más ensayos. Se acepta que lo mismo ocurre con las mezclas, aunque estas no se hayan utilizado en la validación. Por lo tanto, el método de ensayo FL puede utilizarse para determinar la capacidad de irritación/corrosión ocular de los productos, siguiendo la estrategia secuencial de ensayos del método B.5 (5). No obstante, un producto del que el método de ensayo FL no prediga que es corrosivo o irritante intenso para los ojos tendría que someterse a ensayo con uno o varios métodos de ensayo adicionales (in vitro o in vivo) capaces de identificar con exactitud: i) los productos que den resultados falsos negativos in vitro como agentes corrosivos/ irritantes intensos para los ojos con el método FL (categoría 1 del SGA de la ONU; categoría 1 del CLP de la UE; categoría I de la EPA de los EE.UU.); ii) los productos que no estén clasificados por corrosión/irritación ocular (sin categoría del SGA de la ONU; sin categoría del CLP de la UE; categoría IV de la EPA de los EE.UU.); y iii) los productos que sean agentes irritantes oculares leves o moderados (categorías 2A y 2B del SGA de la ONU; categoría 2 del CLP de la UE; categorías II y III de la EPA de los EE.UU.).

  El objetivo del presente método de ensayo es describir los procedimientos utilizados para evaluar la posible capacidad de corrosión o de irritación intensa para los ojos de un producto problema, medida por su capacidad de provocar lesiones a una monocapa epitelial confluente impermeable. La integridad de la permeabilidad transepitelial es una importante función de los epitelios como los que se encuentran en la conjuntiva y en la córnea. La permeabilidad transepitelial está controlada por diversas uniones intercelulares herméticas. Se ha observado que el aumento de la permeabilidad del epitelio de la córnea in vivo está en correlación con el nivel de inflamación y de lesiones superficiales que se observan cuando se irritan los ojos.

  En el método de ensayo FL, los efectos tóxicos tras un breve tiempo de exposición al producto problema se miden por el aumento de la permeabilidad a la fluoresceína sódica a través de la monocapa epitelial de células renales de perro de Madin-Darby (MDCK) cultivadas sobre elementos insertados permeables. La cantidad de fluoresceína que se pierde es proporcional a las lesiones provocadas por el producto a las uniones intercelulares herméticas, a las uniones desmosómicas y a las membranas celulares, y se puede utilizar para estimar el potencial de la toxicidad ocular de un producto problema. El apéndice 1 incluye un diagrama de células MDCK cultivadas sobre la membrana de un elemento insertado para el método de ensayo FL.

  En el apéndice 2 se dan las definiciones pertinentes.

  CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES

  El presente método de ensayo se basa en el Protocolo n.º 71 de INVITTOX (6), que ha sido evaluado en un estudio de validación internacional por el Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (CEVMA), en colaboración con el Comité de Coordinación Interagencias sobre la validación de métodos alternativos (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) de los Estados Unidos, y con el Centro Japonés para la Validación de Métodos Alternativos (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM).

  El método de ensayo FL no se recomienda para la identificación de productos que deben clasificarse como irritantes leves o moderados o de productos que no deben clasificarse como irritantes oculares (sustancias y mezclas) (es decir, sin categoría o categoría 2A/2B del SGA; sin categoría o categoría 2 del CLP de la UE; categoría II/III/IV de la EPA de los EE.UU.), según el estudio de validación (3) (7).

  El método de ensayo es aplicable solo a los productos (sustancias y mezclas) hidrosolubles. La capacidad de irritación ocular intensa de los productos hidrosolubles o de aquellos cuyo efecto tóxico no se ve afectado por la dilución es predicha generalmente de forma exacta con el método de ensayo FL (7). Para clasificar un producto como hidrosoluble, en condiciones experimentales, debe ser soluble en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) estéril, con calcio (a la concentración de 1,0-1,8 mM), sin rojo de fenol, a una concentración ≥ 250 mg/ml (una dosis por encima del umbral de 100 mg/ml). Sin embargo, si el producto problema es soluble a una concentración inferior a 100 mg/ml, pero a esa concentración ya induce la pérdida de fluoresceína del 20 % (lo que significa FL₂₀ < 100 mg/ml), puede clasificarse en la Cat. 1 del SGA o en la Cat. I de la EPA.

  Las limitaciones de este método de ensayo que se han detectado excluyen de su ámbito de aplicación a los ácidos y bases fuertes, los fijadores celulares y los productos muy volátiles. Estos productos tienen mecanismos que no se miden con el método de ensayo FL como, por ejemplo, importante coagulación, saponificación o reacciones químicas específicas. Otras limitaciones de este método que se han detectado se basan en los resultados relativos a la capacidad de predicción con productos problema viscosos y de color (7). Parece que estos dos tipos de productos son difíciles de eliminar de la monocapa tras el breve período de exposición y que la capacidad de predicción del método de ensayo podría mejorarse con un mayor número de fases de lavado. Los productos sólidos suspendidos en líquido tienden a separarse por precipitación y puede ser difícil determinar la concentración final en contacto con las células. Si se excluyen de la base de datos los productos de estas clases químicas y físicas, mejora sustancialmente la exactitud del ensayo FL en los sistemas de clasificación de la UE, la EPA y el SGA (7)

  Teniendo en cuenta la finalidad del presente método de ensayo (es decir, identificar solamente agentes corrosivos/ irritantes intensos para los ojos), las tasas de falsos negativos (véase el punto 13) no son fundamentales, ya que tales productos se someterían a otros ensayos in vitro validados adecuadamente o con conejos, en función de las exigencias normativas, utilizando una estrategia de ensayo secuencial con un enfoque de ponderación de los datos (5) (véanse también los puntos 3 y 4).

  Otras limitaciones detectadas del método de ensayo FL se refieren a las tasas de falsos positivos y de falsos negativos. Cuando se utilizó como fase inicial dentro de un planteamiento descendente para determinar sustancias y mezclas hidrosolubles corrosivas/ irritantes intensas (categoría 1 del SGA de la ONU; categoría 1 del CLP de la UE; categoría I de la EPA de los EE.UU.), la tasa de falsos positivos del método de ensayo FL osciló entre el 7 % (7/103; SGA de la ONU y CLP de la UE) y el 9 % (9/99; EPA de los EE.UU.) y la tasa de falsos negativos osciló entre el 54 % (15/28; EPA de los EE.UU.) y el 56 % (27/48; SGA de la ONU y CLP de la UE) en comparación con los resultados in vivo. No se definen aquí grupos químicos que presenten falsos resultados positivos o negativos con el método de ensayo FL.

  Hay ciertas limitaciones técnicas que son específicas del cultivo de células MDCK. Las uniones intercelulares herméticas que impiden el paso del colorante fluoresceína sódica a través de la monocapa se van alterando cada vez más al aumentar el número de pases celulares. La formación incompleta de estas uniones intercelulares herméticas redunda en un aumento de la pérdida de fluoresceína en los testigos sin tratar. Por lo tanto, es importante definir la pérdida máxima permisible en los testigos sin tratar (véase el punto 38: 0 % de pérdida). Como con todos los ensayos in vitro, existe la posibilidad de que las células se transformen a lo largo del tiempo, por lo que es fundamental que se indique la banda del número de pases en relación con los ensayos.

  El actual ámbito de aplicación podría ampliarse en algunos casos, pero solo después de analizar un conjunto ampliado de datos de productos problema estudiados, obtenido preferentemente mediante ensayos (3). El presente método de ensayo se actualizará en consecuencia a la luz de la nueva información y los datos que se vayan considerando.

  Cuando algún laboratorio establezca inicialmente este ensayo, debe utilizar los productos de la prueba de la competencia que se indican en el apéndice 3. Los laboratorios pueden utilizar estos productos para demostrar su competencia técnica en la realización del método de ensayo FL antes de presentar, con fines de clasificación normativa de peligros, los datos obtenidos con este ensayo.

  PRINCIPIO DEL ENSAYO

  El método FL es un ensayo in vitro que se basa en la citotoxicidad y en la función celular, realizado con una monocapa confluente de células de epitelio tubular MDCK CB997, cultivadas sobre elementos insertados semipermeables, que sirven de modelo del estado no proliferativo del epitelio corneal in vivo. La línea celular MDCK está bien establecida y forma uniones intercelulares herméticas y uniones desmosómicas similares a las que se encuentran en el lado apical de los epitelios conjuntival y corneal. Las uniones intercelulares herméticas y las uniones desmosómicas in vivo evitan que los solutos y las materias extrañas penetren en el epitelio corneal. La pérdida de la impermeabilidad transepitelial, debida a la alteración de las uniones intercelulares herméticas y de las uniones desmosómicas, constituye uno de los primeros fenómenos de la irritación ocular causada por los productos.

  El producto problema se aplica a la capa confluente de células cultivadas en el lado apical del elemento insertado. Habitualmente se utiliza una breve exposición de un minuto para reflejar la velocidad de eliminación normal en la exposición humana. Una ventaja del breve período de exposición es que las sustancias y mezclas a base de agua pueden someterse a ensayo en estado puro, si pueden retirarse fácilmente después del período de exposición. Esto permite una comparación más directa de los resultados con los efectos de los productos en los seres humanos. El producto problema se retira a continuación y el colorante fluoresceína sódica, que no es tóxico y es muy fluorescente, se añade al lado apical de la monocapa durante 30 minutos. La lesión causada por el producto problema a las uniones intercelulares herméticas se determina por la cantidad de fluoresceína que se pierde a través de la capa celular dentro de un plazo de tiempo determinado.

  La cantidad de colorante fluoresceína sódica que pasa a través de la monocapa y de la membrana del elemento insertado a un volumen determinado de solución presente en el pocillo (al que llega la fluoresceína sódica perdida) se determina midiendo por espectrofluorometría la concentración de fluoresceína en el pocillo. La cantidad de fluoresceína filtrada (FL) se calcula con referencia a las lecturas de intensidad de la fluorescencia (FI) de dos testigos: un testigo en blanco, y un testigo de pérdida máxima. Se indica, en relación con estos testigos, para cada una de la concentraciones fijadas del producto problema el porcentaje de pérdida y, por lo tanto, la cuantía de la lesión provocada a las uniones intercelulares herméticas. A continuación se calcula la FL₂₀ (es decir, la concentración que provoca un 20 % de pérdida de fluoresceína teniendo en cuenta los valores registrados con la monocapa confluente sin tratar y con los elementos insertados sin células). El valor de FL₂₀ (mg/ml) se utiliza en el modelo de predicción para identificar los agentes corrosivos e irritantes intensos para los ojos (véase el punto 35).

  La recuperación es una parte importante del perfil de toxicidad de un producto problema que se evalúa también con el ensayo de irritación ocular in vivo. Los análisis preliminares indican que los datos de recuperación (hasta 72 h después de la exposición al producto) podrían incrementar la capacidad predictiva del Protocolo n.º 71 de INVITTOX, pero es necesario proseguir la evaluación, que mejoraría con más datos, adquiridos preferentemente mediante nuevos ensayos(6). El presente método de ensayo se actualizará en consecuencia a la luz de la nueva información y los datos que se vayan considerando.

  PROCEDIMIENTO

  Preparación de la monocapa celular

  La monocapa de células MDCK CB997 se elabora utilizando células subconfluentes cultivadas en matraces de cultivo celular con medio DMEM/Nutrient Mix F12 (1x concentrado con L-glutamina, HEPES 15 mM, calcio (a una concentración de 1,0-1,8 mM) y un 10 % de FCS/FBS inactivado por calor). Es muy importante que todos los medios/soluciones utilizados a lo largo del ensayo FL contengan calcio a una concentración entre 1,8 mM (200 mg/l) y 1,0 mM (111 mg/l) para asegurar la formación e integridad de las uniones intercelulares herméticas. Debe controlarse la banda del número de pases celulares para que la formación de uniones intercelulares herméticas sea homogénea y reproducible. Las células debe estar preferentemente en la banda de 3-30 pases desde la descongelación, ya que las células en esta banda de pases tienen funciones similares, lo que contribuye a la reproducibilidad de los resultados del ensayo.

  Antes de aplicar el método de ensayo FL, las células se desprenden del matraz por tripsinización y se centrifugan, y un número adecuado de células se siembra en los elementos insertados colocados en placas de 24 pocillos (véase el apéndice 1). Para sembrar las células deben usarse elementos insertados de 12 mm de diámetro, con membrana de mezcla de ésteres de celulosa, un espesor de 80 a 150 μm y un tamaño de poro de 0,45 μm. En el estudio de validación se utilizaron elementos insertados de 12 mm Millicell-HA. Las propiedades del elemento insertado y el tipo de membrana son importantes, puesto que pueden afectar al crecimiento celular y a la unión de los productos. Algunos tipos de productos pueden unirse a la membrana Millicell-HA, lo que puede afectar a la interpretación de los resultados. Si se utilizan otras membranas, para demostrar su equivalencia deben utilizarse productos de la prueba de la competencia (véase el apéndice 3).

  La unión del producto a la membrana del elemento insertado es más común en caso de productos catiónicos, como el cloruro de benzalconio, que son atraídos por la membrana cargada (7). La unión del producto a la membrana del elemento insertado puede aumentar el período de exposición al producto, dando lugar a una sobreestimación del potencial tóxico del producto, pero también puede reducir físicamente la pérdida de fluoresceína a través del elemento insertado por unión del colorante al producto catiónico unido a la membrana del elemento insertado, dando lugar a una subestimación del potencial tóxico del producto. Esto puede verificarse fácilmente exponiendo la membrana sola a la concentración máxima del producto problema y añadiendo a continuación el colorante fluoresceína sódica a la concentración normal durante el tiempo establecido (testigo sin células). Si se produce unión del colorante de fluoresceína, la membrana del elemento insertado se verá amarilla después de que el producto problema se haya lavado. Por lo tanto, es esencial conocer las propiedades de unión del producto problema para poder interpretar los efectos de este sobre las células.

  La siembra de las células sobre los elementos insertados debe producir una monocapa confluente en el momento de la exposición al producto. Deben añadirse 1,6 x 10⁵ células por elemento insertado (400 μl de una suspensión celular con una densidad de 4 x 10⁵ células/ml). En estas condiciones, se obtiene una monocapa confluente por lo general al cabo de 96 horas de cultivo. Los elementos insertados deben examinarse visualmente antes de la siembra, con objeto de garantizar que los eventuales daños obervados en el control visual descrito en el punto 30 se deben a la manipulación.

  Los cultivos de células MDCK deben mantenerse en incubadores con atmósfera humidificada, con un 5 % ± 1 % de CO₂ y a 37 °C ± 1 °C. Las células deben estar exentas de contaminación por bacterias, virus, micoplasmas y hongos.

  Aplicación de los productos problema y testigo

  Para cada tanda experimental debe prepararse una nueva solución madre de producto problema, la cual se ha de utilizar en el plazo de 30 minutos a partir de su preparación. Los productos problema deben prepararse en HBSS sin rojo de fenol, con calcio (a una concentración de 1,0-1,8 mM), para evitar la unión a las proteínas plasmáticas. Antes del ensayo debe evaluarse la solubilidad del producto a 250 mg/ml en HBSS. Si a esta concentración el producto forma una suspensión o emulsión estable (es decir, mantiene la uniformidad y no sedimenta ni se separa en más de una fase) durante 30 minutos, la HBSS puede utilizarse como disolvente. Sin embargo, si se observa que el producto es insoluble en HBSS a esta concentración, debe considerarse el uso de otros métodos de ensayo en lugar del método FL. El uso de aceite de vaselina fluido como disolvente, en los casos en que se vea que el producto es insoluble en HBSS, debe considerarse con cautela, ya que no se dispone de suficientes datos para llegar a una conclusión sobre el comportamiento del ensayo FL en tales condiciones.

  Todos los productos problema se preparan en HBSS sin rojo de fenol, con calcio (a una concentración de 1,0-1,8 mM), a partir de la solución madre, diluida a cinco concentraciones fijas, expresadas en peso por volumen: 1, 25, 100, 250 mg/ml y una forma sin diluir o una solución saturada. Al someter a ensayo un producto sólido, debe incluirse una concentración muy alta, de 750 mg/ml. Esta concentración de producto puede tener que aplicarse a las células utilizando una pipeta de desplazamiento positivo. Si se observa que la toxicidad está entre 25 y 100 mg/ml, se someten a ensayo en dos tandas las siguientes concentraciones adicionales: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml. De estas concentraciones debe derivarse el valor de FL₂₀ siempre que se cumplan los criterios de aceptación.

  Los productos problema se aplican a las monocapas de células confluentes después de retirar el medio de cultivo celular y de lavar dos veces con HBSS sin rojo de fenol, con calcio (a una concentración de 1,0-1,8 mM), estéril y caliente (37 °C). Previamente, los filtros se habrán comprobado visualmente para detectar los eventuales daños preexistentes que pudieran atribuirse erróneamente a posibles incompatibilidades con los productos problema. Deben utilizarse al menos tres réplicas para cada concentración del producto problema y para los testigos en cada tanda. Después de 1 minuto de exposición a temperatura ambiente, el producto problema debe retirarse cuidadosamente por aspiración, la monocapa debe lavarse dos veces con HBSS sin rojo de fenol, con calcio (a una concentración de 1,0-1,8 mM), estéril y caliente (37 °C), y la pérdida de fluoresceína debe medirse de forma inmediata.

  En cada tanda deben utilizarse testigos negativos (TN) y positivos (TP) en paralelo para demostrar que la integridad de la monocapa (TN) y la sensibilidad de las células (TP) se encuentran dentro de una gama de aceptación definida históricamente. El producto sugerido como TP es Brij 35 (n.º CAS 9002-92-0) a 100 mg/ml. Esta concentración debe dar aproximadamente un 30 % de pérdida de fluoresceína (intervalo aceptable: 20-40 % de pérdida de fluoresceína, sinónimo de lesión de la capa celular). El producto sugerido como TN es HBSS sin rojo de fenol, con calcio (a una concentración de 1,0-1,8 mM) (testigo en blanco, sin tratar). En cada tanda debe incluirse también un testigo de pérdida máxima para poder calcular los valores de FL₂₀. La pérdida máxima se determina utilizando un elemento insertado testigo sin células.

  Determinación de la permeabilidad a la fluoresceína

  Inmediatamente después de la eliminación de los productos problema y testigo, se añaden a los elementos insertados (p. ej., Milicell-HA) 400 μl de solución de fluoresceína sódica de 0,1 mg/ml [0,01 % (p/v) en HBSS sin rojo de fenol, con calcio (a una concentración de 1,0-1,8 mM)]. Los cultivos se mantienen durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación con fluoresceína, los elementos insertados se retiran cuidadosamente de cada pocillo. Se efectúa una comprobación visual de cada filtro y se registran los eventuales daños que se hayan producido durante la manipulación.

  La cantidad de fluoresceína que haya pasado a través de la monocapa y del elemento insertado se cuantifica en la solución que haya permanecido en los pocillos después de la retirada de los elementos insertados. Las mediciones se realizan en un espectrofluorímetro a las longitudes de onda de excitación y de emisión de 485 nm y 530 nm, respectivamente. La sensibilidad del espectrofluorímetro debe fijarse de manera que exista la mayor diferencia numérica entre la pérdida máxima de fluoresceína (elemento insertado sin células) y la pérdida mínima de fluoresceína (elemento insertado con monocapa confluente, tratado con el TN). Habida cuenta de las diferencias en el espectrofluorímetro utilizado, se sugiere utilizar una sensibilidad que dé una intensidad de fluorescencia > 4 000 en el testigo de pérdida máxima de fluoresceína. El valor correspondiente a la pérdida máxima de fluoresceína no debe ser superior a 9 999. La intensidad de la fluorescencia correspondiente a la pérdida máxima debe estar dentro del intervalo lineal del espectrofluorímetro utilizado.

  Interpretación de los resultados y modelo de predicción

  La cantidad de la pérdida de fluoresceína es proporcional a las lesiones inducidas por el producto en las uniones intercelulares herméticas. El porcentaje de pérdida de fluoresceína a cada concentración estudiada de producto problema se calcula a partir de la valores de pérdida de fluoresceína obtenidos con el producto problema haciendo referencia a los valores de pérdida de fluoresceína del TN (lectura de la monocapa confluente de células tratadas con el TN) y un testigo de pérdida máxima (lectura correspondiente a la cantidad de fluoresceína perdida a través de un elemento insertado sin células).

  La intensidad media de la fluorescencia correspondiente a la pérdida máxima = x

  La intensidad media de la fluorescencia correspondiente a la pérdida 0 % (TN) = y

  La intensidad media correspondiente a la pérdida del 100 % se obtiene restando, de la intensidad media correspondiente a la pérdida máxima, la intensidad media correspondiente a la pérdida del 0 %,

  es decir, x - y = z

  El porcentaje de pérdida a cada dosis fijada se obtiene restando el valor correspondiente a la pérdida del 0 % de la intensidad de la fluorescencia media de las lecturas de las tres réplicas (m) y dividiendo este valor por el correspondiente a la pérdida del 100 %, es decir, % FL = [(m - y) / z] × 100 %, donde:

  M = intensidad de fluorescencia media de las mediciones de las tres réplicas de la concentración correspondiente

  % FL = porcentaje de fluoresceína que se pierde a través de la capa celular

  Debe aplicarse la siguiente ecuación para el cálculo de la concentración del producto que provoca una FL del 20 %:

  FL_D = [(A - B) / (C - B)] × (M_C - M_B) + M_B

  donde:

  D = % de inhibición

  A = % lesión (pérdida de fluoresceína del 20 %)

  B = % de pérdida de fluoresceína < A

  C = % de pérdida de fluoresceína > A

  M_C = concentración (mg/ml) de C

  M_B = concentración (mg/ml) de B

  El valor de corte de FL₂₀ para la predicción de un producto como agente corrosivo o irritante intenso para los ojos se indica a continuación:

  FL20 (mg/ml)	Clas. y eti. del SGA de la ONU	Clas. y eti. del CLP de la UE	Clas. y eti. de la EPA de los EE.UU.
  ≤ 100	Categoría 1	Categoría 1	Categoría I
  Clas. y eti.: clasificación y etiquetado

  El método de ensayo FL solo se recomienda para la identificación de agentes corrosivos e irritantes intensos para los ojos hidrosolubles (categoría 1 del SGA de la ONU, categoría 1 del CLP de la UE, categoría I de la EPA de los EE.UU.) (véanse los puntos 1 y 10).

  Para identificar un producto (sustancia o mezcla) hidrosoluble (3) (6) (7) como «inductor de lesiones oculares graves» (categoría 1 del SGA de la ONU o del CLP de la UE) o como «corrosivo o irritante intenso para los ojos» (categoría I de la EPA de los EE.UU.), el producto problema debe tener un valor de FL₂₀ ≤ 100 mg/ml.

  Aceptación de los resultados

  El valor medio correspondiente a la pérdida máxima de fluoresceína (x) debe ser superior a 4 000 (véase el punto 31), el valor medio correspondiente a la pérdida del 0 % (y) debe ser inferior o igual a 300, y el valor medio correspondiente a la pérdida del 100 % (z) debe estar comprendido entre 3 700 y 6 000.

  Se considera que un ensayo es aceptable si el testigo positivo provoca entre un 20 % y un 40 % de lesiones a la capa celular (medida como pérdida porcentual de fluoresceína).

  DATOS E INFORME

  Datos

  De cada tanda deben indicarse en forma tabular los datos obtenidos con cada uno de los pocillos replicados (por ejemplo, valores de la intensidad de la fluorescencia y datos calculados de porcentaje de FL para cada producto problema, incluida la clasificación). Además, deben comunicarse las medias ± desviación típica de las mediciones de las distintas réplicas de cada tanda.

  Informe del ensayo

  El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

  • Productos problema y testigo
    • - Denominación o denominaciones químicas, como la denominación estructural utilizada por el Chemical Abstracts Service (CAS), seguida por otras denominaciones, si se conocen;
    • - Número CAS del producto, si se conoce;
    • - Pureza y composición de la sustancia o mezcla (en porcentajes en peso), en la medida en que se disponga de esta información;
    • - Propiedades físico-químicas pertinentes para la realización del estudio (por ejemplo, estado físico, volatilidad, pH, estabilidad, hidrosolubilidad, clase química);
    • - Tratamiento de los productos problema y testigo antes del ensayo, en su caso (por ejemplo, calentamiento, trituración);
    • - Condiciones de almacenamiento.
  • Justificación del método de ensayo y del protocolo utilizados
    • - Deben incluirse consideraciones en cuanto al ámbito de aplicación y las limitaciones del método de ensayo.
  • Condiciones del ensayo
    • - Descripción del sistema celular utilizado, incluidos el certificado de autenticidad y la situación de la línea celular en cuanto a los micoplasmas;
    • - Particularidades del procedimiento de ensayo empleado;
    • - Concentración o concentraciones utilizadas del producto problema;
    • - Duración de la exposición al producto problema;
    • - Duración de la incubación con fluoresceína;
    • - Descripción de las eventuales modificaciones del procedimiento del ensayo;
    • - Descripción de los criterios de evaluación seguidos;
    • - Referencia a datos anteriores del modelo (por ejemplo, testigos negativos y positivos, productos de referencia, si procede);
    • - Información sobre la competencia técnica demostrada por el laboratorio.
  • Resultados
    • - Cuadro de datos de los distintos productos problema y testigo correspondientes a cada tanda y a las mediciones de cada réplica (incluidos los resultados individuales, las medias y las desviaciones típicas);
    • - Clasificación o clasificaciones derivadas con referencia al modelo de predicción y/o a los criterios de decisión utilizados;
    • - Descripción de otros efectos observados.
  • Discusión de los resultados
    • - Deben incluirse consideraciones sobre los resultados no concluyentes (punto 35: FL₂₀ > 100 mg/ml) y ensayos adicionales.
  • Conclusiones

  BIBLIOGRAFÍA

  • (1) Naciones Unidas (2009), Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos (SGA), tercera edición revisada, Nueva York y Ginebra. Publicaciones de las Naciones Unidas. ISBN: 978-92-1-117006-1. Disponible en: [http://www.unece.org/es/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_s.html]
  • (2) U.S. EPA (1996), Label Review Manual: 2nd Edition, EPA737-B-96-001, Washington DC: U.S. Environmental Protection Agency.
  • (3) CEVMA de la Comisión Europea (2009), Statement on the scientific validity of cytotoxicity/cell-function based in vitro assays for eye irritation testing.
  • (4) Scott, L. et al. (2010), A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches, Toxicol. In Vitro 24, 1-9
  • (5) Capítulo B.5 del presente anexo, Irritación/corrosión ocular aguda.
  • (6) CEVMA de la Comisión Europea (1999), INVITOX Protocol 71: Fluorescein Leakage Test, Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM). Available at: [http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu
  • (7) CEVMA de la Comisión Europea (2008), Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing.
  • (8) OCDE (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34. OECD, Paris.

  Apéndice 1 DIAGRAMA DE CÉLULAS MDCK CULTIVADAS SOBRE LA MEMBRANA DE UN ELEMENTO INSERTADO PARA EL MÉTODO DE ENSAYO FL

  Se cultiva una capa confluente de células MDCK en la membrana semipermeable de un elemento insertado. Los elementos insertados se ponen en los pocillos de placas de 24 pocillos.

  

  La figura procede de: Wilkinson, P.J. (2006), Development of an in vitro model to investigate repeat ocular exposure, Ph.D. Thesis, University of Nottingham, UK.

  Apéndice 2

  DEFINICIONES

  Exactitud : Grado de coincidencia entre los resultados obtenidos con el método de ensayo y los valores de referencia aceptados. Se trata de una medida del comportamiento del método de ensayo y es un aspecto de su» pertinencia«. Este término y el de» concordancia «se suelen usar indistintamente para indicar la proporción de resultados correctos de un método de ensayo.

  Producto : Sustancia o mezcla.

  Categoría I de la EPA : Productos que producen corrosión (destrucción irreversible del tejido ocular) o afectación o irritación de la córnea, persistente durante más de 21 días (2).

  CLP de la UE : (Reglamento (CE) n.º 1272/2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas): Aplica en la Unión Europea (UE) el sistema SGA de la ONU para la clasificación de los productos (sustancias y mezclas).

  Tasa de falsos negativos : Proporción de todos los productos positivos identificados erróneamente como negativos por un método de ensayo. Es uno de los indicadores del comportamiento del método de ensayo.

  Tasa de falsos positivos : Proporción de todos los productos negativos identificados erróneamente como positivos por un método de ensayo. Es uno de los indicadores del comportamiento del método de ensayo.

  FL₂₀ : Puede estimarse mediante la determinación de la concentración a la que el producto problema hace que el 20 % de la fluoresceína pase a través de la capa celular.

  Pérdida de fluoresceína : Cantidad de fluoresceína que pasa a través de la capa celular, medida por espectrofluorometría.

  SGA [(Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos de las Naciones Unidas (ONU)] : Sistema que propone la clasificación de productos químicos (sustancias y mezclas) según tipos y niveles normalizados de peligros físicos, sanitarios y ambientales, y que hace referencia a los elementos correspondientes de comunicación, como pictogramas, palabras de advertencia, indicaciones de peligro, consejos de prudencia, y fichas de datos de seguridad, a efectos de proporcionar información sobre sus efectos adversos con el fin de proteger a la población (incluidos empresarios, trabajadores, transportistas, consumidores y personal de protección civil) y al medio ambiente.

  Categoría 1 del SGA : Producción de una lesión tisular en el ojo o una degradación física severa de la vista, como consecuencia de la aplicación de un producto problema en la superficie anterior del ojo, y que no es totalmente reversible en los 21 días siguientes a la aplicación.

  Peligro : Propiedad inherente de un agente o situación que tiene capacidad para provocar efectos adversos cuando un organismo, sistema o (sub)población se expone a dicho agente.

  Mezcla : Término utilizado en el contexto de la SGA de la ONU como mezcla o solución compuesta por dos o más sustancias que no reaccionan en ella.

  Testigo negativo : Muestra replicada no tratada que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo. Esta muestra se somete al mismo proceso que las muestras tratadas con producto problema y otras muestras testigo para determinar si el disolvente interactúa con el sistema de ensayo.

  Sin clasificar : Productos que no están clasificados como irritantes oculares en las categorías 1, 2A o 2B del SGA de la ONU; categorías 1 o 2 del CLP de la UE; o categorías I, II o III de la EPA de los EE.UU.

  Agentes corrosivos para los ojos : a) Productos que provocan una lesión tisular irreversible en los ojos; b) Productos clasificados como irritantes para los ojos en la categoría 1 del SGA de la ONU; categoría 1 del CLP de la UE; o categoría I de la EPA de los EE.UU.

  Agentes irritantes para los ojos : a) Productos que producen un cambio reversible en el ojo como consecuencia de su aplicación a la superficie anterior de este; b) Productos clasificados como irritantes para los ojos en las categorías 2A o 2B del SGA de la ONU; categoría 2 del CLP de la UE; o categorías II o III de la EPA de los EE.UU.

  Agentes irritantes intensos para los ojos : a) Productos que provocan lesiones tisulares en los ojos como consecuencia de su aplicación en la superficie anterior del ojo, y que no son reversibles en los 21 días siguientes a la aplicación, o una grave reducción física de la vista; b) Productos clasificados como irritantes para los ojos en la categoría 1 del SGA de la ONU; categoría 1 del CLP de la UE; o categoría I de la EPA de los EE.UU.

  Testigo positivo : Muestra replicada que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo y que se trata con un producto del que se sabe que induce una respuesta positiva. Para asegurar la posibilidad de evaluar la variabilidad de las respuestas del testigo positivo a lo largo del tiempo, no debe ser extrema la magnitud de la respuesta positiva.

  Productos de la prueba de la competencia : Subconjunto de la lista de productos de referencia que puede ser utilizado por un laboratorio sin experiencia para demostrar su competencia con el método de ensayo de referencia validado.

  Pertinencia : Descripción de la relación del ensayo con el efecto de interés y de si es significativo y útil para un objetivo concreto. Es el grado en que el ensayo mide o predice correctamente el efecto biológico de interés. La pertinencia incorpora la consideración de la exactitud (concordancia) de un método de ensayo (8).

  Fiabilidad : Medida del grado en que un método de ensayo puede aplicarse de forma reproducible a lo largo del tiempo, en un mismo laboratorio y en distintos laboratorios, utilizando el mismo protocolo. Se evalúa calculando la reproducibilidad intra e interlaboratorios y la repetibilidad intralaboratorios.

  Ensayo de sustitución : Ensayo que se diseña para sustituir un ensayo utilizado de forma sistemática y aceptado para la identificación de peligros o la evaluación de riesgos, y del que se ha determinado que proporciona una protección equivalente o mejorada de la salud humana o del medio ambiente, según corresponda, respecto al ensayo aceptado, en relación con todas las situaciones de ensayo y todos los productos posibles.

  Sensibilidad : Proporción de todos los productos activos/positivos que se clasifican correctamente mediante el ensayo. Es una medida de la exactitud de un método de ensayo que produce resultados categoriales, y un factor importante en la evaluación de la pertinencia de un método de ensayo (8).

  Lesiones oculares graves : Producción de una lesión tisular en el ojo o una degradación física severa de la vista, como consecuencia de la aplicación de un producto problema en la superficie anterior del ojo, y que no es totalmente reversible en los 21 días siguientes a la aplicación.

  Testigo del disolvente/vehículo : Muestra no tratada que contiene todos los componentes de un sistema de ensayo, incluido el disolvente o vehículo, y que se somete al mismo proceso que las muestras tratadas con el producto problema y otras muestras testigo a fin de determinar la respuesta de base correspondiente a las muestras tratadas con el producto problema disuelto en el mismo disolvente o vehículo. Cuando se somete a ensayo con un testigo negativo en paralelo, esta muestra pone de manifiesto también si el disolvente o vehículo interactúa con el sistema de ensayo.

  Especificidad : Proporción de todos los productos inactivos/negativos que se clasifican correctamente mediante el ensayo. Es una medida de la exactitud de un método de ensayo que produce resultados categoriales, y un factor importante en la evaluación de la pertinencia de un método de ensayo.

  Sustancia : En el contexto del SGA de la ONU tiene el sentido de elementos químicos y sus compuestos en estado natural o en el estado obtenido por algún proceso de producción, incluidos los eventuales aditivos necesarios para conservar su estabilidad y las impurezas resultantes del proceso utilizado, con exclusión de cualquier disolvente que pueda separarse sin afectar a la estabilidad de la sustancia ni cambiar su composición.

  Producto problema : Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

  Estrategia de ensayos escalonados : Estrategia de ensayo por fases, en la que se revisa toda la información existente sobre un producto problema, siguiendo un orden especificado, en un proceso de ponderación de las pruebas en cada escalón, a fin de determinar si se dispone de información suficiente para tomar una decisión sobre la clasificación de un peligro, antes de pasar al escalón siguiente. Si puede establecerse la capacidad de irritación de un producto problema con la información disponible, no hace falta efectuar más ensayos. Si no puede establecerse la capacidad de irritación de un producto problema con la información disponible, se aplica un procedimiento secuencial de ensayos con animales por fases hasta que pueda efectuarse una clasificación inequívoca.

  Método de ensayo validado : Método de ensayo sobre el cual se han completado estudios de validación para determinar su pertinencia (incluida su exactitud) y su fiabilidad con un fin específico. Es importante señalar que un método de ensayo validado podría no tener un comportamiento suficiente en términos de exactitud y fiabilidad como para considerarse aceptable a efectos del fin propuesto (8).

  Ponderación de las pruebas : Proceso de consideración de los aspectos favorables y desfavorables de los distintos elementos de información a efectos de alcanzar y confirmar una conclusión en cuanto al peligro potencial de un producto.

  Apéndice 3

  PRODUCTOS UTILIZADOS PARA DEMOSTRAR LA COMPETENCIA CON EL MÉTODO DE ENSAYO FL

  Antes de proceder al uso sistemático de este método de ensayo, los laboratorios deben demostrar su competencia técnica, identificando correctamente la clasificación de los ocho productos recomendados del cuadro 1 en cuanto a su corrosividad ocular. Estos productos se seleccionaron para representar la gama de respuestas en cuanto a la irritación/corrosión local de los ojos, sobre la base de los resultados del ensayo in vivo con ojo de conejo [TG 405, método B.5 (5)] (es decir, categorías 1, 2A, 2B, o sin clasificar según el SGA de la ONU). Sin embargo, considerando la utilidad validada del ensayo FL (es decir, identificar solamente agentes corrosivos/ irritantes intensos para los ojos), solo hay dos resultados del ensayo a efectos de clasificación (agente corrosivo/ irritante intenso o agente no corrosivo / no irritante intenso) para demostrar la competencia con el método. Otros criterios de selección fueron el que los productos estuvieran disponibles en el mercado, que tuvieran datos de referencia in vivo de alta calidad y también datos de alta calidad obtenidos con el método de ensayo FL. Por esta razón, los productos de la prueba de competencia se seleccionaron a partir del documento» Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing « (8), utilizado para la validación retrospectiva del método de ensayo FL.

  Cuadro 1:

  Productos recomendados para demostrar la competencia técnica con el método FL

  Producto	CAS NR	Clase química (37)	Estado físico	Clasificación in vivo   (38)	Clasificación in vitro   (39)
  Cloruro de benzalconio (5 %)	8001-54-5	Compuesto onio	Líquido	Categoría 1	Corrosivo/ irritante intenso
  Clorhidrato de prometazina	58-33-3	Amina/amidina, heterociclo, compuesto orgánico de azufre	Sólido	Categoría 1	Corrosivo/ irritante intenso
  Hidróxido de sodio (10 %)	1310-73-2	Álcali	Líquido	Categoría 1	Corrosivo/ irritante intenso
  Laurilsulfato de sodio (15 %)	151-21-3	Ácido carboxílico (sal)	Líquido	Categoría 1	Corrosivo/ irritante intenso
  4-Carboxi-benzaldehído	619-66-9	Ácido carboxílico, aldehído	Sólido	Categoría 2(A)	No corrosivo / no irritante intenso
  Nitrato de amonio	6484-52-2	Sal inorgánica	Sólido	Categoría 2(A)	No corrosivo / no irritante intenso
  2-Metil-acetoacetato de etilo	609-14-3	Cetona, éster	Líquido	Categoría 2(B)	No corrosivo / no irritante intenso
  Glicerol	56-81-5	Alcohol	Líquido	Sin categoría	No corrosivo / no irritante intenso
  Abreviaturas: CAS NR = número de registro del «Chemical Abstracts Service».

  B.62
  
  Ensayo del cometa en condiciones alcalinas con mamíferos in vivo

  INTRODUCCIÓN

  El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo (TG) de la OCDE 489 (2016). El ensayo del cometa en condiciones alcalinas (electroforesis en gel de células aisladas) (en lo sucesivo, denominado simplemente el ensayo del cometa) se utiliza para la detección de roturas de cadenas de ADN en células o núcleos aislados de múltiples tejidos de animales (por lo general, roedores), que se han visto expuestos a materiales potencialmente genotóxicos. El ensayo del cometa ha sido revisado por distintos grupos de expertos, que han publicado sus recomendaciones (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10). El presente método forma parte de una serie de métodos de ensayo sobre toxicología genética. Se ha elaborado un documento de la OCDE que aporta información sucinta sobre los ensayos de toxicología genética y una síntesis de los recientes cambios aportados a dichas directrices de ensayo (11).

  La finalidad del ensayo del cometa es identificar los productos que causan lesiones del ADN. En condiciones alcalinas (pH > 13), el ensayo del cometa puede detectar roturas de cadenas sencillas y dobles que son resultado, por ejemplo, de interacciones directas con secuencias de ADN lábiles en condiciones alcalinas, o como consecuencia de roturas fugaces de cadenas de ADN resultantes de la reparación del ADN por excisión. Estas roturas de cadenas pueden repararse, con lo que no tendrán efecto persistente, pueden ser letales para las células, o pueden fijarse en una mutación que provoque un cambio viable permanente. También pueden dar lugar a lesiones cromosómicas asociadas con numerosas enfermedades humanas, como el cáncer.

  En 2006-2012 se llevó a cabo un estudio de validación oficial del ensayo del cometa con roedores in vivo, coordinado por el Centro Japonés para la Validación de Métodos Alternativos (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM), en colaboración con el Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (CEVMA), el Comité de Coordinación Interagencias sobre la Validación de Métodos Alternativos (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) y el Centro Interagencias del NTP para la Evaluación de Métodos Toxicológicos Alternativos (NTP Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, NICEATM) (12). Este método de ensayo incluye el uso recomendado y las limitaciones del ensayo del cometa, y se basa en el protocolo final (12) utilizado en el estudio de validación, y en datos adicionales pertinentes tanto publicados como no publicados (propiedad de los laboratorios).

  Las definiciones de los términos clave figuran en el apéndice 1. Cabe señalar que pueden utilizarse para este ensayo muchos soportes diferentes (portaobjetos para microscopio, manchas en gel, placas de 96 pocillos, etc.). Por razones prácticas, se emplea en el resto de este documento el término «portaobjetos», pero abarca todos los demás soportes.

  CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES

  El ensayo del cometa es un método para medir las roturas de las cadenas de ADN en células eucarióticas. Con detergente y una elevada concentración de sales, se lisan células o núcleos aislados incorporados en gel de agarosa en un portaobjetos. Esta fase de lisis celular digiere las membranas nucleares y celulares y permite la liberación de bucles helicoidales de ADN, denominados generalmente nucleoides y fragmentos de ADN. La electroforesis a pH elevado resulta en estructuras parecidas a los cometas, que, mediante las adecuadas tinciones fluorescentes, pueden observarse mediante microscopia de fluorescencia; los fragmentos de ADN migran desde la «cabeza» a la «cola» en función de su tamaño, y la intensidad de la cola del cometa respecto a la intensidad total (cabeza y cola) refleja la proporción de la rotura del ADN (13) (14) (15).

  El ensayo del cometa en condiciones alcalinas in vivo está especialmente indicado para evaluar el peligro genotóxico porque las respuestas del ensayo dependen del ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción) in vivo, y también de los procesos de reparación del ADN. Estos pueden variar según la especie, el tejido y el tipo de lesiones del ADN.

  Para cumplir los requisitos de bienestar animal, en particular la reducción del uso de animales (principio de las tres eres: reemplazar, reducir y refinar), es posible también integrar este ensayo con otros estudios toxicológicos, como los de toxicidad por administración continuada (10) (16) (17), o combinar su criterio de valoración con otros criterios de genotoxicidad, como el del ensayo de micronúcleos en eritrocitos de mamíferos in vivo (18) (19) (20). El ensayo del cometa se realiza en la mayoría de los casos con roedores, aunque se ha aplicado a otras especies de mamíferos y de animales no mamíferos. El uso de especies distintas de los roedores debe justificarse desde el punto de vista científico y ético en cada caso, y se recomienda vivamente que el ensayo del cometa se realice con especies distintas de los roedores solo como parte de otro estudio de toxicidad y no como ensayo independiente.

  La vía de exposición y el tejido o tejidos objeto de estudio deben elegirse en función de todos los datos disponibles/existentes sobre los productos problema, tales como la vía prevista o posible de exposición humana, el metabolismo y distribución; la posibilidad de efectos en el punto de contacto, las alertas estructurales, otros datos de toxicidad y genotoxicidad, y el objeto del estudio. Por lo tanto, en su caso, el potencial genotóxico de los productos problema podrá analizarse en el tejido o tejidos diana de los efectos carcinogénicos y/u otros efectos tóxicos. El ensayo también se considera útil para ahondar en el estudio de la genotoxicidad detectada por un sistema in vitro. Es adecuado realizar un ensayo del cometa in vivo en un tejido de interés cuando se pueda esperar razonablemente que este tejido estará convenientemente expuesto.

  El ensayo se ha validado más ampliamente en tejidos somáticos de ratas machos en estudios colaborativos como el estudio del JaCVAM (12) y en Rothfuss et al., 2010 (10). En el estudio de validación internacional del JaCVAM se utilizaron el hígado y el estómago: el hígado, porque es el órgano más activo en el metabolismo de los productos y también con frecuencia un órgano diana de la carcinogenicidad; el estómago, porque normalmente es el primer punto de contacto con los productos tras la exposición oral, aunque también deben considerarse tejidos del punto de contacto otras zonas del tubo gastrointestinal como el duodeno y el yeyuno, las cuales podrían considerarse más pertinentes para la exposición humana que el estómago glandular de los roedores. Debe velarse por que estos tejidos no se expongan a concentraciones excesivamente elevadas del producto problema (21). La técnica es aplicable, en principio, a cualquier tejido del que puedan obtenerse suspensiones de núcleos o células aisladas analizables. Ciertos datos propiedad de varios laboratorios demuestran el éxito de su aplicación a muchos tejidos diferentes, y existen muchas publicaciones que muestran la aplicabilidad de la técnica a órganos o tejidos distintos de, por ejemplo, hígado y estómago, como el yeyuno (22), el riñón (23) (24), la piel (25) (26), o la vejiga urinaria (27) (28), los pulmones y las células del lavado broncoalveolar (pertinentes para estudios de productos inhalados) (29) (30), y también se han realizado ensayos en múltiples órganos (31) (32).

  Si bien puede haber interés por determinar los efectos genotóxicos en células germinales, debe señalarse que el ensayo del cometa normal en condiciones alcalinas, tal como se describe en el presente método de ensayo, no se considera adecuado para medir las roturas de las cadenas de ADN en las células germinales maduras. Dado que en un estudio bibliográfico sobre la utilización del ensayo del cometa sobre la genotoxicidad en células germinales se señalaron unos niveles de fondo elevados y variables de las lesiones del ADN (33), se considera necesario aportar modificaciones a los protocolos y mejorar la normalización y los estudios de validación antes de que pueda incluirse en el método de ensayo el ensayo del cometa con células germinales (por ejemplo, esperma). Por otra parte, la pauta de exposición recomendada descrita en el presente método de ensayo no es la óptima y puede ser necesario aplicar otros tiempos más largos de exposición o de muestreo para un análisis significativo de las roturas de las cadenas de ADN en el esperma maduro. En la bibliografía se han descrito efectos genotóxicos, medidos por el ensayo del cometa en células testiculares en diferentes etapas de la diferenciación (34) (35). No obstante, cabe señalar que las gónadas contienen una mezcla de células somáticas y germinales. Por ello, unos resultados positivos en las gónadas completas (testículos) no reflejan necesariamente las lesiones causada en las células germinales; sin embargo, indican que el producto o productos problema o sus metabolitos han alcanzado las gónadas.

  El entrecruzamiento no puede detectarse de manera fiable en las condiciones experimentales normales del ensayo del cometa. En determinadas condiciones experimentales modificadas podrían detectarse los enlaces cruzados ADN-ADN y ADN-proteína, y otras modificaciones de las bases, como su oxidación (23) (36) (37) (38) (39). Pero sería necesario seguir trabajando para caracterizar adecuadamente las necesarias modificaciones del protocolo. Así pues, la detección de los agentes de entrecruzamiento no es el objetivo principal del ensayo que se describe aquí. El ensayo no es adecuado, ni siquiera con modificaciones, para detectar anéugenos.

  Debido al estado actual de los conocimientos, el ensayo del cometa in vivo tiene asociadas varias limitaciones adicionales (véase el apéndice 3). Se espera que el método de ensayo se revise en el futuro y, en caso necesario, se modifique a la luz de la experiencia adquirida.

  Antes de la utilización del método de ensayo con una mezcla para obtener datos con fines reglamentarios, debe considerarse si podría proporcionar resultados adecuados a tal fin y, en caso afirmativo, por qué. Tales consideraciones no son necesarias si la reglamentación impone el ensayo de la mezcla.

  PRINCIPIO DEL MÉTODO

  Se exponen los animales al producto problema por una vía adecuada. Una descripción detallada de la administración y del muestreo figura en los puntos 36-40. En el momento o momentos de muestreo seleccionados, se extraen los tejidos de interés y se preparan suspensiones de células/núcleos aislados (puede realizarse perfusión in situ cuando se considere útil, por ejemplo en el hígado), que se incorporan a agar blando para inmovilizarlas en portaobjetos. Las células/núcleos se tratan con solución amortiguadora de lisis para eliminar las membranas celulares y/o nucleares, y se exponen a bases fuertes, por ejemplo a pH ≥ 13, a fin de permitir que se desenrolle el ADN y se liberen los bucles y fragmentos de ADN relajado. El ADN nuclear presente en el agar se somete entonces a electroforesis. Las moléculas de ADN no fragmentado normal permanecen en la posición en la que se encontraba el ADN nuclear en el agar, al tiempo que los eventuales bucles de ADN fragmentado y ADN relajado migran hacia el ánodo. Tras la electroforesis, el ADN se visualiza utilizando una tinción fluorescente apropiada. Las preparaciones deben analizarse utilizando un microscopio y sistemas de análisis de imágenes totalmente automatizados o semiautomatizados. La proporción de ADN que ha migrado durante la electroforesis y la distancia de migración reflejan la cantidad y el tamaño de los fragmentos de ADN. Hay varios criterios de valoración del ensayo del cometa. Para evaluar las lesiones del ADN se ha recomendado el ADN contenido en la cola (porcentaje de ADN de la cola o porcentaje de intensidad de la cola) (12) (40) (41) (42). Tras el análisis de un número suficiente de núcleos, los datos se analizan con métodos adecuados para evaluar los resultados del ensayo.

  Debe tenerse en cuenta que se ha investigado la modificación de varios aspectos de la metodología, con inclusión de la preparación de las muestras, las condiciones de la electroforesis, los parámetros del análisis visual (por ejemplo, intensidad de la tinción, intensidad de la luz de la bombilla del microscopio, y utilización de filtros de microscopio y ajustes de la cámara) y las condiciones ambientales (p. ej., iluminación de fondo), que pueden afectar a la migración del ADN (43) (44) (45) (46).

  VERIFICACIÓN DE LA COMPETENCIA DEL LABORATORIO

  Cada laboratorio debe establecer su competencia experimental con el ensayo del cometa demostrando su capacidad para obtener suspensiones de células o núcleos aislados de calidad suficiente con cada tejido diana de cada una de las especies utilizadas. La calidad de las preparaciones se evaluará en primer lugar observando si el porcentaje de ADN de la cola de animales tratados con un vehículo está en un intervalo bajo y reproducible. Los datos actuales sugieren que la media del grupo del porcentaje de ADN de la cola (sobre la base de la media de las medianas - véanse en el punto 57 detalles de estos términos) en hígado de rata no debe superar preferentemente el 6 %, lo que sería compatible con los valores del estudio de validación del JaCVAM (12) y con otros datos publicados y protegidos. No hay suficientes datos por el momento para hacer recomendaciones sobre intervalos óptimos o aceptables para otros tejidos. Esto no excluye la utilización de otros tejidos, cuando esté justificado. El informe del ensayo debe proporcionar un análisis adecuado del comportamiento del ensayo del cometa con estos tejidos en relación con la bibliografía publicada o con datos protegidos. En primer lugar, es deseable que un intervalo bajo de porcentaje de ADN de cola en los testigos permita un intervalo analítico suficiente para detectar un efecto positivo. En segundo lugar, cada laboratorio debe ser capaz de reproducir las respuestas previstas ante mutágenos directos y promutágenos con distintos modos de acción, tal como se sugiere en el cuadro 1 (punto 29).

  Pueden seleccionarse sustancias positivas, por ejemplo a partir del estudio de validación del JaCVAM (12) o de otros datos publicados (véase el punto 9), cuando sea pertinente, con justificación, y que demuestren respuestas positivas claras en los tejidos de interés. También debe demostrarse la capacidad de detectar efectos débiles de mutágenos conocidos, como el EMS a dosis bajas, por ejemplo estableciendo relaciones dosis-respuesta con dosis apropiadas en cuanto a su número y al intervalo entre ellas. Los esfuerzos iniciales deben centrarse en establecer la competencia con los tejidos más utilizados como, por ejemplo, el hígado de roedores, para poder efectuar comparaciones con los datos existentes y los resultados previstos (12). Al mismo tiempo podrían recogerse datos de otros tejidos como, por ejemplo, estómago/duodeno/yeyuno, sangre, etc. El laboratorio debe demostrar su competencia con cada tejido de cada especie que tenga intención de estudiar, y debe demostrar que se puede obtener en ese tejido una respuesta positiva aceptable con un mutágeno conocido (por ejemplo, EMS).

  Deben recogerse datos de testigos negativos o del vehículo con el fin de demostrar la reproducibilidad de las respuestas de datos negativos, y de garantizar que los aspectos técnicos del ensayo se controlan adecuadamente o de sugerir la necesidad de volver a establecer los intervalos de los testigos históricos (véase el punto 22).

  Conviene señalar que, si bien pueden recogerse en la autopsia y someterse al ensayo del cometa muchos tejidos, el laboratorio tiene que ser competente en la recolección de múltiples tejidos de un solo animal, garantizando así que no se pierde ninguna de las posibles lesiones del ADN y que no se pone en peligro el análisis del cometa. El plazo transcurrido entre la eutanasia y la extracción de los tejidos para su transformación puede ser crítica (véase el punto 44).

  Debe considerarse el bienestar de los animales al adquirir la competencia con este ensayo, por lo que pueden utilizarse tejidos de animales utilizados en otros ensayos cuando se esté adquiriendo competencia con los diversos aspectos del ensayo. Por otra parte, podrá no ser necesario realizar un estudio completo durante las fases de establecimiento de un nuevo método de ensayo en un laboratorio y podrán utilizarse menos animales o menos concentraciones de ensayo cuando se estén adquiriendo las capacidades necesarias.

  Datos sobre testigos históricos

  En el transcurso de las investigaciones de competencia, el laboratorio debe crear una base de datos históricos para establecer los intervalos de los testigos positivos y negativos correspondientes y las distribuciones relativas a los tejidos y especies pertinentes. En la bibliografía pueden encontrarse recomendaciones sobre cómo conseguir y utilizar los datos históricos (es decir, criterios de inclusión y exclusión de datos en los datos históricos y criterios de aceptabilidad para un determinado experimento) (47). Con otros tejidos y otras especies, así como con otros vehículos y vías de administración, pueden obtenerse valores diferentes de porcentaje de ADN de la cola en el testigo negativo. Por lo tanto, es importante establecer los intervalos de los testigos negativos para cada uno de los tejidos y especies. Los laboratorios deben utilizar métodos de control de calidad, como gráficos de control (por ejemplo, gráficos C o gráficos de medias (48)), con el fin de determinar la variabilidad de sus datos y de demostrar que la metodología está «controlada» en su laboratorio. Es posible que para la detección de los efectos débiles también resulte necesario optimizar la selección de las sustancias adecuadas para servir de testigo positivo, los intervalos de dosis y las condiciones experimentales (por ejemplo, las condiciones de la electroforesis) (véase el punto 17).

  Cualquier cambio en el protocolo experimental debe considerarse en función de su coherencia con las bases de datos de testigos históricos existentes del laboratorio. Cualquier incoherencia importante debería dar lugar a la creación de una nueva base de datos de testigos históricos.

  DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

  Preparación

  Selección de la especie animal

  Se utilizan normalmente cepas comunes de laboratorio de roedores adultos jóvenes y sanos (6-10 semanas de edad al inicio del tratamiento, aunque también se pueden aceptar animales ligeramente de más edad). La elección de la especie de roedores debe basarse en: i) las especies utilizadas en otros estudios de toxicidad (para poder relacionar los datos y permitir la integración de los estudios), ii) las especies que hayan formado tumores en un estudio de carcinogenicidad (al investigar el mecanismo de la carcinogénesis), o iii) las especies con el metabolismo más pertinente para los seres humanos, si se conoce. En este ensayo se utilizan habitualmente ratas. No obstante, pueden utilizarse otras especies si se justifica desde el punto de vista científico y ético.

  Condiciones de alojamiento y alimentación de los animales

  Con roedores, la temperatura en el animalario experimental debe ser idealmente de 22 °C (± 3 °C). Lo ideal es que la humedad relativa sea del 50-60 %, con un mínimo del 30 % y un máximo preferentemente del 70 %, salvo durante la limpieza del local. La iluminación debe ser artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se pueden utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. La elección de la dieta puede verse influida por la necesidad de garantizar una mezcla conveniente del producto problema si se administra por esta vía. Los roedores deben alojarse en grupos pequeños (en general, no más de cinco animales juntos) del mismo sexo si no se espera conducta agresiva. Los animales podrán alojarse por separado solo si está justificado científicamente. Debe utilizarse siempre que sea posible un suelo continuo, ya que los suelos de malla pueden provocar lesiones graves (49). Debe proporcionarse enriquecimiento ambiental adecuado.

  Preparación de los animales

  Los animales se reparten al azar entre los lotes tratados y los testigo. Se identifica a los animales de forma unívoca y se acostumbran a las condiciones del laboratorio durante al menos cinco días antes del inicio del tratamiento. Debe utilizarse el método menos invasivo para la identificación unívoca de los animales. Entre los métodos adecuados figuran el anillamiento, el marcado, la implantación de un microchip y la identificación biométrica. El grapado a las orejas o los dedos no está justificados científicamente en estos ensayos. Las jaulas deben disponerse de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. La variación del peso de los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder del ± 20 %.

  Preparación de las dosis

  Los productos problema sólidos deben disolverse o suspenderse en vehículos adecuados, o mezclarse con la dieta o con el agua de bebida, antes de su administración a los animales. Los productos problema líquidos pueden administrarse directamente o diluirse antes de la administración. En lo que respecta a la exposición por inhalación, los productos problema pueden administrarse en forma de gas, de vapor o de aerosol sólido o líquido, dependiendo de sus propiedades fisicoquímicas (50) (51).

  Deben utilizarse preparaciones recientes del producto problema, salvo que se cuente con datos de estabilidad que avalen la posibilidad de su conservación y definan las condiciones adecuadas de esta.

  Condiciones del ensayo

  Vehículo

  El vehículo no debe producir efectos tóxicos a los volúmenes de dosis empleados, y no debe haber ninguna sospecha de que reaccione químicamente con los productos problema. Si se emplean vehículos poco conocidos, su inclusión debe estar avalada por información de referencia que indique su compatibilidad en cuanto a los animales de ensayo, la vía de administración y el criterio de valoración. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente o vehículo acuoso. Cabe señalar que algunos de los vehículos (sobre todo los vehículos viscosos) pueden provocar inflamación y aumento de los niveles de base de las roturas de las cadenas de ADN en el punto de contacto, en particular en caso de administración múltiple.

  Testigos

  Testigos positivos

  En este momento se considera en principio que debe incluirse en cada ensayo un grupo formado por al menos tres animales analizables de un mismo sexo, o de cada sexo si se utilizan ambos (véase el punto 32), tratados con una sustancia testigo positivo. En el futuro podrá ser posible demostrar que se tiene la competencia adecuada y reducir la necesidad de testigos positivos. Si se utilizan múltiples momentos de muestreo (por ejemplo, con un protocolo de una única administración) solo es necesario incluir testigos positivos en uno de los tiempos de muestreo, pero debe garantizarse un diseño equilibrado (véase el punto 48). No es preciso administrar sustancias testigo positivo en paralelo por la misma vía que el producto problema, aunque es importante utilizar la misma vía cuando se miden los efectos en el punto de contacto. Debe demostrarse que las sustancias testigo positivo inducen la rotura de las cadenas de ADN en todos los tejidos de interés para el producto problema, y resulta probable que el EMS sea el testigo positivo de elección, dado que provoca la rotura de las cadenas de ADN en todos los tejidos que se han estudiado. Las dosis de las sustancias testigo positivo deben seleccionarse para generar efectos moderados que sirvan para evaluar críticamente el comportamiento y la sensibilidad del ensayo, y podrían basarse en las curvas de dosis-respuesta establecidas por el laboratorio durante la demostración de la competencia. El porcentaje de ADN de la cola de animales testigo positivo en paralelo debe ser coherente con el intervalo preestablecido en el laboratorio para cada tejido y tiempo de muestreo de la especie correspondiente (véase el punto 16). En el cuadro 1 se incluyen ejemplos de sustancias testigo positivo y algunos de sus tejidos diana (en roedores). Se pueden seleccionar sustancias distintas de las que figuran en el cuadro 1, cuando esté justificado científicamente.

  Cuadro 1:

  Ejemplos de sustancias testigo positivo y algunos de sus tejidos diana

  Sustancias y CAS RN
  Metanosulfonato de etilo (CAS RN 62-50-0) en cualquier tejido
  Etil-nitrosourea (CAS RN 759-73-9) en hígado y estómago, duodeno o yeyuno
  Metanosulfonato de metilo (CAS RN 66-27-3) en hígado, estómago, duodeno o yeyuno, pulmón y células del lavado broncoalveolar (BAL), riñón, vejiga urinaria, pulmón, testículo y médula ósea o sangre
  N-Metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (CAS RN 70-25-7) en estómago, duodeno o yeyuno
  1,2-Dimetilhidrazina 2HCl (CAS RN 306-37-6) en hígado e intestino
  N-Metil-N-nitrosourea (CAS RN 684-93-5) en hígado, médula ósea, sangre, riñón, estómago, yeyuno y cerebro.

  Testigos negativos

  Debe incluirse en cada ensayo, respecto a cada tejido y momento de muestreo, un grupo de animales testigo negativo, tratados solo con el vehículo, pero por lo demás sometidos al mismo proceso que los grupos tratados con el producto problema. El porcentaje de ADN de la cola de los animales testigo negativo debe estar dentro del intervalo de fondo preestablecido en el laboratorio para cada tejido y tiempo de muestreo de la especie correspondiente (véase el punto 16). En ausencia de información anterior o publicada sobre testigos que demuestre que no se encuentran efectos nocivos ni genotóxicos inducidos por el vehículo elegido, por el número de administraciones o por la vía de administración, deberán realizarse estudios iniciales antes de llevar a cabo el estudio completo, a fin de establecer que es aceptable el testigo del vehículo.

  PROCEDIMIENTO

  Número y sexo de los animales

  Aunque hay pocos datos sobre hembras para posibilitar la comparación entre sexos en relación con el ensayo del cometa, otras respuestas de genotoxicidad in vivo son similares, en general, entre machos y hembras, por lo que la mayor parte de los estudios podrían realizarse con cualquier sexo. Unos datos que demuestren la existencia de diferencias pertinentes entre machos y hembras (como diferencias de toxicidad sistémica, metabolismo, biodisponibilidad, etc., por ejemplo en un estudio de determinación del intervalo) favorecerán la utilización de ambos sexos. En este caso puede ser conveniente realizar un estudio con ambos sexos, por ejemplo como parte de un estudio de toxicidad por administración continuada. Podría ser adecuado utilizar el diseño factorial en caso de que se utilizaran animales de ambos sexos. En el apéndice 2 se recogen detalles sobre cómo analizar los datos utilizando dicho diseño.

  El tamaño de los grupos al principio del estudio (y durante la determinación de la competencia) debe establecerse de manera que comprendan un mínimo de cinco animales analizables de un mismo sexo, o de cada sexo si se utilizan ambos, por grupo (menos en el grupo del testigo positivo en paralelo, véase el punto 29). En caso de que la exposición humana a los productos pueda ser específica de un sexo, como sucede con algunos productos farmacéuticos, el ensayo debe realizarse con animales del sexo correspondiente. Como orientación sobre las necesidades máximas típicas de animales, un estudio realizado de acuerdo con los parámetros establecidos en el punto 33 con tres grupos tratados y testigos negativo y positivo en paralelo (cada grupo compuesto por cinco animales de un solo sexo), requeriría entre 25 y 35 animales.

  PAUTA DE TRATAMIENTO

  Los animales deben recibir tratamientos diarios durante un período de dos o más días (es decir, dos o más administraciones a intervalos de 24 horas, aproximadamente), y deben recogerse muestras una vez a las 2-6 h (o al T_max) después del último tratamiento (12). Son aceptables las muestras tomadas de pautas de tratamiento ampliadas (por ejemplo, administración diaria durante 28 días). Se ha demostrado el éxito de la combinación del ensayo del cometa con el de micronúcleos en eritrocitos (10) (19). No obstante, es preciso prestar especial atención a la logística necesaria en relación con el muestreo de tejidos para el análisis de cometa junto con los requisitos del muestreo de tejidos para otros tipos de evaluaciones toxicológicas. La recolección a las 24 horas de la última administración, típica de un estudio de toxicidad general, no es adecuada en la mayoría de los casos (véase el punto 40 sobre el tiempo de muestreo). El uso de otras pautas de tratamiento y de muestreo debe justificarse (véase el apéndice 3). Por ejemplo, podría utilizarse un único tratamiento con múltiples muestreos; debe observarse, no obstante, que serán necesarios más animales para un estudio con una única administración debido a la necesidad de múltiples momentos de muestreo, pero en ocasiones esto puede ser preferible, por ejemplo cuando el producto problema induce toxicidad excesiva tras la administración repetida.

  Independientemente de cómo se realice el ensayo, es aceptable en la medida en que el producto problema dé una respuesta positiva o, en caso de estudio negativo, siempre que se hayan aportado pruebas directas o indirectas de la exposición del tejido o tejidos diana (o de toxicidad para estos), o si se alcanza la dosis límite (véase el punto 36).

  Los productos problema también pueden administrarse en dosis divididas (es decir, en dos tratamientos el mismo día separados por no más de 2 o 3 horas) con el fin de facilitar la administración de grandes volúmenes. En estas circunstancias, el tiempo de muestreo debe programarse en función del momento de la última administración (véase el punto 40).

  Dosis

  Si se lleva a cabo un estudio previo de determinación del intervalo porque no se dispone de datos adecuados de otros estudios pertinentes para ayudar en la selección de las dosis, ha de hacerse en el mismo laboratorio, con la misma especie, cepa, sexo y pauta de tratamiento que se vayan a utilizar en el estudio principal, según los planteamientos actuales de la realización de estudios de determinación del intervalo (10). El estudio deberá tratar de determinar la dosis máxima tolerada (DMT), definida como la dosis que induce efectos ligeramente tóxicos con respecto a la duración del período de estudio (por ejemplo, signos clínicos claros, tales como comportamiento o reacciones de tipo anormal, pequeña pérdida de peso corporal o citotoxicidad para el tejido diana), pero sin llegar a provocar la muerte ni signos de dolor, sufrimiento o angustia que hagan necesaria la eutanasia. En caso de producto problema no tóxico, con un período de administración de 14 días o más, la dosis máxima (límite) es de 1 000 mg/kg de peso corporal/día. Si el período de administración es inferior a 14 días, la dosis máxima (límite) será de 2 000 mg/kg de peso corporal/día. Estos límites pueden variar con determinados tipos de productos problema (por ejemplo, productos farmacéuticos de uso humano) a los que se apliquen normativas específicas.

  Los productos que presentan saturación de las propiedades toxicocinéticas, o inducen procesos de destoxificación que puedan dar lugar a una disminución de la exposición después de una administración a largo plazo, pueden constituir excepciones en cuanto a los criterios de establecimiento de la dosis y han de evaluarse caso por caso.

  Para las versiones del ensayo del cometa sobre toxicidad tanto aguda como subaguda, además de la dosis máxima (DMT, dosis máxima posible, dosis máxima de exposición o dosis límite), debe seleccionarse una secuencia descendente de al menos otras dos dosis espaciadas adecuadamente (de preferencia separadas por menos de 10) para cada tiempo de muestreo a fin de demostrar la relación de las respuestas con la dosis. No obstante, las dosis empleadas también deben abarcar preferentemente el intervalo entre la máxima y una que produzca toxicidad escasa o nula. Si se observa toxicidad para el tejido diana a todas las dosis utilizadas en el ensayo, se recomienda hacer otro estudio a dosis no tóxicas (véanse los puntos 54-55). Los estudios destinados a investigar de forma más completa la forma de la curva dosis-respuesta pueden necesitar más grupos de dosis.

  Administración de las dosis

  A la hora de diseñar el ensayo, debe tenerse en cuenta la vía prevista de exposición humana. Por lo tanto, cuando esté justificado, podrán elegirse vías de exposición como los alimentos, el agua de bebida, la tópica, la subcutánea, la intravenosa, la oral forzada (por sonda), la inhalación, la intratraqueal o la implantación. En cualquier caso, la vía debe elegirse de forma que se garantice una exposición adecuada del tejido o tejidos diana. En general no se recomienda la inyección intraperitoneal, ya que no es una vía de exposición humana típica y pertinente, y solo debe utilizarse con justificación específica (por ejemplo, algunas sustancias testigo positivo, a efectos de investigación, o algunos medicamentos que se administran por vía intraperitoneal). El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez por sonda o por inyección depende del tamaño del animal utilizado. Este volumen no debe superar 1 ml/l00 g de peso corporal, salvo en el caso de las soluciones acuosas, en que puede llegar a 2 ml/l00 g de peso corporal. Debe justificarse el uso de volúmenes superiores (en caso de que lo permita la legislación sobre bienestar animal). Siempre que sea posible, las diferentes dosis deben lograrse ajustando la concentración de la formulación administrada para garantizar un volumen constante en relación con el peso corporal a todas las dosis.

  Momento del muestreo

  El momento del muestreo es una variable crítica, ya que viene determinado por el plazo necesario para que los productos problema alcancen la concentración máxima en el tejido diana y para que se induzcan las roturas de las cadenas de ADN, pero antes de que tales roturas se supriman, reparen o den lugar a la muerte de las células. La persistencia de algunas de las lesiones que dan lugar a la rotura de las cadenas de ADN detectadas por el ensayo del cometa puede ser muy breve, al menos con algunos productos estudiados in vitro (52) (53). Por consiguiente, en caso de que se sospeche la existencia de tales lesiones transitorias de ADN, deben tomarse medidas para mitigar su pérdida velando por que los tejidos se muestreen antes de que sea demasiado tarde, quizás antes de los plazos previstos que figuran a continuación. El tiempo o tiempos de muestreo óptimos pueden ser específicos del producto o de la vía, lo que puede dar lugar, por ejemplo, a una exposición tisular rápida cuando la administración se hace por vía intravenosa o por inhalación. En consecuencia, cuando sea posible, los tiempos de muestreo deben determinarse a partir de los datos cinéticos (por ejemplo, el tiempo (T_max) al que se alcance la concentración plasmática o tisular máxima (C_max), o al que se alcance el estado de equilibrio en caso de administración múltiple). En ausencia de datos cinéticos, un compromiso adecuado para la medición de la genotoxicidad es tomar las muestras a las 2-6 h después de la última administración en caso de dos o más administraciones, o tanto a las 2-6 horas como a las 16-26 horas tras una administración única, aunque debe velarse por que la autopsia se haga a todos los animales al mismo tiempo desde la última dosis (o desde la dosis única). La información sobre la aparición de efectos tóxicos en los órganos diana (si se dispone de ella) también puede utilizarse para seleccionar los tiempos de muestreo adecuados.

  Observaciones

  Deben hacerse y registrarse observaciones clínicas generales en relación con la salud de los animales al menos una vez al día, preferentemente a la misma hora u horas cada día y teniendo en cuenta el período de mayor intensidad de los efectos previstos tras la administración (54). Al menos dos veces al día, se debe observar la posible morbilidad y mortalidad de todos los animales. En los estudios a largo plazo, deben pesarse todos los animales al menos una vez por semana y en el momento de la terminación del período del ensayo. El consumo de alimentos debe medirse a cada cambio de alimentos y al menos una vez por semana. Si el producto problema se administra con el agua de bebida, debe medirse el consumo de agua cada vez que se cambie el agua y al menos una vez por semana. Los animales que presenten indicadores de toxicidad excesiva pero no letal deben sacrificarse antes de que termine el período del ensayo, y normalmente no se utilizan para el análisis de cometa.

  Recogida de tejidos

  Teniendo en cuenta que es posible estudiar la inducción de la rotura de cadenas de ADN (cometas) en prácticamente cualquier tejido, la justificación de la selección del tejido o tejidos que se van a recoger ha de estar claramente definida y basarse en el motivo de la realización del estudio, junto con los eventuales datos existentes sobre ADME, genotoxicidad, carcinogenicidad u otros tipos de toxicidad en relación con los productos problema sometidos a investigación. Entre los factores importantes que deben considerarse están la vía de administración (sobre la base de la vía o vías probables de exposición humana), la distribución y la absorción tisulares previstas, el papel del metabolismo y el posible mecanismo de acción de los productos problema. El hígado es el tejido estudiado con mayor frecuencia y del que se dispone de más datos. Por lo tanto, a falta de información de fondo, y si no se señala ningún tejido de interés específico, el muestreo del hígado estaría justificado por ser este el principal lugar de metabolismo de las sustancias xenobióticas y estar a menudo muy expuesto tanto a la sustancia original como a sus metabolitos. En algunos casos, puede ser muy pertinente el análisis de un punto de contacto directo (por ejemplo, el estómago glandular o el duodeno/yeyuno en el caso de los productos de administración oral, o los pulmones en el de los productos inhalados). Deben seleccionarse tejidos adicionales o alternativos sobre la base de las razones específicas para la realización del ensayo, pero puede ser útil examinar varios tejidos en los mismos animales, siempre que el laboratorio haya demostrado su competencia con dichos tejidos y con la manipulación de varios tejidos al mismo tiempo.

  Preparación de las muestras

  Para los procesos descritos en los puntos siguientes (44-49) es importante que todas las soluciones o suspensiones estables se utilicen antes de su fecha de caducidad, o que se preparen de nuevo en caso necesario. También en los siguientes puntos, se consideran variables críticas (véanse las definiciones del apéndice 1) los momentos elegidos para: i) retirar cada tejido después de la autopsia, ii) procesar cada tejido para convertirlo en suspensiones de núcleos o células, y iii) procesar la suspensión y preparar los portaobjetos, y deben haberse determinado unos plazos aceptables para cada uno de estas fases durante el establecimiento del método y la demostración de la competencia.

  Los animales se sacrifican, de acuerdo con la legislación sobre bienestar animal y el principio de las tres eres, en el momento o momentos adecuados después del último tratamiento con el producto problema. El tejido o tejidos seleccionados se retiran, se disecan, y una parte se recoge para el ensayo del cometa, y, al mismo tiempo, una sección de la misma parte del tejido debe cortarse y colocarse en solución de formaldehído o en un fijador adecuado para su posible examen histopatológico (véase el punto 55) según métodos normalizados (12). Los tejidos para el ensayo del cometa se colocan en solución amortiguadora de picar, se lavan suficientemente con esta solución en frío para retirar la sangre residual, y se conservan en esta solución enfriada con hielo hasta su transformación. También puede realizarse una perfusión in situ, por ejemplo con el hígado o el riñón.

  Existen muchos métodos publicados para aislar las células/núcleos. Entre ellos figuran el picado de tejidos tales como el hígado y el riñón, el raspado de mucosas en el caso del tubo gastrointestinal, la homogeneización y la digestión enzimática. El estudio de validación del JaCVAM solo estudiaba células aisladas y, por lo tanto, en términos de establecer el método y poder referirse a los datos del estudio del JaCVAM a efectos de demostración de la competencia, es preferible utilizar células aisladas. Sin embargo, se ha puesto de manifiesto que no existía ninguna diferencia esencial en el resultado del ensayo entre utilizar células aisladas o núcleos aislados (8). También se obtuvieron resultados comparables al utilizar métodos diferentes para aislar las células/núcleos (por ejemplo, homogeneización, picado, digestión enzimática y filtración por malla) (55). Por consiguiente, pueden utilizarse tanto células aisladas como núcleos aislados. Los laboratorios deben evaluar a fondo y validar métodos de aislamiento de núcleos/células, específicos de los distintos tejidos. Como se comenta en el punto 40, la persistencia de algunas de las lesiones que dan lugar a la rotura de las cadenas de ADN detectadas por el ensayo del cometa puede ser muy breve (52) (53). Por lo tanto, cualquiera que sea el método utilizado para preparar las suspensiones de células/núcleos aislados, es importante que los tejidos se procesen tan pronto como sea posible una vez que los animales se hayan sacrificado y se pongan en condiciones que reduzcan la eliminación de las lesiones (por ejemplo, manteniendo el tejido a baja temperatura). Las suspensiones celulares deben mantenerse enfriadas con hielo hasta que estén listas para su uso, de modo que puedan demostrarse la mínima variación entre muestras y unas respuestas adecuadas de los testigos positivos y negativos.

  PREPARACIÓN DE LOS PORTAOBJETOS

  La preparación de los portaobjetos debe hacerse tan pronto como sea posible (idealmente en el plazo de una hora) después de la preparación de las células/núcleos aislados, pero la temperatura y el tiempo transcurrido entre la muerte de los animales y la preparación de los portaobjetos deben estar estrictamente controlados y validados con arreglo a las condiciones del laboratorio. El volumen de suspensión celular añadido a agarosa de bajo punto de fusión (generalmente de 0,5 a 1,0 %) para preparar los portaobjetos no debe reducir el porcentaje de la agarosa de bajo punto de fusión a menos del 0,45 %. La densidad celular óptima se determinará mediante el sistema de análisis de imágenes utilizado para examinar los cometas.

  Lisis

  Las condiciones de la lisis también son una variable crítica y pueden interferir con las roturas de cadena debidas a tipos específicos de modificaciones del ADN (ciertas alquilaciones del ADN y adiciones de bases). Se recomienda, por lo tanto, que las condiciones de la lisis se mantengan lo más constantes posible para todos los portaobjetos de un experimento. Una vez preparados, los portaobjetos se sumergen en solución de lisis refrigerada durante al menos una hora (o durante una noche) en torno a 2-8 °C, bajo una iluminación tenue, por ejemplo de luz amarilla (o protegidos de la luz) para evitar su exposición a la luz blanca que puede contener componentes UV. Tras este período de incubación, los portaobjetos deben lavarse para eliminar los restos de detergente y sales antes de la fase de desenrollamiento alcalino. Esto puede hacerse utilizando agua purificada o solución amortiguadora de neutralización o de fosfato. También puede utilizarse la solución amortiguadora de electroforesis. Esto mantendría las condiciones alcalinas en la cámara de electroforesis.

  Desenrollamiento y electroforesis

  Los portaobjetos se colocan de forma aleatoria en la plataforma de una unidad de electroforesis de tipo submarino con una cantidad suficiente de solución de electroforesis, de modo que la superficie de los portaobjetos esté totalmente recubierta (la profundidad de la cobertura debe también ser coherente de una tanda a otra). En otro tipo de unidades de electroforesis para el ensayo del cometa, es decir, con refrigeración activa, circulación y alimentación eléctrica de elevada capacidad, una cobertura más profunda con la solución dará lugar a mayor intensidad de corriente eléctrica a tensión constante. Debe utilizarse un diseño equilibrado para colocar los portaobjetos en el depósito de electroforesis de forma que se mitiguen los efectos de eventuales tendencias o efectos de borde dentro del depósito y se minimice la variabilidad entre lotes, es decir, en cada tanda de electroforesis debe contarse con el mismo número de portaobjetos de cada animal utilizado en el estudio y deben incluirse muestras de los diferentes grupos tratados y de los testigos negativos y positivos. Los portaobjetos se dejan durante al menos 20 minutos para que se desenrolle el ADN y después se someten a la electroforesis en condiciones controladas que maximicen la sensibilidad y el intervalo analítico del ensayo (es decir, que lleven a unos niveles aceptables de porcentaje de ADN de la cola de los testigos positivos y negativos tales que maximicen la sensibilidad). El grado de migración del ADN está asociado linealmente con la duración de la electroforesis, y también con el potencial (V/cm). Sobre la base del ensayo del JaCVAM, estos valores podrían ser 0,7 V/cm durante al menos 20 minutos. La duración de la electroforesis se considera una variable crítica y debe establecerse el tiempo de electroforesis para optimizar el intervalo analítico. Unos tiempos de electroforesis más largos (por ejemplo, de 30 o 40 minutos para maximizar la sensibilidad) suelen dar lugar a respuestas positivas más fuertes con mutágenos conocidos. Sin embargo, unos tiempos de electroforesis más largos también pueden dar lugar a una migración excesiva en las muestras de los testigos. En cada experimento se debe mantener constante la tensión, y la variabilidad de los demás parámetros debe mantenerse dentro de un intervalo estrecho y especificado, por ejemplo en el ensayo del JaCVAM 0,7 V/cm daban una intensidad de corriente inicial de 300 mA. La profundidad de la solución amortiguadora debe ajustarse para permitir las condiciones exigidas y mantenerse a lo largo de todo el experimento. Debe registrarse la intensidad de la corriente al inicio y al final del período de electroforesis. Por tanto, las condiciones óptimas deben determinarse durante la demostración inicial de la competencia en el laboratorio correspondiente con cada tejido estudiado. La temperatura de la solución de electroforesis a lo largo del proceso de desenrollado y electroforesis debe mantenerse baja, generalmente entre 2 y 10 °C (10). Debe registrarse la temperatura de la solución de electroforesis al principio del desenrollado, al inicio de la electroforesis y al final de la electroforesis.

  Tras la terminación de la electroforesis, los portaobjetos deben sumergirse en la solución amortiguadora de neutralización (o lavarse con ella) durante al menos 5 minutos. Los geles pueden teñirse y examinarse «en fresco» (por ejemplo, en el plazo de 1 o 2 días) o pueden deshidratarse para su posterior examen (por ejemplo, en el plazo de 1 a 2 semanas después de la tinción) (56). Sin embargo, las condiciones deben validarse durante la demostración de la competencia y deben obtenerse y conservarse datos históricos por separado de cada una de estas condiciones. En caso de que se seleccione la segunda de tales posibilidades, los portaobjetos se deshidratan sumergiéndolos en etanol absoluto durante un mínimo de 5 minutos; después se dejan secar al aire y luego se guardan a temperatura ambiente o en un recipiente en el frigorífico hasta el momento del examen.

  Métodos de medición

  Los cometas deben examinarse cuantitativamente utilizando un sistema de análisis de imágenes automatizado o semiautomatizado. Los portaobjetos se tiñen con un colorante fluorescente apropiado como, por ejemplo, SYBR Gold, Green I, yoduro de propidio o bromuro de etidio, y se miden a un aumento adecuado (por ejemplo, 200x) en un microscopio de epifluorescencia provisto de detectores apropiados o de una cámara digital (por ejemplo, DAC).

  Las células pueden clasificarse en tres categorías, según se describe en el Atlas de imágenes de cometas (57), a saber: evaluables, no evaluables y «erizo» (véase en el punto 56 un análisis más detallado). Para evitar artefactos, el porcentaje de ADN de la cola debe evaluarse solo en las células evaluables (cabeza y cola claramente definidas, sin ninguna interferencia con las células adyacentes). No es necesario informar de la frecuencia de las células no evaluables. La frecuencia de los erizos debe determinarse sobre la base del examen visual (puesto que la ausencia de una cabeza claramente definida significa que no son detectados fácilmente por análisis de imágenes) de al menos 150 células por muestra (véase en el punto 56 una discusión más profunda) y documentarse por separado.

  Todos los portaobjetos que se hayan de analizar, incluidos los de los testigos positivos y negativos, deben codificarse independientemente y deben examinarse de forma aleatorizada, tal que el examinador no tenga conocimiento de cómo se han tratado. De cada muestra (por tejido y por animal) deben analizarse al menos 150 células (excepto los erizos, véase el punto 56). El examen de 150 células por animal, en al menos 5 animales por dosis (salvo en el testigo positivo en paralelo, véase el punto 29), supone una potencia estadística adecuada según el análisis de Smith et al., 2008 (5). Si se utilizan portaobjetos, esto podría hacerse con el examen de 2 o 3 portaobjetos por muestra cuando se utilizan cinco animales por grupo. Deben observarse varias zonas del portaobjeto con una densidad que garantice que no hay solapamiento de colas. Debe evitarse la evaluación cerca de los bordes de los portaobjetos.

  Las roturas de las cadenas de ADN en el ensayo del cometa se pueden medir con criterios de valoración independientes, tales como el porcentaje de ADN de la cola, y la longitud y el momento de esta. Pueden hacerse las tres mediciones si se utiliza un programa informático apropiado de análisis de imágenes. No obstante, el porcentaje de ADN de la cola (también conocido como porcentaje de intensidad de la cola) se recomienda para la evaluación e interpretación de los resultados (12) (40) (41) (42), y se determina mediante la intensidad del fragmento de ADN de la cola, expresada como porcentaje de la intensidad total de la célula (13).

  Lesiones en los tejidos y citotoxicidad

  Los resultados positivos en el ensayo del cometa pueden no deberse únicamente a la genotoxicidad, sino que la toxicidad para el tejido diana también puede dar lugar a un aumento de la migración del ADN (12) (41). Por el contrario, a menudo se observa baja o moderada citotoxicidad con genotoxinas conocidas (12), lo que indica que no es posible distinguir la migración de ADN inducida por la genotoxicidad frente a la inducida por la citotoxicidad en el ensayo del cometa solo. No obstante, en caso de que se observen aumentos en la migración de ADN, se recomienda efectuar el examen de uno o más indicadores de citotoxicidad, como ayuda en la interpretación de los resultados. Los aumentos en la migración de ADN en presencia de pruebas claras de citotoxicidad deben interpretarse con cautela.

  Se han propuesto muchas mediciones de la citotoxicidad y de estos cambios histopatológicos, que se consideran una medición pertinente de la toxicidad para los tejidos. Ciertas observaciones, tales como la inflamación, la infiltración celular, o cambios apoptóticos o necróticos, se han asociado con aumentos en la migración del ADN; sin embargo, como se demostró en el estudio de validación del JaCVAM (33) , no se dispone de ninguna lista definitiva de cambios histopatológicos que estén siempre asociados a un aumento de la migración del ADN. Los cambios en ciertos parámetros de química clínica (por ejemplo, AST, ALT) también pueden proporcionar información útil sobre las lesiones tisulares y pueden tenerse en cuenta asimismo otros indicadores, tales como la activación de la caspasa, la tinción de TUNEL, la tinción de la anexina V, etc. Sin embargo, hay pocos datos publicados sobre estudios in vivo en los que se hayan utilizado tales indicadores y unos pueden ser menos fiables que otros.

  Los erizos (o nubes, o células fantasma) son células que presentan una imagen al microscopio compuesta por una cabeza pequeña o inexistente y una cola grande y difusa, y se consideran células muy dañadas, aunque su etiología es incierta (véase el apéndice 3). Debido a su aspecto, son poco fiables las mediciones del porcentaje de ADN de la cola por análisis de imágenes, por lo que los erizos deben evaluarse por separado. La presencia de erizos debe registrarse y comunicarse, y se debe investigar e interpretar con cautela cualquier incremento relevante cuyo origen pueda considerarse que es el producto problema. El conocimiento del posible modo de acción de los productos problema puede ayudar a dichas consideraciones.

  DATOS E INFORME

  Tratamiento de los resultados

  La unidad experimental es el animal y, por lo tanto, se deben presentar en forma tabular tanto los datos relativos a cada animal como un resumen de los resultados. Debido a la naturaleza jerárquica de los datos, se recomienda que se determine la mediana del porcentaje de ADN de la cola para cada portaobjetos y que se calcule la media de los valores de la mediana para cada animal (12). A continuación se determina la media de las medias de cada animal, para dar la media del grupo. Todos estos valores deben incluirse en el informe. Pueden aplicarse planteamientos alternativos (véase el punto 53) cuando estén justificados desde el punto de vista científico y estadístico. El análisis estadístico se puede realizar con una variedad de planteamientos (58) (59) (60) (61). A la hora de decidir qué métodos estadísticos utilizar, debe tenerse en cuenta la necesidad de transformar (por ejemplo, logaritmo o raíz cuadrada) los datos o de añadir un pequeño número (por ejemplo, 0,001) a todos los valores (incluso a los distintos de cero) para mitigar los efectos de los valores celulares iguales a cero, como se indica en las referencias anteriormente mencionadas. En el apéndice 2 se encuentran datos del análisis de las interacciones tratamiento/sexo cuando se utilizan animales de ambos sexos, y del posterior análisis de los datos cuando se encuentran diferencias o no. Deben también consignarse los datos sobre toxicidad y signos clínicos.

  Criterios de aceptabilidad

  La aceptabilidad de un ensayo se basa en los criterios siguientes:

  • a. El testigo negativo en paralelo se considera aceptable para añadirse a la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio de acuerdo con lo descrito en el punto 16.
  • b. Los testigos positivos en paralelo (véase el punto 29) deben inducir respuestas compatibles con las obtenidas en la base de datos de testigos positivos históricos y producir un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo.
  • c. Se han analizado números apropiados de células y de dosis (puntos 52 y 36-38).
  • d. Los criterios de selección de la concentración más alta son coherentes con los descritos en el punto 36.

  Evaluación e interpretación de los resultados

  Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente positivo si:

  • a. al menos una de las dosis de ensayo produce un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo,
  • b. el aumento está relacionado con la dosis cuando se evalúa con una prueba de tendencia adecuada,
  • c. alguno de los resultados está fuera de la distribución de los datos de los testigos negativos históricos respecto a una especie, vehículo, vía, tejido, y número de administraciones determinados.

  Cuando se cumplen todos estos criterios, el producto problema se considera capaz de inducir roturas de las cadenas de ADN en los tejidos estudiados en este sistema de ensayo. Si se cumplen solo uno o dos de estos criterios, véase el punto 62.

  Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente negativo si:

  • a. ninguna de las concentraciones de ensayo muestra un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo,
  • b. no hay ningún aumento relacionado con la concentración cuando se evalúa con una prueba de tendencia adecuada,
  • c. todos los resultados están dentro de la distribución de los datos de los testigos negativos históricos respecto a una especie, vehículo, vía, tejido, y número de administraciones determinados,
  • d. se han obtenido pruebas que apoyan directa o indirectamente la exposición del tejido o tejidos diana (o la toxicidad para estos).

  El producto problema se considera entonces incapaz de inducir roturas de las cadenas de ADN en los tejidos estudiados en este sistema de ensayo.

  No se requiere ninguna verificación de una respuesta claramente positiva o negativa.

  En caso de que la respuesta no sea ni claramente positiva ni claramente negativa (es decir, si no se cumplen todos los criterios incluidos en los puntos 59 o 60) y a fin de ayudar a determinar la importancia biológica de un resultado, los datos deben ser evaluados por expertos o mediante más investigaciones, cuando esté justificado científicamente. Puede ser útil examinar células adicionales (en su caso) o realizar una repetición del experimento quizá optimizando las condiciones experimentales, como, por ejemplo, la separación entre dosis, las vías de administración, el momento de la toma de muestras o los tejidos empleados.

  En casos raros, incluso después de hacer más investigaciones, el conjunto de datos no permite que se extraiga una conclusión de resultado positivo o negativo, por lo que se considerará dudoso.

  Para evaluar la importancia biológica de un resultado positivo o dudoso, hay que disponer de información sobre la citotoxicidad en el tejido diana (véanse los puntos 54-55). Cuando se observan resultados positivos o dudosos únicamente en presencia de claros signos de citotoxicidad, se concluirá que el estudio es dudoso en cuanto a la genotoxicidad, a menos que exista suficiente información que apoye una conclusión definitiva. En los casos de resultado negativo de un estudio en que haya signos de toxicidad a todas las dosis sometidas a ensayo, puede ser aconsejable proceder a nuevos estudios a dosis no tóxicas.

  Informe del ensayo

  El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

  • Producto problema:
    • - origen y número de lote, si está disponible;
    • - estabilidad del producto problema, fecha límite de utilización, o fecha de nuevo análisis, si se conoce.
  • Sustancia con un solo componente:
    • - aspecto físico, hidrosolubilidad, y propiedades fisicoquímicas pertinentes adicionales;
    • - identificación química, como nombre IUPAC o CAS, número CAS, código SMILES o InChI, fórmula estructural, pureza, identidad química de las impurezas según convenga y sea factible en la práctica, etc.
  • Sustancias de componentes múltiples, sustancias UVCB y mezclas:
    • - en la medida de lo posible, caracterizadas por la identidad química (véase más arriba), presencia cuantitativa y propiedades fisicoquímicas pertinentes de los componentes.
  • Disolvente o vehículo:
    • - justificación de la elección del disolvente o vehículo;
    • - solubilidad y estabilidad del producto problema en el disolvente o vehículo, si se conocen;
    • - preparación de las formulaciones administradas;
    • - determinaciones analíticas de las formulaciones (por ejemplo, estabilidad, homogeneidad, concentraciones nominales).
  • Animales de ensayo:
    • - especie y cepa utilizadas y justificación científica y ética de la elección;
    • - número, edad y sexo de los animales;
    • - origen, condiciones de alojamiento, dieta, agua, etc.;
    • - peso de cada animal al principio y al final del ensayo, incluido el intervalo de pesos corporales, la media y la desviación típica de cada grupo.
  • Condiciones del ensayo:
    • - datos de los testigos positivos y negativos (vehículo o disolvente);
    • - resultados del estudio de determinación del intervalo, si se ha llevado a cabo;
    • - justificación de la selección de las dosis;
    • - datos de la formulación del producto problema;
    • - datos sobre la administración del producto problema;
    • - fundamento de la elección de la vía de administración;
    • - punto de inyección (en estudios por vía subcutánea o intravenosa);
    • - métodos de preparación de las muestras, cuando estén disponibles, análisis histopatológicos, especialmente en el caso de un producto que dé una respuesta positiva en el ensayo del cometa;
    • - justificación de la selección de los tejidos;
    • - métodos de comprobación de que el producto problema ha alcanzado el tejido diana, o la circulación general, si se obtienen resultados negativos;
    • - dosis reales (mg/kg peso corporal/día) calculadas a partir del consumo y de la concentración (ppm) del producto problema en los alimentos o en el agua de bebida, en su caso;
    • - datos sobre la calidad de los alimentos y del agua;
    • - descripción detallada de las pautas de tratamiento y muestreo y justificación de las decisiones (p. ej., datos toxicocinéticos, cuando estén disponibles);
    • - método de alivio del dolor, analgesia;
    • - método de sacrificio compasivo;
    • - procedimientos de aislamiento y conservación de los tejidos;
    • - métodos de preparación de la suspensión de células/núcleos aislados;
    • - origen y números de lote de todos los reactivos (cuando sea posible);
    • - métodos para evaluar la citotoxicidad;
    • - condiciones de la electroforesis;
    • - técnicas de tinción utilizadas; y
    • - métodos de evaluación y medición de los cometas.
  • Resultados:
    • - observaciones clínicas generales, en su caso, antes del período de ensayo de cada animal, y durante el mismo;
    • - pruebas de la citotoxicidad, si se dispone de ellas;
    • - para los estudios de más de una semana: peso corporal individual al principio del ensayo, incluido el intervalo de pesos corporales, la media y la desviación típica de cada grupo; consumo de alimentos;
    • - relación dosis-respuesta, cuando sea clara;
    • - respecto a cada tejido o animal, el porcentaje de ADN de la cola (u otros parámetros, si se han elegido) y valores de la mediana por portaobjetos, valores medios por animal y valores medios por grupo;
    • - datos sobre los testigos negativos en paralelo e históricos, con los intervalos, medias/medianas y desviaciones típicas de cada tejido evaluado;
    • - datos de los testigos positivos en paralelo e históricos;
    • - respecto a los tejidos distintos del hígado, una curva dosis-respuesta utilizando el testigo positivo; esta puede hacerse con datos recogidos en la demostración de la competencia (véanse los puntos 16-17) y debe acompañarse de una justificación, con referencias a la bibliografía actual, en cuanto a la adecuación de la magnitud y la dispersión de las respuestas a los testigos en ese tejido;
    • - análisis estadísticos y métodos aplicados, y criterios empleados para considerar si una respuesta es positiva, negativa o dudosa;
    • - frecuencia de la presencia de erizos en cada grupo y por animal.
  • Discusión de los resultados
  • Conclusión
  • Bibliografía

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  • (48) Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, John Wiley and Sons, New York 2nd ed.
  • (49) Apéndice A del Convenio Europeo sobre protección de los animales vertebrados utilizados con fines experimentales y otros fines científicos (STE n.º 123)
  • (50) Capítulo B.8 del presente anexo, Toxicidad subaguda por inhalación: estudio de 28 días.
  • (51) Capítulo B.29 del presente anexo, Toxicidad subcrónica por inhalación: estudio de 90 días.
  • (52) Blakey, D.H., G.R. Douglas (1984), Transient DNA lesions induced by benzo[a]pyrene in Chinese hamster ovary cells, Mutation Research, Vol. 140/2-3, pp. 141-45.
  • (53) Blakey, D.H., G.R. Douglas (1990), The role of excision repair in the removal of transient benzo[a]pyrene-induced DNA lesions in Chinese hamster ovary cells, Mutation Research, Vol. 236/1, pp. 35-41.
  • (54) OCDE (2002), “Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.
  • (55) Nakajima, M. (2012), Tissue sample preparation for in vivo rodent alkaline Comet assay, Genes and Environment, Vol. 34/1, pp. 50-4.
  • (56) Hartmann, A. et al. (2003), Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay, Mutagenesis, Vol.18/1, pp.45-51.
  • (57) Atlas of Comet Assay Images, Scientist Press Co., Ltd., Tokyo, Japan.
  • (58) Lovell, D.P., G. Thomas, R. Dubow (1999), Issues related to the experimental design and subsequent statistical analysis of in vivo and in vitro Comet studies, Teratogenesis Carcinogenesis Mutagenesis, Vol. 19/2, pp. 109-19.
  • (59) Wiklund, S.J., E. Agurell (2003), Aspects of design and statistical analysis in the Comet assay, Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 167-75.
  • (60) Bright, J. et al. (2011), Recommendations on the statistical analysis of the Comet assay, Pharmaceutical Statistics, Vol. 10/6, pp. 485-93.
  • (61) Lovell, D.P., T. Omori (2008), Statistical issues in the use of the Comet assay, Mutagenesis, Vol. 23/3, pp. 171-82.

  Apéndice 1

  DEFINICIONES

  Electroforesis en gel de células aisladas en condiciones alcalinas : Técnica sensible para la detección de lesiones primarias del ADN a nivel de células/núcleos individuales.

  Producto : Sustancia o mezcla.

  Cometa : Forma que adoptan los nucleoides después de someterse a un campo electroforético, debido a su similitud con los cometas: la cabeza es el núcleo y la cola está constituida por el ADN que migra afuera del núcleo en el campo eléctrico.

  Variable/parámetro crítico : Variable del protocolo cuyos pequeños cambios pueden tener una gran incidencia en la conclusión del ensayo. Las variables críticas pueden ser específicas de cada tejido. Las variables críticas no deben alterarse, especialmente dentro de un ensayo, sin tener en cuenta cómo la modificación va a alterar una respuesta del ensayo, por ejemplo según indiquen la magnitud y la variabilidad en los testigos positivos y negativos. El informe del ensayo debe enumerar las alteraciones de variables críticas aportadas durante el ensayo o en comparación con el protocolo de referencia en el laboratorio y proporcionar una justificación de cada alteración.

  Intensidad de la cola o porcentaje de ADN de la cola : Esto corresponde a la intensidad de la cola del cometa con respecto a la intensidad total (cabeza y cola). Refleja la cantidad de roturas del ADN, y se expresa como porcentaje.

  Producto problema : Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

  UVCB : Sustancias de composición desconocida o variable, productos complejos de reacción o materiales biológicos.

  Apéndice 2 DISEÑO FACTORIAL PARA IDENTIFICAR LAS DIFERENCIAS DE SEXO EN EL ENSAYO DEL COMETA IN VIVO

  Diseño factorial y su análisis

  En este diseño, un mínimo de 5 machos y 5 hembras se someten a ensayo a cada concentración, lo que resulta en la utilización de un mínimo de 40 animales (20 machos y 20 hembras, más los testigos positivos pertinentes).

  Este diseño, que es uno de los diseños factoriales más simples, es equivalente a un análisis de varianza de dos factores, con el sexo y el nivel de concentración como efectos principales. Los datos pueden analizarse con numerosos paquetes de software estadístico estándar tales como SPSS, SAS, STATA, Genstat, así como utilizando R.

  El análisis divide la variabilidad de la serie de datos en variabilidad entre los sexos, variabilidad entre las concentraciones y variabilidad relativa a la interacción entre los sexos y las concentraciones. Cada uno de los términos se somete a prueba frente a una estimación de la variabilidad entre los animales replicados dentro de los grupos de animales del mismo sexo que han recibido la misma concentración. Todos los detalles de la metodología subyacente se encuentran en muchos manuales estadísticos conocidos (véanse las referencias) y en las funciones de «ayuda» de los paquetes estadísticos.

  El análisis se lleva a cabo inspeccionando el término de la interacción sexo x concentración en el cuadro de ANOVA (40) . A falta de un término de interacción significativo, los valores combinados de distintos sexos o niveles de concentración ofrecen pruebas estadísticas válidas entre los niveles, sobre la base del término de ANOVA de variabilidad intragrupo puesta en común.

  El análisis continúa dividiendo la estimación de la variabilidad entre concentraciones en contrastes que permiten una prueba de contrastes lineales y cuadráticos de las respuestas a través de los niveles de concentración. Cuando existe un término de interacción significativa sexo x concentración, este término también puede dividirse en contrastes de interacción lineal x sexo y cuadrático x sexo. Estos términos permiten pruebas de si las respuestas a la concentración son paralelas en los dos sexos, o si existe una diferencia en la respuesta entre estos.

  La estimación de la variabilidad intragrupo puesta en común se puede utilizar para proporcionar pruebas pareadas de la diferencia entre medias. Estas comparaciones podrían realizarse entre las medias para los dos sexos y entre las medias para los diferentes niveles de concentración, así como para las comparaciones con los niveles de los testigos negativos. En los casos en los que existe una interacción significativa pueden hacerse comparaciones entre las medias de concentraciones diferentes dentro de un sexo o entre las medias de los sexos a la misma concentración.

  Bibliografía

  Hay muchos manuales estadísticos que debaten la teoría, el diseño, la metodología, el análisis y la interpretación de los diseños factoriales que van desde los análisis bifactoriales más sencillos hasta las formas más complejas utilizadas en la metodología de diseño de experimentos. La lista que sigue no es exhaustiva. Algunos libros proporcionan ejemplos resueltos de diseños comparables, en algunos casos con el código para aplicar los análisis utilizando diversos paquetes de software.

  • (1) Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.
  • (2) Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987) Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
  • (3) Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007) Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
  • (4) Mead, R. (1990) The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
  • (5) Montgomery D.C. (1997) Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
  • (6) Winer, B.J. (1971) Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
  • (7) Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009) Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

  Apéndice 3 LIMITACIONES ACTUALES DEL ENSAYO

  Debido al estado actual de los conocimientos, el ensayo del cometa in vivo tiene asociadas varias limitaciones. Se espera que estas limitaciones se reduzcan o definan de manera más estricta según se vaya ganando más experiencia con la aplicación del ensayo para responder a cuestiones de seguridad en un contexto reglamentario.

  1. Algunos tipos de lesiones del ADN pueden ser de corta duración, es decir, pueden repararse con demasiada rapidez como para observarse cuando hayan pasado 24 horas o más desde la última administración. No se puede identificar ninguna lista de las lesiones de breve duración, ni de los productos que pueden provocar este tipo de lesiones, y tampoco se sabe en qué plazo puede detectarse este tipo de lesiones. El tiempo o tiempos de muestreo óptimo pueden también ser específicos del producto o de la vía de aplicación, y los tiempos de muestreo deben determinarse a partir de los datos cinéticos (por ejemplo, el tiempo, T_máx, al que se obtiene la concentración plasmática o tisular máxima), cuando se disponga de tales datos. La mayoría de los estudios de validación en apoyo de este método de ensayo especificaban la autopsia a las 2 o 3 horas tras la administración de la última dosis. La mayor parte de los estudios publicados en la bibliografía describen la administración de la dosis final entre 2 y 6 horas antes del sacrificio. Por lo tanto, estas experiencias se utilizaron como base para la recomendación recogida en el método de ensayo de que, a falta de datos que indiquen lo contrario, la dosis final debe administrarse en un momento concreto entre 2 y 6 horas antes de la autopsia.

  2. No hay datos de estudios identificables que permitan examinar la sensibilidad del ensayo para la detección de las lesiones del ADN de breve duración tras la administración del producto con los alimentos o el agua de bebida, en comparación con la administración por sonda. Se han detectado lesiones del ADN tras la administración con los alimentos y el agua de bebida, aunque hay relativamente pocos informes de este tipo frente a la experiencia mucho mayor sobre la administración con sonda e intraperitoneal. Así pues, la sensibilidad del ensayo puede verse reducida en caso de productos que provocan lesiones de breve duración administrados con los alimentos o el agua potable.

  3. No se han llevado a cabo estudios interlaboratorios en tejidos distintos de hígado y estómago, por lo que no se ha establecido ninguna recomendación sobre cómo lograr una respuesta sensible y reproducible en tejidos distintos del hígado, tales como unos intervalos previstos de los testigos positivos y negativos. En el caso del hígado, tampoco pudo alcanzarse ningún acuerdo sobre el establecimiento de un límite inferior para el valor del testigo negativo.

  4. Aunque existen varias publicaciones que demuestran el efecto de confusión de la citotoxicidad in vitro, se han publicado muy pocos datos in vivo y, por consiguiente, no puede recomendarse ninguna medida de citotoxicidad. Ciertos cambios histopatológicos, tales como la inflamación, la infiltración celular, o los cambios apoptóticos o necróticos, se han asociado con aumentos en la migración del ADN; sin embargo, como se demostró en el estudio de validación del JaCVAM (OCDE, 2014), estos cambios no provocan siempre unos resultados positivos en el ensayo del cometa y, por tanto, no se dispone de ninguna lista definitiva de cambios histopatológicos que estén siempre asociados a un aumento de la migración del ADN. En el pasado se han sugerido los erizos (o nubes, o células fantasma) como indicador de la citotoxicidad; sin embargo, la etiología de los erizos es dudosa. Existen datos que indican que pueden deberse a la citotoxicidad relacionada con los productos o a lesiones inducidas de forma mecánica o enzimática durante la preparación de la muestra (Guerard et al., 2014), o ser un efecto más extremo de la genotoxicidad del producto problema. Otros datos parecen demostrar que se deben a unas lesiones del ADN amplias pero quizás reparables (Lorenzo et al., 2013).

  5. Se han congelado con éxito tejidos o núcleos celulares para su posterior análisis. Esto suele traducirse en un efecto mensurable sobre la respuesta al testigo del vehículo y al testigo positivo (Recio et al., 2010; Recio et al., 2012; Jackson et al., 2013). En caso de que se utilice esta posibilidad, el laboratorio debe demostrar su competencia con las metodologías de congelación y confirmar unos bajos intervalos aceptables de porcentaje de ADN de la cola en los tejidos diana de animales tratados con el vehículo, y que aún pueden detectarse las respuestas positivas. En la bibliografía se ha descrito la congelación de los tejidos utilizando distintos métodos. Sin embargo, actualmente no hay acuerdo sobre la mejor manera de congelar y descongelar los tejidos, ni sobre cómo evaluar si una posible respuesta modificada puede afectar a la sensibilidad del ensayo.

  6. Un trabajo reciente demuestra que se espera que la lista de variables críticas continúe abreviándose y los parámetros de las variables críticas se definan de manera más precisa (Guerard et al., 2014).

  Bibliografía

  • (1) Guerard, M., C. Marchand, U. Plappert-Helbig (2014), Influence of Experimental Conditions on Data Variability in the Liver Comet Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 55/2, pp. 114-21.
  • (2) Jackson, P. et al. (2013), Validation of use of frozen tissues in high-throughput comet assay with fully-automatic scoring, Mutagenesis, Vol. 28/6, pp. 699-707.
  • (3) Lorenzo,Y. et al. (2013), The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead, Mutagenesis, Vol. 28/4, pp. 427-32.
  • (4) OCDE (2014), Reports of the JaCVAM initiative international pre-validation and validation studies of the in vivo rodent alkaline comet assay for the detection of genotoxic carcinogens, Series on Testing and Assessment, Nos. 195 and 196, OECD Publishing, Paris.
  • (5) Recio L, Hobbs C, Caspary W, Witt KL, (2010), Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus (MN) and Comet assay protocol, J. Toxicol. Sci. 35:149-62.
  • (6) Recio, L. et al. (2012), Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 53/2, pp. 101-13.»
• 16) En la parte B, el capítulo C.13 se sustituye por el texto siguiente:

  « C.13
  
  Bioacumulación en peces: exposición acuática y alimentaria

  INTRODUCCIÓN

  El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo (TG) de la OCDE 305 (2012). El objetivo principal de la presente revisión del método de ensayo es doble. En primer lugar, se propone incorporar un ensayo de bioacumulación alimentaria (36) apropiado para determinar el potencial de bioacumulación de sustancias con hidrosolubilidad muy baja. En segundo lugar, se pretende crear un método de ensayo que, cuando proceda, utilice menos peces por motivos de bienestar de los animales, y que sea económicamente más rentable.

  En los años transcurridos desde la aprobación del método de ensayo consolidado C.13 (1), se han sometido a ensayo numerosas sustancias, y han acumulado considerable experiencia tanto los laboratorios como las autoridades normativas. Esto ha llevado a la convicción de que la complejidad del ensayo puede reducirse si se cumplen unos criterios específicos (véase el punto 88), y de que es posible un enfoque escalonado. La experiencia también ha demostrado que ciertos factores biológicos, como el crecimiento y el contenido lipídico de los peces, pueden tener un fuerte impacto sobre los resultados y puede ser necesario tenerlos en cuenta. Además, se ha reconocido que puede no ser técnicamente viable el ensayo de sustancias muy poco hidrosolubles. Además, en el caso de las sustancias muy poco hidrosolubles en el medio acuático, la exposición a través del agua puede ser de importancia limitada en comparación con la vía alimentaria. Esto ha dado lugar a la elaboración de un método de ensayo en el que los peces se exponen a través de su alimentación (véanse los puntos 7-14 y a partir del 97). En 2010 se procedió a una validación (prueba interlaboratorios) de la exposición alimentaria (51).

  Los principales cambios son los siguientes:

  • - La utilización de una sola concentración de ensayo puede considerarse suficiente, si resulta probable que el factor de bioconcentración (FBC) es independiente de la concentración de ensayo.
  • - Un diseño minimizado del ensayo de exposición acuática, en el que es posible un número reducido de puntos de muestreo, si se cumplen unos criterios específicos.
  • - Debe medirse el contenido lipídico de los peces, de forma que pueda expresarse el FBC referido a un contenido lipídico del 5 %.
  • - Mayor hincapié en la estimación del FBC cinético (cuando sea posible) además de calcular el FBC en el estado de equilibrio.
  • - Para determinados grupos de sustancias, se propondrá un ensayo de exposición alimentaria, si se considera más adecuado que un ensayo de exposición acuática.
  • - Debe medirse el peso de los peces, de forma que el FBC_k pueda corregirse en función de la dilución por el crecimiento.

  Antes de llevar a cabo ninguno de los ensayos de bioacumulación, debe conocerse la siguiente información acerca de la sustancia problema:

  • a) Sensibilidad de la técnica analítica para medir las concentraciones de la sustancia problema y sus posibles metabolitos en los tejidos, en el agua o en los alimentos (véase el punto 65);
  • b) Hidrosolubilidad [método A.6; (2)]; debe determinarse según un método adecuado para el intervalo (estimado) de la solubilidad para obtener un valor fiable; en el caso de las sustancias hidrófobas, será generalmente el método de elución en columna;
  • c) Coeficiente de reparto n-octanol/agua K _OW (41) [métodos A.8 (4) A.24 (5) y A.23 (6)], u otra información adecuada sobre el comportamiento en cuanto al reparto (p. ej., sorción en lípidos, K _OC); debe determinarse según un método adecuado para el intervalo (estimado) del K _OW para obtener un valor fiable; en el caso de las sustancias hidrófobas, será generalmente el método de agitación lenta [método A.23(6)];
  • d) Estabilidad de la sustancia en agua (hidrólisis [método C.7 (7)]);
  • e) Estabilidad de la sustancia en los alimentos (específicamente cuando se elige un ensayo de exposición alimentaria);
  • f) Información sobre la fototransformación pertinente para las condiciones de irradiación del ensayo (8);
  • g) Tensión superficial (para las sustancias cuyo log K _OW no puede determinarse) [método A.5 (9)];
  • h) Presión de vapor [método A.4 (10)];
  • i) Eventual información sobre la degradación biótica o abiótica en agua, como por ejemplo la biodegradabilidad fácil [métodos C.4, partes II a VII (11), C.29 (12)], cuando sea pertinente;
  • j) Información sobre los metabolitos: estructura, log K _OW, formación y degradabilidad, cuando proceda;
  • k) Constante de disociación ácida (pK _a) de las sustancias que puedan ionizarse; en caso necesario, el pH del agua de ensayo debe ajustarse de manera que la sustancia se encuentre en el ensayo en la forma no ionizada si es compatible con las especies de peces.

  Independientemente del método de exposición o de la pauta de muestreo que se hayan elegido, el presente método de ensayo describe un procedimiento para caracterizar el potencial de bioacumulación de las sustancias en los peces. Aunque son muy preferibles los regímenes de ensayos dinámicos, los regímenes semiestáticos son aceptables a condición de que se cumplan los criterios de validez (véanse los puntos 24 y 113). En la vía de exposición alimentaria, el sistema dinámico no es necesario para mantener las concentraciones acuosas de la sustancia problema, pero contribuye a mantener las concentraciones adecuadas de oxígeno disuelto y a mantener el agua limpia y eliminar las influencias de, por ejemplo, los productos de excreción.

  Independientemente del método de ensayo elegido, en el presente método de ensayo se da suficiente información para realizarlo, dejando bastante libertad para adaptar el diseño experimental a las condiciones específicas de cada laboratorio y para variar las características de las sustancias problema. El ensayo de exposición acuática se aplica de forma más adecuada a las sustancias orgánicas estables con valor de log K _OW entre 1,5 y 6,0 (13) pero también es aplicable a las sustancias muy hidrófobas (con log K _OW > 6,0), si puede demostrarse una concentración estable y totalmente disuelta de la sustancia problema en agua. Si no puede demostrarse una concentración estable de la sustancia problema en agua, no será adecuado el ensayo acuático; por tanto, será necesario seguir el enfoque alimentario para el ensayo de la sustancia en los peces (aunque la interpretación y el uso de los resultados del ensayo alimentario pueden depender del marco reglamentario). Mediante la ecuación de Bintein et al. (14) se pueden obtener valores pre-estimados del factor de bioconcentración (FBC, a veces expresado como K _B) de sustancias orgánicas con valores de log K _OW de hasta alrededor de 9,0. El valor pre-estimado del factor de bioconcentración de tales sustancias muy hidrófobas puede ser mayor que el valor del factor de bioconcentración en estado de equilibrio (FBC_SS) que se puede esperar en un experimento de laboratorio, especialmente cuando se utiliza un modelo lineal simple para el valor pre-estimado. Entre los parámetros que caracterizan el potencial de bioacumulación se encuentran la constante de la velocidad de absorción (k ₁), las constantes de la velocidad de pérdida que incluyen la constante de la velocidad de depuración (k ₂), el factor de bioconcentración en el estado de equilibrio (FBC_SS), el factor de bioconcentración cinético (FBC_K) y el factor de biomagnificación alimentario (FBM) (42)

  Puede facilitarse el análisis de las muestras de agua, alimentos y peces con ayuda de sustancias problema radiomarcadas, que pueden también servir para determinar si se deben identificar y cuantificar los metabolitos. Si solo se miden los residuos radiactivos totales (por ejemplo, por combustión o solubilización de los tejidos), el FBC o FBM se basa en el total de la sustancia original, en los eventuales metabolitos retenidos y también en el carbono asimilado. Así pues, los valores del FBC o FBM basados en los residuos radiactivos totales no pueden ser directamente comparables a los valores de FBC o FBM derivados de un análisis químico específico solo de la sustancia original. Pueden aplicarse procedimientos de separación, como la TLC, HPLC o GC (43) , antes del análisis en estudios radiomarcados para determinar el FBC o el FBM basados en la sustancia original. Cuando se aplican tales técnicas de separación, debe efectuarse la identificación y cuantificación de la sustancia original y de los metabolitos pertinentes (44) (véase el punto 65) si se quiere que el FBC o FBM se base en la concentración de la sustancia original en los peces y no en la del total de residuos radiomarcados. También se puede combinar un estudio del metabolismo de los peces o de la distribución in vivo con un estudio de bioacumulación por análisis e identificación de los residuos en los tejidos. La posibilidad del metabolismo se puede predecir mediante instrumentos adecuados [por ejemplo, herramientas sobre la relación estructura-actividad de la OCDE (OECD QSAR toolbox) (15) y programas de QSAR protegidos].

  La decisión de si llevar a cabo un ensayo de exposición acuática o alimentaria, y en qué configuración debe basarse en los factores del punto 3, considerados junto con el marco normativo pertinente. Por ejemplo, en el caso de las sustancias que tienen un valor elevado de log K _OW pero presentan hidrosolubilidad apreciable con respecto a la sensibilidad de las técnicas analíticas disponibles, debe considerarse en primera instancia un ensayo de exposición acuática. No obstante, es posible que la información sobre la hidrosolubilidad no sea definitiva para estos tipos de sustancias hidrófobas, por lo que, antes de tomar una decisión sobre qué método de ensayo utilizar, debe investigarse la posibilidad de preparar en agua concentraciones disueltas, estables y mensurables (no se permiten emulsiones estables) aplicables a un estudio de exposición acuática (16). No es posible dar orientaciones normativas exactas en relación con el método que debe usarse, solo sobre la base de criterios de «corte» como la hidrosolubilidad y el coeficiente de reparto octanol/agua, ya que otros factores (técnicas analíticas, degradación, adsorción, etc.) pueden tener una influencia marcada en la aplicabilidad del método por las razones anteriormente expuestas. No obstante, un log K _OW superior a 5 y una hidrosolubilidad por debajo de ~ 0,01-0,1 mg/l marcan la gama de sustancias en las que los ensayos por exposición acuática pueden ser cada vez más difíciles.

  Deben considerarse los demás factores que puedan influir en la elección del ensayo, incluido el potencial de adsorción de la sustancia a los recipientes y aparatos del ensayo, su estabilidad en solución acuosa frente a su estabilidad en los alimentos de los peces (17) (18), etc.

  Puede encontrarse información sobre estos aspectos prácticos en otros estudios completados en agua. En la bibliografía se dispone de más información sobre la evaluación de los aspectos vinculados al comportamiento de los estudios de bioacumulación (véase, p. ej., (19)).

  Respecto a aquellas sustancias con las cuales la solubilidad o el mantenimiento de la concentración en el agua, así como el análisis de estas concentraciones, no plantean ninguna restricción a la utilización de un método de exposición acuática, es preferible utilizar este método para determinar el potencial de bioconcentración de la sustancia. En cualquier caso, debe verificarse que la concentración o concentraciones para exposición acuática que deben aplicarse están dentro del margen de solubilidad en el medio de ensayo. Pueden utilizarse diferentes métodos para mantener estable la concentración de la sustancia problema disuelta, como el uso de soluciones madre o de sistemas de administración pasiva (por ejemplo, método de elución en columna), siempre que pueda demostrarse que las concentraciones pueden mantenerse estables y que los medios de ensayo no se alteran respecto a los recomendados en el punto 27.

  Con sustancias muy hidrófobas (log K _OW > 5 y solubilidad inferior a ~ 0,01-0,1 mg/l), los ensayos por exposición acuática pueden ser cada vez más difíciles. Entre los motivos de las restricciones están el que la concentración en el que no pueda mantenerse a un nivel que se considere suficientemente constante (por ejemplo, debido a la sorción al vidrio de los recipientes de exposición o una rápida absorción por los peces) o el que las concentraciones acuosas que se deban aplicar sean tan bajas que se sitúen en el mismo intervalo que el límite analítico de cuantificación o por debajo de él (45) . Con estas sustancias muy hidrófobas se recomienda el ensayo alimentario, siempre que el ensayo sea coherente con el marco reglamentario pertinente y las necesidades de evaluación de riesgos.

  En el caso de los agentes tensioactivos, se debe considerar si es factible el ensayo de bioconcentración acuosa, habida cuenta de las propiedades de la sustancia; en caso contrario, el estudio alimentario es probablemente más adecuado. Los agentes tensioactivos actúan sobre la tensión superficial y reducen la tensión interfacial entre dos líquidos. Su naturaleza anfifílica (es decir, contienen una parte hidrófila y una parte hidrófoba) hace que se acumulen en los interfaces como, por ejemplo, la interfaz agua-aire, la interfaz agua-alimento, y las paredes de vidrio, lo que dificulta la determinación de su concentración en el agua.

  El ensayo alimentario permite superar algunos de los aspectos de la exposición en caso de mezclas complejas con componentes de diferentes límites de hidrosolubilidad, ya que es más probable conseguir una exposición comparable a todos los componentes de la mezcla que con el método acuático (véase (20)).

  Debe señalarse que el planteamiento alimentario arroja un factor de biomagnificación alimentario (FBM) en lugar de un factor de bioconcentración (FBC) (46) . Se dispone de enfoques para calcular un factor de bioconcentración cinético (FBC_K) a partir de datos obtenidos en el estudio alimentario (como se indica en el apéndice 8), pero estos enfoques se deben utilizar con prudencia. En general, asumen una cinética de primer orden, y son aplicables solo a determinados grupos de compuestos. Es poco probable que este tipo de enfoques pueda aplicarse en el caso de los agentes tensioactivos (véase el punto 12).

  Una configuración minimizada de ensayo de exposición acuática con menos puntos de muestreo para reducir el número de animales o recursos (véase a partir del punto 83) solo debe aplicarse a aquellas sustancias con las que haya motivos para esperar que la absorción y la depuración sigan una cinética aproximadamente de primer orden (es decir, en general, sustancias orgánicas no ionizadas, véase el punto 88).

  C.13 - I
  
  Ensayo de bioconcentración en peces con exposición acuática

  PRINCIPIO DEL ENSAYO

  El ensayo se divide en dos fases: la de exposición (absorción) y la posterior a la exposición (depuración). Durante la fase de absorción, un grupo de peces de una sola especie queda expuesto a la sustancia problema a una o varias concentraciones elegidas, en función de las propiedades de la sustancia problema (véase el punto 49). Luego se transfieren a un medio libre de esta sustancia, para la fase de depuración. Esta última fase es necesaria siempre, excepto cuando la absorción de la sustancia durante la fase de absorción ha sido insignificante. La concentración de la sustancia problema en los peces (o en tejidos específicos) se mide durante las dos fases del ensayo. Además del grupo expuesto a la sustancia problema, se mantiene un grupo testigo de peces en condiciones idénticas, salvo que no se expone a la sustancia problema, para relacionar los posibles efectos nocivos observados en el ensayo de bioconcentración con un grupo testigo correspondiente, y deducir las concentraciones de fondo de la sustancia problema (47) .

  En el ensayo de exposición acuática, la fase de absorción tiene generalmente una duración de 28 días. La duración puede aumentarse en caso necesario (véase el punto 18), o reducirse si se demuestra que se ha alcanzado antes el estado de equilibrio (véase el apéndice 1, Definiciones y unidades). Puede preverse la duración de la fase de absorción y el tiempo necesario para la obtención del estado de equilibrio gracias a las ecuaciones del apéndice 5. El periodo de depuración comienza entonces, cuando los peces dejan de exponerse a la sustancia problema, con la transferencia de los peces a un recipiente limpio con el mismo medio, pero sin la sustancia problema. Cuando sea posible, se calcula el factor de bioconcentración preferentemente como proporción de la concentración en los peces (C _f) y en el agua (C _w) en el estado de equilibrio (FBC_SS; véase la definición en el apéndice 1) y como factor de bioconcentración cinético (FBC_K; véanse las definiciones y unidades del apéndice 1), que se calcula como la proporción de las constantes de velocidad de absorción (k ₁) y depuración (k ₂) suponiendo cinética de primer orden (48) .

  Si no se llega al estado de equilibrio en 28 días, se calcula el FBC utilizando el enfoque cinético (véase el punto 38) o se puede ampliar la fase de absorción. En caso de que para alcanzar el estado de equilibrio sea necesaria una fase de absorción de longitud excesiva en la práctica (véanse los puntos 37 y 38, apéndice 5), será preferible el enfoque cinético. Como alternativa, en el caso de las sustancias muy hidrófobas debe considerarse la realización de un estudio alimentario (49) , a condición de que el ensayo alimentario sea compatible con el marco normativo pertinente.

  La constante de la velocidad de absorción, la constante de la velocidad de depuración (pérdida) (o las constantes, cuando entren en juego modelos más complejos), el factor de bioconcentración (en el estado de equilibrio y/o cinético) y, si es posible, los intervalos de confianza de cada uno de estos parámetros, se calculan a partir del modelo que describa mejor las concentraciones medidas de la sustancia problema en los peces y en el agua (véase el apéndice 5).

  El aumento de la masa de los peces durante el ensayo se traducirá en una disminución de la concentración de la sustancia problema en los peces en crecimiento (la denominada dilución debida al crecimiento) y, por tanto, el FBC cinético estará subestimado si no se corrige para tener en cuenta este fenómeno (véanse los puntos 72 y 73).

  El FBC se basará en la concentración total en los peces (es decir, respecto al peso húmedo total de los peces). Sin embargo, para algunos estudios pueden utilizarse tejidos u órganos específicos (por ejemplo, músculos, hígado) si los peces son suficientemente grandes o si es posible separar las partes comestibles (filetes) y no comestibles (vísceras). Como hay una clara relación entre el potencial de bioconcentración y la hidrofobicidad de numerosas sustancias orgánicas, también hay una relación correspondiente entre el contenido lipídico de los peces del ensayo y las bioconcentraciones observadas de tales sustancias. Así pues, para reducir esta fuente de variabilidad en los resultados de los ensayos relativos a las sustancias con fuerte lipofilia (es decir, con log K _OW > 3), la bioconcentración debe expresarse normalizada con referencia a un contenido lipídico de los peces del 5 % (sobre la base del peso corporal húmedo entero) además de la obtenida directamente del estudio. Esto es necesario para proporcionar una base sobre la cual puedan compararse entre sí los resultados de las distintas sustancias o con diferentes especies de ensayo. La cifra de 5 % de contenido lipídico es de amplia utilización, ya que se trata de la media del contenido lipídico de los peces utilizados comúnmente en el presente método de ensayo (21).

  INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA

  Además de las propiedades de la sustancia problema que figuran en la introducción (punto 3), será necesario también conocer su toxicidad para la especie de peces utilizada en el ensayo, preferiblemente la LC₅₀ asintótica (es decir, independiente del tiempo) o la toxicidad estimada a partir de ensayos de toxicidad a largo plazo en peces (por ejemplo, métodos C.47 (22), C.15 (23) y C.14 (24)).

  Debe disponerse de un método analítico adecuado, con una exactitud, una precisión y una sensibilidad conocidas para la cuantificación de la sustancia en las soluciones de ensayo y en el material biológico, así como de datos precisos sobre la preparación y la conservación de las muestras. Es necesario también conocer el límite de cuantificación analítica de la sustancia problema tanto en el agua como en los tejidos de los peces. Si se utiliza una sustancia problema radiomarcada, deberá ser del nivel más alto de pureza (por ejemplo, preferiblemente > 98 %) y deberá conocerse el porcentaje de radiactividad asociada con las impurezas.

  VALIDEZ DEL ENSAYO

  Para que el ensayo sea válido han de darse las condiciones siguientes:

  La variación de temperatura del agua será inferior a ± 2 °C, ya que unas desviaciones importantes pueden afectar a parámetros biológicos pertinentes para la absorción y la depuración, así como resultar agresivas para los animales;

  La concentración de oxígeno disuelto no caerá por debajo del 60 % del nivel de saturación;

  La concentración de la sustancia problema en los recipientes se mantendrá en la banda del ± 20 % de la media de los valores medidos durante la fase de absorción;

  La concentración de la sustancia problema será inferior a su límite de solubilidad en el agua, teniendo en cuenta el efecto que puede tener el agua del ensayo sobre la solubilidad efectiva (50) ;

  La mortalidad y demás efectos adversos o enfermedades tanto entre los peces testigo como entre los tratados serán inferiores al 10 % al final del ensayo; cuando el ensayo se prolongue a lo largo de varias semanas o meses, la mortalidad y los otros efectos adversos en los dos conjuntos de peces deberán ser inferiores al 5 % al mes y no exceder del 30 % en total; unas diferencias significativas en el crecimiento medio entre los grupos tratado y testigo de las muestras de peces podrían ser indicio de un efecto tóxico de la sustancia problema.

  SUSTANCIAS DE REFERENCIA

  El uso de sustancias de referencia de metabolismo bajo y de potencial de bioconcentración conocido podrá ayudar al control del procedimiento experimental, en caso necesario (por ejemplo, cuando un laboratorio no tenga experiencia previa con el ensayo o se hayan modificado las condiciones experimentales).

  DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

  Equipo

  Se han de evitar los materiales que puedan presentar fenómenos de disolución, sorción o lixiviación o tener algún efecto adverso sobre los peces, y esto en todas las partes del equipo. Pueden utilizarse recipientes normales rectangulares o cilíndricos, hechos de material químicamente inerte y de una capacidad adaptada a la tasa de carga (véase el punto 43). Se debe reducir al mínimo el uso de tubos de plástico blando. Deben utilizarse tubos de politetrafluoroetileno, acero inoxidable o vidrio. La experiencia pone de manifiesto que pudiera ser necesario el vidrio silanizado para las sustancias que presentan un fuerte coeficiente de adsorción, como los piretroides sintéticos por ejemplo. Será necesario, en tales casos, deshacerse de los equipos una vez usados. Es preferible exponer los sistemas de ensayo a las concentraciones de la sustancia problema que se vayan a utilizar en el estudio, durante el tiempo que se requiera para demostrar el mantenimiento de unas concentraciones de exposición estables, antes de introducir los organismos de ensayo.

  Agua

  Se utiliza generalmente para el ensayo agua natural procedente de una fuente no contaminada y de calidad uniforme. Sin embargo, puede ser más adecuado utilizar agua reconstituida (es decir, agua desmineralizada con nutrientes específicos añadidos en cantidades conocidas) para garantizar la uniformidad de la calidad a lo largo del tiempo. El agua de dilución, que es el agua que se mezcla con la sustancia problema antes de introducirla en el recipiente de ensayo (véase el punto 30), debe ser tal que permita la supervivencia de la especie de peces elegida, durante los periodos de aclimatación y de ensayo, sin que aparezcan ningún comportamiento ni aspecto anormales. Idealmente, se debería demostrar que las especies sometidas al ensayo pueden sobrevivir, crecer y reproducirse en el agua de dilución (por ejemplo, mediante cría en laboratorio o un estudio de toxicidad sobre el ciclo biológico). El agua de dilución se caracterizará al menos mediante su pH, dureza, materia sólida total, carbono orgánico total (COT (51) ) pero también, preferentemente, mediante su contenido en amoniaco y nitritos y su alcalinidad, así como, en el caso de las especies marinas, su salinidad. No se conocen perfectamente los parámetros importantes para el bienestar óptimo de los peces, pero el apéndice 2 indica las concentraciones máximas recomendadas de una serie de parámetros relativos al agua de ensayo, tanto dulce como salada.

  A lo largo de toda la duración de un ensayo, el agua de dilución debe tener calidad constante. El pH se ha de mantener entre 6,0 y 8,5 al inicio del ensayo, pero durante un ensayo dado debe permanecer dentro de un intervalo de ± 0,5 unidades de pH. Para garantizar que el agua de dilución no influye indebidamente en los resultados del estudio (por ejemplo, por complejación de la sustancia problema) ni afecta negativamente al comportamiento de las poblaciones de peces, se deben tomar regularmente muestras para análisis, al menos al inicio y al final del ensayo. Conviene proceder, por ejemplo cada tres meses si se sabe que el agua de dilución es de calidad relativamente constante, a la determinación de los metales pesados (por ejemplo, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd y Ni), aniones y cationes principales (por ejemplo, Ca²⁺, Mg²⁺, Na⁺, K⁺, Cl^-, y SO₄ ^2-), plaguicidas (por ejemplo, plaguicidas organofosforados totales y organoclorados totales), carbono orgánico total y sólidos en suspensión. Si se demuestra que la calidad del agua de dilución es constante al menos durante un año, las determinaciones pueden ser menos frecuentes y espaciarse más (por ejemplo, cada seis meses).

  El contenido en partículas naturales y el carbono orgánico total del agua de dilución deben ser lo más bajos posible para evitar la adsorción de la sustancia problema a la materia orgánica, que podría reducir su biodisponibilidad y con ello dar lugar a una subestimación del FBC. El valor máximo admisible es de 5 mg/l para las partículas (materia seca que no atraviesa un filtro de 0,45 μm) y de 2 mg/l para el carbono orgánico total (véase el apéndice 2). En caso necesario, el agua de dilución se debe filtrar antes de usarse. La contribución al contenido en carbono orgánico del agua del ensayo que aportan los peces (excrementos) y los residuos alimentarios debe mantenerse lo más baja posible (véase el punto 46).

  Soluciones de ensayo

  Se prepara una solución madre de la sustancia problema, a una concentración adecuada. La solución madre se prepara preferiblemente por simple mezcla o agitación de la sustancia problema en el agua de dilución. Una alternativa que puede resultar apropiada en algunos casos es la utilización de un sistema de dosificación por desorción de una fase sólida. No se recomienda en general el uso de disolventes o dispersantes (agentes solubilizantes) (véase (25)); sin embargo, la utilización de estos materiales puede ser aceptable para obtener una solución madre de concentración adecuada, pero deben hacerse todos los esfuerzos posibles para minimizar el uso de tales materiales y no debe superarse su concentración micelar crítica (si procede). Los disolventes que pueden utilizarse son la acetona, el etanol, el metanol, la dimetil-formamida y el trietilenglicol; los dispersantes que se han utilizado son el Tween 80, la metilcelulosa al 0,01 % y el HCO-40. La concentración de disolvente en el medio de ensayo final debe ser la misma en todos los tratamientos (es decir, con independencia de la concentración de la sustancia problema) y no debe ser superior a los correspondientes umbrales de toxicidad determinados para el disolvente en las condiciones del ensayo. El nivel máximo es una concentración de 100 mg/l (o 0,1 ml/l). Es poco probable que una concentración de disolvente de 100 mg/l altere de manera significativa la máxima concentración disuelta de la sustancia problema que pueda alcanzarse en el medio (25). Debe conocerse la contribución del disolvente, junto con la de la sustancia problema, al contenido global de carbono orgánico en el agua del ensayo. A lo largo del ensayo, la concentración de carbono orgánico total en los recipientes del ensayo no debe sobrepasar en más de 10 mg/l (± 20 %) la del carbono orgánico procedente de la sustancia problema y, en su caso del disolvente o agente de disolución (52) . El contenido de materia orgánica puede afectar significativamente a la cantidad de sustancia problema disuelta libremente durante los ensayos dinámicos con peces, especialmente en el caso de sustancias muy lipófilas. La microextracción en fase sólida (véase el punto 60) puede aportar información importante sobre la relación entre los compuestos disueltos libremente y los ligados, de los que se supone que los primeros representan la fracción biodisponible. La concentración de la sustancia problema debe ser inferior a su límite de solubilidad en los medios de ensayo a pesar de la utilización de un disolvente o agente solubilizante. Deben tomarse precauciones en caso de utilización de disolventes fácilmente biodegradables, ya que estos pueden causar problemas de crecimiento bacteriano en los ensayos dinámicos. Si no es posible preparar una solución madre sin el uso de un agente solubilizante, debe prestarse atención a la adecuación de un estudio de exposición acuática frente a un estudio de exposición alimentaria.

  Para los ensayos dinámicos se necesitará un sistema que aporte y diluya continuamente la solución madre de la sustancia problema (por ejemplo, bomba dosificadora, diluyente proporcional, sistema saturador) o un sistema de dosificación por desorción de una fase sólida, para conseguir las concentraciones requeridas en los recipientes de ensayo. Es preferible permitir al menos cinco renovaciones del volumen al día en cada recipiente de ensayo. Se preferirá el método dinámico, pero en caso de imposibilidad (por ejemplo, cuando los organismos del ensayo sufran efectos adversos) podrá aplicarse una técnica semiestática si siguen cumpliéndose los criterios de validez (véase el punto 24). Los caudales de las soluciones madre y del agua de dilución se controlarán 48 horas antes del ensayo y luego al menos diariamente durante este. Dicho control incluirá la determinación del caudal en cada recipiente de ensayo y garantizará que no varía en más del 20 % dentro de cada recipiente ni entre recipientes distintos.

  Selección de las especies

  Entre los criterios importantes de selección de las especies figuran el que sean de fácil disponibilidad, que puedan obtenerse de los tamaños adecuados y que puedan mantenerse satisfactoriamente en el laboratorio. Otros criterios de selección de las especies de peces son su importancia recreativa, comercial o ecológica, así como una sensibilidad comparable, haber producido buenos resultados anteriormente, etc. Las especies de ensayo recomendadas figuran en el apéndice 3. Pueden utilizarse otras especies, pero es posible entonces tener que adaptar el procedimiento de ensayo para obtener condiciones experimentales convenientes. En tal caso, deben justificarse la elección de la especie y el método experimental. En general, la utilización de especies de peces más pequeños acorta el tiempo necesario para alcanzar el estado de equilibrio, pero puede ser necesario un número superior de peces (muestras) para analizar adecuadamente el contenido lipídico y las concentraciones de la sustancia problema en los peces. Además, es posible que las diferencias en la tasa de respiración y en el metabolismo entre los peces de más edad y los más jóvenes dificulten la comparación de resultados entre diferentes ensayos y especies de ensayo. Cabe señalar que, si los peces utilizados en un ensayo están en una fase de su ciclo vital con crecimiento rápido (juveniles), se puede complicar la interpretación de los datos.

  Preparación de los peces (pertinente para la exposición alimentaria y acuática)

  La población inicial de peces debe aclimatarse durante dos semanas al menos en agua (véase el punto 28) a la temperatura del ensayo y alimentarse con una dieta suficiente (véase el punto 45). Tanto el agua como los alimentos deben ser del mismo tipo que los usados en el ensayo.

  Después de un periodo de adaptación de 48 horas, se registra la mortalidad y se aplican los criterios siguientes:

  • - Mortalidad superior al 10 % de la población en siete días: se rechaza el lote entero;
  • - Mortalidad entre el 5 % y el 10 % de la población en siete días: se aclimata durante otros siete días más; si en este segundo periodo de siete días la mortalidad supera el 5 %, se rechaza todo el lote;
  • - Mortalidad por debajo del 5 % de la población en siete días: se acepta el lote.

  Los peces utilizados en los ensayos deben estar libres de enfermedades ni anomalías observables. Se deben descartar todos los peces enfermos. Los peces no deben recibir tratamiento terapéutico alguno durante el ensayo ni en las dos semanas anteriores al mismo.

  REALIZACIÓN DEL ENSAYO

  Ensayo preliminar

  Puede ser útil proceder a un experimento preliminar para optimizar las condiciones de realización del ensayo definitivo, como, por ejemplo, la concentración o concentraciones de la sustancia problema, o la duración de las fases de absorción y de depuración, o para determinar si es necesario llevar a cabo un ensayo completo. El diseño del ensayo preliminar debe ser tal que se obtenga la información requerida. Se puede considerar si un ensayo minimizado puede ser suficiente para obtener un FBC, o si es necesario un estudio completo (véanse los puntos 83-95 sobre el ensayo minimizado).

  Condiciones de exposición

  Duración de la fase de absorción

  Es posible obtener una previsión de la duración de la fase de absorción a partir de la experiencia práctica (por ejemplo, a partir de un estudio previo o de un estudio de acumulación de una sustancia estructuralmente relacionada) o a partir de ciertas relaciones empíricas utilizando el dato de la hidrosolubilidad o del coeficiente de reparto octanol/agua de la sustancia problema (siempre que la absorción siga una cinética de primer orden, véase el apéndice 5).

  La fase de absorción durará 28 días salvo si puede demostrarse que se alcanza antes el estado de equilibrio (véase el apéndice 1, Definiciones y unidades). Se alcanza el estado de equilibrio en la representación gráfica de la concentración de la sustancia problema en los peces (C _f) en función del tiempo cuando la curva se hace paralela al eje del tiempo y tres análisis sucesivos de C _f realizados con muestras tomadas a intervalos de, al menos, dos días presentan una diferencia máxima del ± 20 % entre sí, y no hay ningún aumento significativo de C _f entre el primero y el último de los análisis sucesivos. Cuando se analizan muestras puestas conjuntamente, es necesario proceder al menos a cuatro análisis sucesivos. Si las sustancias problema se absorben con lentitud, se optará preferiblemente por intervalos semanales. Si no se ha alcanzado el estado de equilibrio en 28 días, el FBC se calcula utilizando únicamente el enfoque cinético, que no depende de que se alcance el estado de equilibrio, o bien puede ampliarse la fase de absorción, con la realización de más mediciones, hasta alcanzar el estado de equilibrio, o durante 60 días, si esto supone un plazo menor. Asimismo, es necesario que la concentración de la sustancia problema en los peces al final de la fase de absorción sea lo bastante alta como para permitir una estimación fiable de k ₂ de la fase de depuración. Si no se consigue una absorción significativa al cabo de 28 días, el ensayo puede detenerse.

  Duración de la fase de depuración

  En el caso de las sustancias que siguen una cinética de primer orden, generalmente es suficiente la mitad de la duración de la fase de absorción para conseguir una reducción conveniente (por ejemplo, del 95 %) de la carga corporal de la sustancia (véanse en el apéndice 5 las explicaciones sobre el cálculo). Si el tiempo necesario para llegar a una pérdida del 95 % es excesivamente largo, sobrepasando por ejemplo dos veces la duración normal de la fase de absorción (es decir, más de 56 días), se podrá utilizar un periodo más corto (p. ej., hasta que la concentración de la sustancia problema sea inferior al 10 % de la concentración en el estado de equilibrio). No obstante, puede ser necesario un periodo de depuración más largo con las sustancias que presentan patrones de absorción y depuración más complejos, que no se ajustan al modelo de peces con un único compartimento, el cual corresponde a una cinética de primer orden. Si se observan o se esperan tales patrones complejos, se recomienda solicitar consejo a un bioestadístico o a un técnico de farmacocinética para garantizar una adecuada configuración del ensayo. Según se amplía el periodo de depuración, el número de peces que ha de muestrearse puede llegar a ser limitante y las diferencias de crecimiento entre los peces pueden influir en los resultados. El periodo será función también del tiempo durante el cual la concentración de la sustancia problema en los peces permanezca por encima del límite analítico de cuantificación.

  Número de peces del ensayo

  El número de peces por concentración del ensayo debe elegirse de modo que se disponga de, como mínimo, cuatro peces por cada punto de muestreo. Solo se deben poner en común los peces si no es factible el análisis de uno solo. Si es preciso conseguir una mayor precisión en el ajuste de la curva (y parámetros derivados) o si se requieren estudios del metabolismo (por ejemplo, para distinguir entre los metabolitos y la sustancia original cuando se utilizan sustancias problema radiomarcadas), será necesario disponer de más peces por punto de muestreo. El contenido lipídico debe determinarse con los mismos materiales biológicos que se utilicen para determinar la concentración de la sustancia problema. Si ello no es posible, podrá ser necesario disponer de más peces (véanse los puntos 56 y 57).

  Si se utilizan peces adultos (es decir, sexualmente maduros), no deben estar en fase de desove ni haberla pasado recientemente (es decir, haber desovado ya) ni antes del ensayo ni durante el mismo. También debe indicarse si en el experimento se utilizan machos o hembras, o los dos sexos. En este último caso, será necesario comprobar (antes del inicio de la exposición) que no hay diferencias significativas de crecimiento y de contenido lipídico entre sexos, en particular si se prevé que va a ser necesario poner en común peces machos y hembras para garantizar que puedan detectarse las concentraciones de la sustancia o el contenido lipídico.

  En cada uno de los ensayos se elegirán peces de peso similar, de modo que el peso del más pequeño no sea inferior a dos tercios del peso del mayor. Pertenecerán a la misma clase de edad y procederán de la misma fuente. Ya que el peso y la edad de un pez pueden tener efectos notables sobre los valores del FBC (12), estos datos se registrarán con exactitud. Se recomienda pesar poco antes del inicio del ensayo una submuestra de la población de peces para calcular el peso medio (véase el punto 61).

  Carga

  Se debe utilizar una relación elevada agua/peces con el fin de minimizar la reducción de la concentración de la sustancia problema en el agua debida a la introducción de los peces al principio del ensayo, y también para evitar el descenso de la concentración de oxígeno disuelto. Es importante que la tasa de carga sea adaptada a la especie utilizada para el ensayo. De todos modos, se recomienda normalmente una tasa de carga peces / agua de 0,1-1,0 g de peces (peso húmedo) por litro de agua al día. Se pueden utilizar tasas de carga más elevadas si se demuestra que la concentración requerida de sustancia problema puede mantenerse en el intervalo del ± 20 %, y que la concentración de oxígeno disuelto no cae por debajo del 60 % del nivel de saturación (véase el punto 24).

  Se tendrá en cuenta el hábitat normal de la especie de peces al elegir la tasa de carga adecuada. Los peces bentónicos, por ejemplo, pueden necesitar un acuario que tenga más superficie de fondo que las especies pelágicas, para un mismo volumen de agua.

  Alimentación

  Durante los periodos de aclimatación y de ensayo, se dará a los peces un alimento conveniente que tenga un contenido conocido en lípidos y proteínas totales, en cantidades suficientes para mantenerlos en buena salud y conservar el peso corporal (se permite cierto crecimiento). Se dará alimento diariamente durante los periodos de aclimatación y de ensayo a una dosis establecida en función de la especie utilizada, de las condiciones experimentales y del valor calorífico del alimento (por ejemplo, en el caso de la trucha arco iris, aproximadamente entre el 1 y el 2 % del peso corporal por día). La dosis alimentaria debe seleccionarse de forma que se evite el crecimiento rápido y el amplio aumento del contenido lipídico. Para mantener la misma dosis alimentaria, debe volver a calcularse la cantidad de alimento según proceda, por ejemplo una vez por semana. Para ese cálculo, el peso de los peces de cada recipiente de ensayo se estima a partir del peso de los peces muestreados más recientemente en ese recipiente. No hay que pesar los peces que permanecen en el recipiente.

  La comida no consumida y los excrementos deben evacuarse de los recipientes de ensayo mediante sifón cada día poco después de la alimentación (de 30 minutos a una hora). Los recipientes se tendrán lo más limpios posible a lo largo del ensayo, de modo que la concentración de materia orgánica permanezca al nivel más bajo posible (véase el punto 29), puesto que la presencia de carbono orgánico puede limitar la biodisponibilidad de la sustancia problema (12).

  Como muchos alimentos son derivados de harinas de pescado, debe garantizarse que el alimento no influye en los resultados del ensayo ni provoca efectos adversos, por ejemplo por contener (restos de) plaguicidas, metales pesados o la propia sustancia problema.

  Luz y temperatura

  Se recomienda un fotoperiodo de 12 a 16 horas y la temperatura (± 2°C) ha de ser adecuada para la especie utilizada (véase el apéndice 3). Deben conocerse el tipo y las características de la iluminación. Es necesario prestar atención a la posible fototransformación de la sustancia problema en las condiciones de irradiación del estudio. Se ha de utilizar una iluminación adecuada que no exponga a los peces a fotoproductos no naturales. En algunos casos, puede ser conveniente utilizar un filtro para eliminar los rayos UV por debajo de 290 nm.

  Concentraciones de ensayo

  El ensayo se concibió inicialmente para las sustancias orgánicas apolares. Para este tipo de sustancias, se prevé que es suficiente la exposición de los peces a una única concentración, dado que no se esperan efectos de concentración, aunque pueden ser necesarias dos concentraciones en virtud del marco normativo pertinente. Si se someten a ensayo sustancias fuera de este ámbito, o se conocen otros datos, como una posible dependencia de la concentración, el ensayo deberá efectuarse con dos o más concentraciones. Si se somete a ensayo una única concentración, deberá justificarse (véase el punto 79). Además, la concentración de ensayo debe ser tan baja como sea técnica o prácticamente posible (es decir, no muy cerca del límite de solubilidad).

  En algunos casos, puede anticiparse que la bioconcentración de una sustancia depende de la concentración en el agua (por ejemplo, en el caso de los metales, cuya absorción en los peces puede estar regulada al menos en parte). En tal caso, es necesario que se estudien al menos dos, pero preferiblemente más, concentraciones (véase el punto 49) que sean pertinentes desde el punto de vista medioambiental. También en el caso de las sustancias cuyas concentraciones de ensayo tienen que encontrarse cerca del límite de solubilidad por razones prácticas, se recomienda utilizar al menos dos concentraciones de ensayo, ya que esto puede dar una idea de la fiabilidad de las concentraciones de la exposición. La elección de las concentraciones de ensayo debe incorporar la concentración ambientalmente realista, así como la concentración que sea pertinente para los fines de la evaluación específica.

  La concentración o concentraciones de la sustancia problema deben seleccionarse por debajo de su nivel de efecto crónico o del 1 % de su LC₅₀ aguda asintótica, dentro de un intervalo relevante para el medio ambiente y, como mínimo, un orden de magnitud por encima de su límite de cuantificación en el agua por el método de análisis elegido. La concentración de ensayo permisible más elevada puede establecerse también dividiendo la LC₅₀ aguda de 96 h por una relación aguda/crónica adecuada (p. ej., las relaciones adecuadas de algunas sustancias están alrededor de tres, pero unas cuantas están por encima de 100). Si se utiliza una segunda concentración, debe diferir de la antes citada en un factor de diez. Cuando esto no sea posible por el criterio de toxicidad (que limita la concentración de ensayo superior) y por el límite analítico (que limita la concentración de ensayo inferior), puede utilizarse un factor inferior a diez y debe considerarse el empleo de una sustancia problema radiomarcada (del nivel más alto de pureza; por ejemplo, preferiblemente > 98 %). Debe velarse por que no se utilice ninguna concentración que quede por encima del límite de solubilidad de la sustancia problema en los medios de ensayo.

  Testigos

  Además de las series de ensayo, debe estudiarse un testigo del agua de dilución o, en su caso (véanse los puntos 30 y 31), un testigo del disolvente.

  Frecuencia de la medición de la calidad del agua

  Durante el ensayo se medirán en todos los recipientes de ensayo y de testigo el oxígeno disuelto, el COT, el pH y la temperatura. En el testigo o testigos y en un recipiente de ensayo se medirán la dureza total y la salinidad (cuando proceda). Si se someten a ensayo dos o más concentraciones, estos parámetros se medirán a la concentración más elevada. Por lo menos, el oxígeno disuelto y la salinidad (cuando proceda) se medirán tres veces -al principio, hacia el medio y al final de la fase de absorción- y una vez por semana durante la fase de depuración. El COT se medirá al principio del ensayo (24 y 48 horas antes del comienzo de la fase de absorción), antes de la adición de los peces y al menos una vez por semana durante las fases de absorción y de depuración. La temperatura se medirá y registrará diariamente, el pH al principio y al final de cada periodo y la dureza una vez en cada ensayo. La temperatura se medirá preferiblemente de forma continua en un recipiente al menos.

  Muestreo y análisis de los peces y del agua

  Pauta de muestreo de los peces y del agua

  Se tomará agua de los recipientes de ensayo para determinar la concentración de la sustancia problema antes de la introducción de los peces y durante las fases de absorción y de depuración. Deben tomarse muestras de agua antes de añadir el alimento, al mismo tiempo que se muestrean los peces. Puede ser útil aumentar la frecuencia de muestreo para garantizar la estabilidad de las concentraciones tras la introducción de los peces. Durante la fase de absorción, deben determinarse las concentraciones de la sustancia problema a fin de comprobar el cumplimiento de los criterios de validez (punto 24). Si los análisis de las muestras de agua al inicio de la fase de depuración ponen de manifiesto que no se detecta la sustancia problema, puede utilizarse este hecho como justificación para no medir la sustancia problema en el agua de ensayo y de los testigos durante el resto de la fase de depuración.

  Se deben muestrear los peces en al menos cinco ocasiones durante la fase de absorción y en al menos cuatro ocasiones durante la fase de depuración para determinar su contenido de sustancia problema. Como a veces es difícil calcular una estimación razonablemente precisa del FBC a partir de este número de muestras, en particular cuando la cinética de absorción y depuración no es la simple de primer orden, puede ser recomendable muestrear con mayor frecuencia en los dos periodos (véase el apéndice 4).

  El contenido lipídico debe establecerse con los mismos materiales biológicos que se utilicen para determinar la concentración de la sustancia problema, como mínimo al inicio y al final de la fase de absorción y al final de la fase de depuración. Si ello no es posible, deben muestrearse al menos tres peces independientes para determinar su contenido lipídico en cada uno de esos tres tiempos. El número de peces por recipiente al inicio del experimento debe ajustarse en consecuencia (53) . De forma alternativa, en caso de que no se detecten cantidades significativas de la sustancia problema en los peces testigo (es decir, peces de la población inicial), los peces testigo tomados del ensayo pueden analizarse para determinar solo el contenido lipídico, y el análisis de la sustancia problema en el grupo o grupos de ensayo (y la constante de la velocidad de absorción, la constante de la velocidad de depuración y los valores del FBC relacionados) pueden corregirse para tener en cuenta el contenido lipídico del grupo testigo durante el ensayo (54) .

  Los peces muertos o enfermos no deben analizarse en cuanto a la concentración de la sustancia problema ni la de los lípidos.

  En el apéndice 4 se encuentra un ejemplo de pauta de muestreo aceptable. Pueden establecerse otras pautas fácilmente sobre la base de otros valores supuestos de K _OW para calcular el tiempo de exposición que corresponde a una absorción del 95 % (véanse los cálculos en el apéndice 5).

  Debe continuarse el muestreo durante la fase de absorción hasta que se alcance el estado de equilibrio (véase el apéndice 1, Definiciones y unidades) o se dé por terminada de otra manera la fase de absorción (después de 28 o 60 días, véanse los puntos 37 y 38). Antes de empezar la fase de depuración, los peces deben transferirse a recipientes limpios.

  Muestreo y preparación de las muestras

  Deben tomarse muestras de agua para su análisis, por ejemplo mediante sifonado a través de un tubo inerte desde un punto central del recipiente de ensayo. Ni la filtración ni la centrifugación permiten siempre separar la fracción no biodisponible de la sustancia problema respecto a su fracción biodisponible. En caso de que se aplique una técnica de separación, debe facilitarse siempre en el informe de ensayo una justificación o una validación de la técnica aplicada, dadas las dificultades de biodisponibilidad (25). Especialmente en el caso de las sustancias muy hidrófobas (es decir, sustancias con log K _OW > 5) (12) (26), que podrían adsorberse a la matriz de filtración o a los recipientes de centrifugación, no deben someterse las muestras a estos tratamientos. En lugar de ello, se deben adoptar medidas para que los recipientes se mantengan lo más limpios posible (véase el punto 46) y debe supervisarse el contenido en carbono orgánico total a lo largo de las fases tanto de absorción como de depuración (véase el punto 53). Para evitar posibles problemas de biodisponibilidad reducida, puede recurrirse al muestreo con técnicas de microextracción en fase sólida en caso de sustancias poco solubles y muy hidrófobas.

  Los peces muestreados deben sacrificarse inmediatamente, de la manera más adecuada e incruenta posible (para las mediciones de los peces enteros, no deben aplicarse más tratamientos que el lavado con agua (véase el punto 28) y el secado con un pañuelo). Se pesan y se mide la longitud total (55) . Respecto a cada pez, deben relacionarse el peso y la longitud medidos con la concentración de la sustancia analizada (y el contenido lipídico, si procede), por ejemplo utilizando un código único de identificación para cada pez muestreado.

  Es preferible analizar los peces y el agua inmediatamente después del muestreo para evitar toda degradación u otras pérdidas y para calcular aproximadamente las constantes de las velocidades de absorción y de depuración mientras continúa el ensayo. El análisis inmediato evita también retrasos en la determinación del momento en que se alcanza una meseta (estado de equilibrio).

  Si no se hace el análisis inmediatamente, las muestras deben conservarse según un método conveniente. Antes del principio del estudio, debe conseguirse información sobre el método de conservación adecuado para la sustancia problema correspondiente como, por ejemplo, congelación, mantenimiento a 4 °C, extracción, etc. El periodo de almacenamiento debe seleccionarse para garantizar que la sustancia no se degrade mientras esté almacenada.

  Calidad del método analítico

  Como la totalidad del procedimiento se rige principalmente por la exactitud, la precisión y la sensibilidad del método analítico utilizado para la sustancia problema, es necesario comprobar experimentalmente que la exactitud, la precisión y la reproducibilidad del análisis de la sustancia, así como la recuperación de la sustancia problema tanto del agua como de los peces, son satisfactorias con el método particular utilizado. Esto debe formar parte de los ensayos previos. Ha de comprobarse también que la sustancia problema no es detectable en el agua de dilución utilizada. En caso necesario, se corrigen los valores de la concentración de la sustancia problema en el agua y en los peces obtenidos de los ensayos para tener en cuenta las recuperaciones y los valores de fondo de los testigos. Las muestras de peces y de agua se deben manipular en todo momento de forma que se minimicen las contaminaciones y las pérdidas (derivadas, por ejemplo, de la adsorción al equipo de muestreo).

  Análisis de las muestras de peces

  Si se utilizan para el ensayo materiales radiomarcados, se puede analizar el marcador radiactivo total (es decir, sustancia original y metabolitos) o se pueden purificar las muestras de modo que sea posible analizar separadamente la sustancia original. Si el FBC se va a basar en la sustancia original, deben caracterizarse los principales metabolitos, como mínimo al final de la fase de absorción (véase el punto 6). Los principales metabolitos serán los que representen ≥ 10 % de los residuos totales en los tejidos de los peces, los que representen ≥ 5 % en dos puntos consecutivos de muestreo, los que muestren un aumento de los niveles a lo largo de toda la fase de absorción, y los de importancia toxicológica conocida. Si el FBC para el pez entero en términos de residuos radiomarcados totales es ≥ 500, puede ser conveniente (y, para algunas categorías de sustancias como los plaguicidas, muy recomendable), identificar y cuantificar los principales metabolitos. La cuantificación de tales metabolitos puede estar impuesta por algunas autoridades normativas. Si se identifican y cuantifican metabolitos que representan ≥ 10 % de los residuos radiomarcados totales en los tejidos de los peces, se recomienda entonces identificar y cuantificar los metabolitos también en el agua del ensayo. En caso de que esto no sea posible, deberá explicarse en el informe.

  La concentración de la sustancia problema debe determinarse generalmente en cada pez pesado aparte. Si esto no es posible, se podrán poner conjuntamente las muestras de cada momento de muestreo, pero esta mezcla limita los procedimientos estadísticos que pueden aplicarse a los datos, por lo que debe incluirse en el ensayo un número adecuado de peces para conciliar la puesta en común con el procedimiento y la potencia estadísticos deseados. Las referencias (27) y (28) pueden utilizarse como introducción a los procedimientos pertinentes de puesta en común.

  El FBC debe expresarse normalizado en referencia a peces con un 5 % de contenido lipídico (sobre la base del peso húmedo), además del valor derivado directamente del estudio (véase el punto 21), a menos que pueda justificarse que la sustancia problema no se acumula principalmente en los lípidos. El contenido lipídico de los peces debe determinarse si es posible en cada momento de muestreo, preferiblemente con el mismo extracto que el consagrado al análisis de la sustancia problema, puesto que a menudo los lípidos deben retirarse del extracto antes de que este se pueda analizar por cromatografía. Sin embargo, el análisis de las sustancias problema exige con frecuencia procedimientos de extracción específicos que pueden estar en contradicción con los métodos de ensayo para la determinación de los lípidos. En este caso (hasta que se disponga de métodos instrumentales adecuados no destructivos), se recomienda emplear una estrategia diferente para determinar el contenido lipídico de los peces (véase el punto 56). Deben utilizarse métodos adecuados para la determinación del contenido lipídico (20). La técnica de extracción con cloroformo/metanol (29) puede recomendarse como método normal (30), pero se recomienda como alternativa técnica el método de Smedes (31). Este último método se caracteriza por una eficiencia comparable de extracción, una alta exactitud, el uso de disolventes orgánicos menos tóxicos y la facilidad de ejecución. Pueden utilizarse, en casos debidamente justificados, otros métodos que presenten alguna ventaja en términos de exactitud respecto a los métodos recomendados. Es importante precisar bien el método utilizado.

  Medición del crecimiento de los peces

  Al comienzo del ensayo, deben pesarse por separado de cinco a diez peces de la población inicial, y debe medirse su longitud total. Puede tratarse de los mismos peces utilizados para el análisis de lípidos (véase el punto 56). El peso y la longitud de los peces utilizados para cada toma de muestras de los grupos tanto de ensayo como testigo deben medirse antes de proceder al análisis del producto o de los lípidos. Las mediciones de estos peces muestreados se pueden utilizar para estimar el peso y la longitud de los peces que quedan en los recipientes de ensayo y de testigo (véase el punto 45).

  DATOS E INFORME

  Tratamiento de los resultados

  La curva de absorción de la sustancia problema debe obtenerse representando su concentración en los peces (interior o superficie, o tejidos específicos) durante la fase de absorción en función del tiempo, con escala aritmética. Si la curva alcanza una meseta, es decir, adopta aproximadamente una disposición asintótica respecto al eje del tiempo, se calculará del siguiente modo el FBC en el estado de equilibrio (FBC_SS):

  

  La evolución de C _f puede verse influida por el crecimiento de los peces (véanse los puntos 72 y 73). La concentración de exposición media (C_w) se ve influida por las variaciones a lo largo del tiempo. Cabe esperar que una concentración media ponderada en función del tiempo sea más pertinente y precisa para los estudios de bioacumulación, incluso aunque la variación se encuentre en el intervalo adecuado de validez (véase el punto 24). La concentración en el agua media ponderada en función del tiempo puede calcularse de conformidad con el apéndice 5, sección 1.

  El factor de bioconcentración cinético (FBC_K) debe determinarse como la relación k ₁/k ₂, que son las dos constantes de velocidad de primer orden. Las constantes de velocidad k ₁ y k ₂ y el FBC_K pueden obtenerse ajustando simultáneamente la fase de absorción y la fase de depuración. Otra posibilidad consiste en determinar secuencialmente k ₁ y k ₂ (véase en el apéndice 5 una descripción y comparación de estos métodos). Es posible tener que corregir la constante de la velocidad de depuración (k ₂) para tener en cuenta la dilución por el crecimiento (véanse los puntos 72 y 73). Si resulta evidente que la curva de absorción o de depuración no es de primer orden, entonces convendrá utilizar modelos más complejos (véanse las referencias en el apéndice 5) y buscar el consejo de un bioestadístico o de un técnico de farmacocinética.

  Datos de peso/longitud de los peces

  Los pesos húmedos y longitudes totales de cada uno de los peces en todos los intervalos de muestreo se tabulan por separado para los grupos de ensayo y testigo durante las fases de absorción (incluida la población inicial para el comienzo de la absorción) y de depuración. Respecto a cada pez, deben relacionarse el peso y la longitud medidos con la concentración del producto analizado, por ejemplo utilizando un código único de identificación para cada pez muestreado. El peso es la medida preferida del crecimiento a efectos de la corrección de los valores del FBC cinético para tener en cuenta la dilución por el crecimiento (véase, en el punto 73 y en el apéndice 5, el método utilizado para corregir los datos en función de esta dilución por el crecimiento).

  Corrección en función de la dilución por el crecimiento y normalización lipídica

  El crecimiento de los peces durante la fase de depuración puede reducir las concentraciones medidas del producto en los peces, con el resultado de que la constante de la velocidad de depuración general (k ₂) sea mayor que la que se derivaría únicamente de los procesos de eliminación (por ejemplo, respiración, metabolismo, excreción). Los factores de bioconcentración cinéticos deben corregirse para tener en cuenta la dilución por el crecimiento. Los FBC_SS también se verá influidos por el crecimiento, pero no se dispone de ningún procedimiento acordado para corregir los FBC_SS en función del crecimiento. En los casos de crecimiento significativo, también deben calcularse los FBC_K, corregidos en función del crecimiento (FBC_Kg), ya que pueden ser una medida más pertinente del factor de bioconcentración. El contenido lipídico de los peces del ensayo (que está estrechamente relacionado con la bioacumulación de las sustancias hidrófobas) puede variar en la práctica tanto que haga necesario proceder a la normalización respecto a un contenido lipídico de los peces fijo (5 % p/p) para presentar los factores de bioconcentración, tanto el cinético como el del estado de equilibrio, de modo que tengan sentido, a menos que pueda justificarse que la sustancia problema no se acumula principalmente en los lípidos (por ejemplo, algunas sustancias perfluoradas pueden unirse a las proteínas). Las ecuaciones y ejemplos de estos cálculos figuran en el apéndice 5.

  Para corregir un FBC cinético para tener en cuenta la dilución debida al crecimiento, la constante de la velocidad de depuración debe corregirse para tener en cuenta el crecimiento. Esta constante de la velocidad de depuración corregida según el crecimiento (k _2g) se calcula restando la constante de la velocidad de crecimiento (k _g, obtenida directamente de los datos de pesos medidos) de la constante de la velocidad de depuración general (k ₂). A continuación se obtiene el factor de bioconcentración cinético corregido en función del crecimiento dividiendo la constante de la velocidad de absorción (k ₁) por la constante de la velocidad de deputación corregida según el crecimiento (k _2g) (véase el apéndice 5). En algunos casos es difícil aplicar este enfoque. Por ejemplo, en el caso de sustancias de depuración muy lenta que se estudien con peces de rápido crecimiento, la constante obtenida k _2g puede ser muy pequeña, con lo que el error en las dos constantes de velocidad utilizadas para calcularla reviste una importancia crítica, y en algunos casos las estimaciones de k _g pueden ser mayores que k ₂. Un enfoque alternativo que elude la necesidad de corregir según la dilución debida al crecimiento implica la utilización de datos de depuración de masa de sustancia problema por pez (peces enteros) en lugar de los habituales datos de masa de sustancia problema por unidad de masa de peces (concentración). Esto puede conseguirse fácilmente, ya que los ensayos según el presente método deben vincular las concentraciones tisulares registradas con los pesos de cada pez. El sencillo procedimiento correspondiente se describe en el apéndice 5. Obsérvese que sigue siendo necesario comunicar el valor de k ₂ aunque se utilice este enfoque alternativo.

  Los factores de bioconcentración cinético y en estado de equilibrio deben consignarse también en relación con un contenido lipídico de los peces de referencia, del 5 % (p/p), salvo que pueda justificarse que la sustancia problema no se acumula principalmente en los lípidos. Los datos de concentración en peces, o el FBC, se normalizan con arreglo a la relación entre el 5 % y la media real (individual) del contenido lipídico (en % de peso húmedo) (véase el apéndice 5).

  Si los análisis del producto y de los lípidos se realizan con un mismo pez, entonces, para calcular un FBC normalizado según el contenido lipídico, deben utilizarse los datos normalizados según el contenido lipídico de cada pez. Por otra parte, si es similar el crecimiento de los peces testigo y el de los expuestos al producto, el contenido lipídico de los peces testigo solos podrá utilizarse para la corrección según el contenido lipídico (véase el punto 56). En el apéndice 5 se describe un método de cálculo del FBC normalizado según el contenido lipídico.

  Interpretación de los resultados

  Los resultados se interpretarán con precaución cuando las concentraciones medidas de las soluciones de ensayo se encuentren a niveles cercanos al límite de detección del método de análisis.

  El crecimiento medio tanto en los grupos de ensayo como en los testigos no debe ser, en principio, significativamente diferente, a fin de excluir los efectos tóxicos. Las constantes de la velocidad de crecimiento o las curvas de crecimiento de los dos grupos deben compararse siguiendo un procedimiento adecuado (56) .

  La claridad de definición de las curvas de absorción y de depuración indica la buena calidad de los datos de bioconcentración. Para las constantes de velocidad, el resultado de una prueba χ² de la bondad del ajuste debe mostrar un buen ajuste (es decir, un pequeño porcentaje de error en la medición (32)) para el modelo de bioacumulación, de forma que las constantes de velocidad puedan considerarse fiables (véase el apéndice 5). Si se utiliza más de una concentración de ensayo, la variación de las constantes de absorción/depuración entre las concentraciones de ensayo debe ser inferior al 20 % (57) . En caso contrario, podría indicarse la dependencia de la concentración. Se registrarán y, si es posible, se explicarán las diferencias notables que se observen en las constantes de la velocidad de absorción/depuración entre las concentraciones de ensayo aplicadas. En general, el límite de confianza del 95 % de los FBC obtenidos de estudios bien diseñados se acerca al ± 20 % del FBC derivado.

  Si se someten a ensayo dos o más concentraciones, los resultados de todas las concentraciones se utilizarán para determinar si los resultados son coherentes y para mostrar si existe dependencia de la concentración. Si se somete a ensayo una sola concentración para reducir la utilización de animales o de recursos, debe darse la justificación correspondiente.

  El FBC_SS resultante es dudoso si el FBC_K es considerablemente mayor que el FBC_SS, ya que esto puede ser un indicio de que no se ha alcanzado el estado de equilibrio o de que no se han tenido en cuenta los eventuales procesos de pérdida y de dilución por el crecimiento. En los casos en que el FBC_SS está muy por encima del FBC_K, deberá comprobarse si no se han cometido errores en la obtención de las constantes de velocidad de absorción y de depuración y se evaluarán de nuevo. Un procedimiento diferente de ajuste podría mejorar la estimación de FBC_K (véase el apéndice 5).

  Informe del ensayo

  Aparte de la información sobre la sustancia problema indicada en el punto 3, el informe del ensayo incluirá la información siguiente:

  • Sustancia problema:
    
    Naturaleza física y, en su caso, propiedades fisicoquímicas;
    • - Datos de identificación química, como nombre IUPAC o CAS, número CAS, código SMILES o InChI, fórmula estructural, pureza, identidad química de las impurezas según convenga y sea factible en la práctica, etc. (incluido el contenido de carbono orgánico, si procede).
    • - Para las sustancias de componentes múltiples y UVCB (sustancias de composición desconocida o variable, productos complejos de reacción o materiales biológicos) descripción, en la medida de lo posible, de la identidad química de los componentes individuales y, para cada uno de ellos, de su porcentaje de la masa total de la sustancia. Debe resumirse cómo el método de análisis utilizado en el ensayo refleja una medida de la concentración de la sustancia; deben describirse todos los procedimientos analíticos, con inclusión de la exactitud, límite de detección y límite de cuantificación del método.
    • - En caso de marcado radiactivo, posición precisa del átomo o átomos marcados y porcentaje de radiactividad asociada a las impurezas.
    • - Información sobre la toxicidad de la sustancia problema para los peces (idealmente para la especie de ensayo). La toxicidad debe indicarse como una LC₅₀ aguda tras 96 horas y las concentraciones NOAEC y LOAEC a partir de un estudio crónico (es decir, un ensayo en las primeras fases de vida o un ensayo sobre el ciclo de vida completo, si está disponible).
    • - Las condiciones de almacenamiento de la sustancia problema o del producto problema y la estabilidad de esta sustancia o producto en las condiciones de almacenamiento, en caso de que se almacenen antes de su utilización.
  • Especie de ensayo:
    
    Denominación científica, cepa, fuente, eventuales tratamientos previos, aclimatación, edad, sexo (si procede), rango de tamaños (peso y longitud), etc.
  • Condiciones del ensayo:
    • - Procedimiento de ensayo seguido (por ejemplo, dinámico o semiestático); estudio normal o diseño minimizado (incluida la justificación).
    • - Tipo y características de la iluminación y del fotoperiodo o fotoperiodos utilizados.
    • - Diseño del ensayo (por ejemplo, número y tamaño de los recipientes de ensayo, tasa de renovación del volumen de agua, tasa de carga, numero de réplicas, número de peces por réplica, número de concentraciones de ensayo, duración de las fases de absorción y depuración, frecuencia de los muestreos de peces y de agua).
    • - Método de preparación de las soluciones madre y frecuencia de su renovación (deben indicarse el disolvente, su concentración y su contribución al contenido de carbono orgánico del agua del ensayo, en su caso) o una descripción del sistema de dosificación alternativo.
    • - Las concentraciones de ensayo nominales, las medias de los valores medidos y sus desviaciones típicas en los recipientes de ensayo y su método y frecuencia de obtención.
    • - Fuente del agua de dilución, descripción de los eventuales tratamientos previos, resultados de las posibles demostraciones de la aptitud de los peces utilizados para vivir en esta agua y características de esta: pH, dureza, temperatura, concentración de oxígeno disuelto, contenido de cloro residual (si se mide), carbono orgánico total, sólidos en suspensión, salinidad del medio de ensayo (en su caso) y cualquier otra medición realizada.
    • - Calidad del agua en los recipientes de ensayo, pH, dureza, COT, temperatura y concentración de oxígeno disuelto; métodos utilizados y frecuencia de las mediciones.
    • - Información precisa sobre la alimentación (por ejemplo, tipo de alimento o alimentos, fuente, composición -al menos contenido lipídico y en proteínas si es posible-, dosis alimentaria seleccionada, cantidad dada y frecuencia).
    • - Información sobre el tratamiento de las muestras de peces y de agua, incluidos datos de preparación, almacenamiento, extracción y procedimientos (con su precisión) del análisis de la sustancia problema y del contenido lipídico.
    • - Métodos utilizados para la aleatorización de los tratamientos y la asignación de los peces a los recipientes de ensayo.
    • - Fecha de introducción de los organismos de ensayo en las soluciones de ensayo y duración del ensayo.
    • - Descripción y resultados de los ensayos de determinación del intervalo, si se dispone de ellos.
  • Resultados:
    • - Resultados de los eventuales estudios preliminares efectuados.
    • - Mortalidad de los peces testigo y de los peces de cada recipiente de exposición y eventuales comportamientos anormales observados.
    • - Información sobre los eventuales efectos adversos observados.