ANEXO

Los anexos del Reglamento de Ejecuci髇 (UE) 2016/1240 se modifican como sigue:

• 1) El anexo IV queda modificado como sigue:
  • a) en la parte I, punto 2, el p醨rafo segundo se sustituye por el texto siguiente:

    � Cada muestra debe evaluarse por separado. No se permite repetir la toma de muestra ni la evaluaci髇.�

    
  • b) se inserta la siguiente parte I bis:

    � PARTE I bis M閠odos de an醠isis de la mantequilla sin salar para la intervenci髇 p鷅lica

    Par醡etro	M閠odo
    Grasa (5)	ISO 17189 o ISO 3727 parte 3
    Agua	ISO 3727 parte 1
    S髄idos no grasos	ISO 3727 parte 2
    羉idos grasos	ISO 1740
    蚽dice de per髕idos	ISO 3976
    Grasa no l醕tea	ISO 17678
    Caracter韘ticas organol閜ticas	ISO 22935 partes 2 y 3 y tabla de valoraci髇 siguiente

    Tabla de valoraci髇

    Aspecto		Consistencia		Olor y sabor
    Puntos	Comentarios	Puntos	Comentarios	Puntos	Comentarios
    5	Muy bueno Tipo ideal Calidad sobresaliente (uniformemente seca)	5	Muy buena Tipo ideal Calidad sobresaliente (uniformemente untable)	5	Muy buenos Tipo ideal Calidad sobresaliente (olor absolutamente puro y agradable)
    4	Bueno (sin defectos evidentes)	4	Buena (sin defectos evidentes)	4	Bueno (sin defectos evidentes)
    1, 2 o 3	Cualquier defecto	1, 2 o 3	Cualquier defecto	1, 2 o 3	Cualquier defecto�

    
• 2) En el anexo V, se inserta la siguiente parte I bis:

  玃ARTE I bis

  M閠odos de an醠isis de la leche desnatada en polvo para la intervenci髇 p鷅lica

  Par醡etro	M閠odo
  Prote韓as	ISO 8968 parte 1
  Grasa	ISO 1736
  Agua	ISO 5537
  Acidez	ISO 6091
  Lactatos	ISO 8069
  Prueba de la fosfatasa	ISO 11816 parte 1
  蚽dice de insolubilidad	ISO 8156
  Part韈ulas quemadas (6)	ADPI
  Microorganismos	ISO 4833 parte 1
  Suero de mantequilla	Ap閚dice I
  Suero de cuajo (7)	Ap閚dices II y III
  Suero 醕ido (8)	ISO 8069 o inspecciones sobre el terreno
  Controles organol閜ticos (9)	ISO 22935 partes 2 y 3

  Ap閚dice I
  
  LECHE DESNATADA EN POLVO: DETERMINACI覰 DEL CONTENIDO DE FOSFATIDILSERINA Y DE FOSFATIDILETANOLAMINA

  M閠odo: HPLC en fase inversa

  1. OBJETO Y 罬BITO DE APLICACI覰

  El presente m閠odo describe un procedimiento de determinaci髇 del contenido de fosfatidilserina (FS) y fosfatidiletanolamina (FE) de la leche desnatada en polvo (LDP) y permite detectar en ella la presencia de s髄idos de suero de mantequilla.

  2. DEFINICI覰

  Contenido de FS + FE: porcentaje en de masa de la substancia determinada mediante la aplicaci髇 del presente procedimiento. El resultado se expresa en miligramos de dipalmitoil-fosfatidiletanolamina- (DPFE) por 100 g de leche en polvo.

  3. PRINCIPIO DEL M蒚ODO

  Extracci髇 de los aminofosfol韕idos, por medio de metanol, de la leche en polvo reconstituida. Determinaci髇 del contenido de FS y FE en forma de derivados de o-Ftaldialdeh韉o (OFA) mediante HPLC en fase inversa y detecci髇 por fluorescencia. Determinaci髇 del contenido de FS y FE en la muestra problema por referencia a una muestra patr髇 que contiene una cantidad conocida de DPEF.

  4. REACTIVOS

  Todos los reactivos deben ser de pureza anal韙ica reconocida. El agua utilizada debe ser agua destilada o de pureza al menos equivalente, salvo que se indique lo contrario.

  4.1. Material de referencia: DPEF de una pureza m韓ima del 99 %

  Nota: el material de referencia deber� almacenarse a - 18 癈.

  4.2. Reactivos para la preparaci髇 de la muestra patr髇 y de la muestra problema

  • 4.2.1. Metanol de grado HPLC
  • 4.2.2. Cloroformo de grado HPLC
  • 4.2.3. Monoclorhidrato de triptamina

  4.3. Reactivos para la obtenci髇 del derivado de o-ftaldialdeh韉o

  • 4.3.1. Hidr髕ido de sodio, soluci髇 acuosa 12 M
  • 4.3.2. 羉ido b髍ico, soluci髇 acuosa 0,4 M, ajustada a pH 10,0 por medio de hidr髕ido de sodio (4.3.1)
  • 4.3.3. 2-Mercaptoetanol
  • 4.3.4. o-Ftaldialdeh韉o (OFA)

  4.4. Disolventes de eluci髇 de HPLC

  • 4.4.1. Los disolventes de eluci髇 deber醤 prepararse con reactivos de grado HPLC
  • 4.4.2. Agua de grado HPLC
  • 4.4.3. Metanol de pureza fluorim閠rica comprobada
  • 4.4.4. Tetrahidrofurano
  • 4.4.5. Fosfato de sodio y dihidr骻eno
  • 4.4.6. Acetato s骴ico
  • 4.4.7. 羉ido ac閠ico

  5. INSTRUMENTAL

  • 5.1. Balanza anal韙ica, capaz de pesar con una precisi髇 de 1 mg y con una legibilidad de 0,1 mg.
  • 5.2. Vasos de precipitados de 25 y 100 ml de capacidad
  • 5.3. Pipetas que permitan medir entre 1 y 10 ml
  • 5.4. Agitador magn閠ico
  • 5.5. Pipetas graduadas que permitan medir 0,2, 0,5 y 5 ml
  • 5.6. Matraces aforados de 10, 50 y 100 ml de capacidad
  • 5.7. Jeringas de 20 y 100 μl de capacidad
  • 5.8. Ba駉 ultras髇ico
  • 5.9. Centrifugadora que funcione a 27 000 g
  • 5.10. Frascos de vidrio de unos 5 ml de capacidad
  • 5.11. Probeta de 25 ml de capacidad
  • 5.12. pH-metro, con una precisi髇 de 0,1 unidades de pH
  • 5.13. Equipo HPLC
    • 5.13.1. Sistema de bombeo de gradiente capaz de funcionar a raz髇 de 1,0 ml/min a 200 bar
    • 5.13.2. Automuestreador con capacidad para formar derivados
    • 5.13.3. Calentador de columna, capaz de mantenerla a 30 癈 � 1 癈
    • 5.13.4. Detector de fluorescencia capaz de funcionar con una longitud de onda de excitaci髇 de 330 nm y una longitud de onda de emisi髇 de 440 nm
    • 5.13.5. Integrador o programa de tratamiento de datos capaz de medir el 醨ea de los picos
    • 5.13.6. Columna de LiChrospher� - 100 (250 � 4,6 mm) o una columna equivalente rellena de octadecilsilano (C 18) con una granulometr韆 de 5 μm

  6. MUESTREO

  El muestreo deber� realizarse con arreglo a la norma ISO 707.

  7. PROCEDIMIENTO

  7.1. Preparaci髇 de la soluci髇 de patr髇 interno

  7.1.1. Se pesan 30,0 � 0,1 mg de monoclorhidrato de triptamina (4.2.3) en un matraz aforado de 100 ml (5.6) y se enrasa con metanol (4.2.1).

  7.1.2. Se pasa con la pipeta (5.3) 1 ml de esta soluci髇 a un matraz aforado de 10 ml (5.6) y se enrasa con metanol (4.2.1) con el fin de obtener una soluci髇 de triptamina 0,15 mM.

  7.2. Preparaci髇 de la soluci髇 de muestra problema

  7.2.1. Se pesa 1,000 � 0,001 g de la muestra problema de LDP en un vaso de precipitados de 25 ml (5.2). Se a馻den 10 ml de agua destilada a 40 癈 � 1 癈 con una pipeta (5.3) y se agita con el agitador magn閠ico (5.4) durante 30 minutos para disolver los grumos.

  7.2.2. Se pasan con la pipeta (5.5) 0,2 ml de la leche reconstituida a un matraz aforado de 10 ml (5.6), se a馻den 100 μl de soluci髇 de triptamina 0,15 mM (7.1) con una jeringa (5.7) y se enrasa con metanol (4.2.1). Se mezcla cuidadosamente por inversi髇 y se somete a ultrasonidos (5.8) durante 15 minutos.

  7.2.3. Se centrifuga (5.9) a 27 000 g durante 10 minutos y se recoge la soluci髇 sobrenadante en un frasco de vidrio (5.10).

  Nota: la soluci髇 de muestra problema debe almacenarse a 4 癈 hasta que se proceda al an醠isis por HPLC.

  7.3. Preparaci髇 de la soluci髇 de patr髇 externo

  7.3.1. Se pesan 55,4 mg de DPEF (4.1) en un matraz aforado de 50 ml (5.6) y se a馻den unos 25 ml de cloroformo (4.2.2) con una probeta (5.11). Se calienta el matraz con tap髇 a 50 癈 � 1 癈 y se mezcla a fondo hasta que se disuelva el DPEF. Se enfr韆 el matraz hasta 20 癈, se enrasa con metanol (4.2.1) y se mezcla por inversi髇.

  7.3.2. Se pasa con pipeta (5.3) 1 ml de esta soluci髇 a un matraz aforado de 100 ml (5.6) y se enrasa con metanol (4.2.1). Se pasa con pipeta (5.3) 1 ml de esta soluci髇 a un matraz aforado de 10 ml (5.6), se a馻den con una jeringa (5.7) 100 μl de soluci髇 de triptamina 0,15 mM (7.1) y se enrasa con metanol (4.2.1). Se mezcla por inversi髇.

  Nota: la soluci髇 de la muestra de referencia debe almacenarse a 4 癈 hasta que se proceda al an醠isis por HPLC.

  7.4. Preparaci髇 del reactivo de derivaci髇

  Se pesan 25,0 � 0,1 mg de OFA (4.3.4) en un matraz aforado de 10 ml (5.6), se a馻den con una pipeta graduada (5.5) 0,5 ml de metanol (4.2.1) y se mezcla bien hasta disolver el OFA. Se enrasa con la soluci髇 de 醕ido b髍ico (4.3.2) y se a馻den 20 μl de 2-mercaptoetanol (4.3.3) con una jeringa (5.7).

  Nota: el reactivo de derivaci髇 debe conservarse a 4 癈 en un frasco de vidrio topacio; permanece estable durante una semana.

  7.5. Determinaci髇 mediante HPLC

  7.5.1. Disolventes de eluci髇 (4.4)

  Disolvente A: soluci髇 de fosfato de sodio y dihidr骻eno 0,3 mM y de acetato de sodio 3 mM (ajustada a un pH de 6,5 � 0,1 por medio de 醕ido ac閠ico): metanol: tetrahidrofurano en una proporci髇 de 558:440:2 (v/v/v)

  Disolvente B: metanol

  7.5.2. Gradiente de eluci髇 preconizado:

  Tiempo (min)	Disolvente A (%)	Disolvente B (%)	Caudal (ml/min)
  Inicial	40	60	0
  0,1	40	60	0,1
  5,0	40	60	0,1
  6,0	40	60	1,0
  6,5	40	60	1,0
  9,0	36	64	1,0
  10,0	20	80	1,0
  11,5	16	84	1,0
  12,0	16	84	1,0
  16,0	10	90	1,0
  19,0	0	100	1,0
  20,0	0	100	1,0
  21,0	40	60	1,0
  29,0	40	60	1,0
  30,0	40	60	0

  Nota: el gradiente de eluci髇 podr� requerir una ligera modificaci髇 con vistas a la obtenci髇 de la resoluci髇 indicada en la figura 1.

  Temperatura de la columna: 30 癈

  7.5.3. Volumen de inyecci髇: 50 μl de reactivo de derivaci髇 y 50 μl de soluci髇 de la muestra

  7.5.4. Equilibrado de la columna

  El sistema se pone en marcha a diario. Se llena la columna con disolvente B al 100 % durante 15 minutos y, a continuaci髇, se regula la proporci髇 a A:B = 40:60 y se equilibra a 1 ml/min durante 15 minutos. Se efect鷄 un ciclo en blanco inyectando metanol (4.2.1).

  Nota: antes de su almacenamiento a largo plazo, lavar la columna con metanol y cloroformo en una proporci髇 de 80: 20 (v/v) durante 30 minutos.

  7.5.5. Determinaci髇 del contenido de FS y FE de la muestra problema

  7.5.6. Se efect鷄 la secuencia de an醠isis cromatogr醘icos sin modificar el tiempo entre ciclos con el fin de obtener per韔dos de retenci髇 constantes. Se inyecta la soluci髇 de patr髇 externo (7.3) cada 5-10 soluciones de muestra problema a fin de calcular el factor de respuesta.

  Nota: la columna debe lavarse con disolvente B al 100 % (7.5.1) durante al menos 30 minutos cada 20-25 ciclos.

  7.6. Modo de integraci髇

  7.6.1. Pico del DPEF

  El DPEF se eluye en forma de un solo pico. Se determina el 醨ea del pico mediante la integraci髇 de valle a valle.

  7.6.2. Pico de la triptamina

  La triptamina se eluye en forma de un solo pico (figura 1). Se determina el 醨ea del pico mediante la integraci髇 de valle a valle.

  7.6.3. Grupos de picos de FS y FE

  En las condiciones descritas (figura 1), la FS se eluye en forma de dos picos principales parcialmente no resueltos precedidos de un pico menor. La FE se eluye en forma de tres picos parcialmente no resueltos. Hay que determinar la superficie total de cada grupo de picos estableciendo la l韓ea de base tal como se indica en la figura 1.

  8. C罫CULO Y EXPRESI覰 DE LOS RESULTADOS

  El contenido de FS y FE de la muestra problema se calcular� como sigue:

  C = 55,36 � ((A₂)/(A₁)) � ((T₁)/(T₂))

  siendo:

  C el contenido de FS o FE (mg/100 g de leche en polvo) en la muestra problema

  A₁ el 醨ea del pico de DPEF de la soluci髇 de muestra patr髇 (7.3)

  A₂ el 醨ea del pico de FS o FE de la soluci髇 de muestra problema (7.2)

  T₁ el 醨ea del pico de triptamina de la soluci髇 de muestra patr髇 (7.3)

  T₂ el 醨ea del pico de triptamina de la soluci髇 de muestra problema (7.2).

  9. EXACTITUD DEL M蒚ODO

  Nota: los valores relativos a la repetibilidad se han calculado de acuerdo con la norma internacional FIL (10) .

  9.1. Repetibilidad

  La desviaci髇 t韕ica relativa de la repetibilidad, que expresa la variabilidad de los resultados de an醠isis independientes obtenidos por un mismo analista utilizando el mismo equipo en las mismas condiciones y con la misma muestra problema, durante un breve lapso de tiempo, no debe sobrepasar un 2 % en valor relativo. En caso de que se proceda a dos determinaciones en esas condiciones, la diferencia relativa entre ambos resultados no deber� sobrepasar el 6 % de la media aritm閠ica de los resultados.

  9.2. Reproducibilidad

  En caso de que se efect鷈n dos determinaciones por parte de analistas de distintos laboratorios, utilizando equipos distintos y en distintas condiciones para el an醠isis de la misma muestra problema, la diferencia relativa entre ambos resultados no deber� sobrepasar el 11 % de la media aritm閠ica de los resultados.

  10. BIBLIOGRAF虯

  10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., “Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids”. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).

  Figura 1

  Perfil de HPLC de los derivados OFA de la fosfatidilserina (FS) y de la fosfatidiletanolamina (FE) contenidos en el extracto metan髄ico de la leche desnatada en polvo reconstituida. Se indica el modo de integraci髇 de los picos de FS, FE y triptamina (patr髇 interno)

  

  Ap閚dice II
  
  DETECCI覰 DE SUERO DE CUAJO EN LA LECHE DESNATADA EN POLVO DESTINADA AL ALMACENAMIENTO P贐LICO MEDIANTE DETERMINACI覰 DE LOS CASEINOMACROP蒔TIDOS POR CROMATOGRAF虯 L蚎UIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)

  1. OBJETO Y 罬BITO DE APLICACI覰

  Este m閠odo permite detectar la presencia de suero de cuajo en la leche desnatada en polvo destinada al almacenamiento p鷅lico mediante determinaci髇 de los caseinomacrop閜tidos (CMP).

  2. REFERENCIA

  Norma Internacional ISO 707: Leche y productos l醕teos. Directrices para la toma de muestras.

  3. DEFINICI覰

  El contenido en s髄idos de suero de cuajo se define como el porcentaje en masa determinado por el contenido en caseinomacrop閜tidos mediante el procedimiento descrito.

  4. PRINCIPIO

  • - Reconstituci髇 de la leche desnatada en polvo, eliminaci髇 de las materias grasas y las prote韓as con 醕ido tricloroac閠ico, y centrifugaci髇 o filtraci髇.
  • - Determinaci髇 de la cantidad de caseinomacrop閜tidos (CMP) presentes en el sobrenadante por cromatograf韆 l韖uida de alto rendimiento (HPLC).
  • - Evaluaci髇 del resultado obtenido con las muestras en relaci髇 con muestras patr髇 constituidas por leche desnatada en polvo con o sin adici髇 de un porcentaje conocido de suero de leche en polvo.

  5. REACTIVOS

  Todos los reactivos deben ser de pureza anal韙ica reconocida. El agua utilizada debe ser agua destilada o un agua de pureza al menos equivalente.

  5.1. Soluci髇 de 醕ido tricloroac閠ico

  Se disuelven 240 g de 醕ido tricloroac閠ico (CCl₃COOH) en agua y se completa hasta 1 000 ml. La soluci髇 debe ser clara e incolora.

  5.2. Soluci髇 eluyente, pH 6,0

  Se disuelven 1,74 g de fosfato de hidr骻eno y dipotasio (K₂HPO₄), 12,37 g de fosfato de dihidr骻eno y potasio (KH₂PO₄) y 21,41 g de sulfato de sodio (Na₂SO₄) en unos 700 ml de agua. Se ajusta, si es necesario, a pH 6,0 con ayuda de una soluci髇 de 醕ido fosf髍ico o de hidr髕ido de potasio.

  Completar hasta 1 000 ml con agua y homogeneizar.

  Nota: la composici髇 del eluyente se puede modificar para ajustarla al certificado de los patrones o a las recomendaciones del fabricante del material de relleno de la columna.

  Antes de utilizarla, se filtra la soluci髇 eluyente a trav閟 de un filtro de membrana con un di醡etro de poro de 0,45 μm.

  5.3. Soluci髇 de lavado

  Se mezcla un volumen de acetonitrilo (CH₃CN) con nueve vol鷐enes de agua. Antes de utilizarla, se filtra la mezcla a trav閟 de un filtro de membrana con un di醡etro de poro de 0,45 μm.

  Nota: Puede utilizarse cualquier otra soluci髇 de lavado que tenga un efecto bactericida y que no altere la eficiencia de resoluci髇 de las columnas.

  5.4. Muestras patr髇

  5.4.1. Leche desnatada en polvo que responda a las exigencias del presente Reglamento, o sea [0].

  5.4.2. La misma leche desnatada en polvo adulterada con un 5 % (m/m) de suero tipo cuajo en polvo de composici髇 normal, o sea [5].

  6. INSTRUMENTAL

  6.1. Balanza anal韙ica

  6.2. Centrifugadora optativa que pueda alcanzar una aceleraci髇 de 2 200 g, provista de tubos de centr韋uga con tap髇 o capucha, de unos 50 ml de capacidad

  6.3. Agitador mec醤ico

  6.4. Agitador magn閠ico

  6.5. Embudos de vidrio de unos 7 cm de di醡etro

  6.6. Filtros de papel de filtraci髇 media, de unos 12,5 cm de di醡etro

  6.7. Dispositivo de filtraci髇 de vidrio provisto de membrana filtrante de 0,45 μm de di醡etro de poro

  6.8. Pipetas graduadas que permitan medir 10 ml (ISO 648, clase A, o ISO R/835) o un sistema capaz de introducir 10,0 ml en 2 minutos

  6.9. Sistema capaz de introducir 20,0 ml de agua a unos 50 癈

  6.10. Ba駉 Mar韆 termostatizado a 25 � 0,5 癈

  6.11. Equipo de HPLC que comprenda lo siguiente:

  • 6.11.1. Bomba
  • 6.11.2. Inyector, manual o autom醫ico, de 15 a 30 μl de capacidad
  • 6.11.3. Dos columnas en serie TSK 2 000-SW (30 cm de longitud, 0,75 cm de di醡etro interior) o columnas equivalentes (por ejemplo, una sola TSK 2 000-SWxl, una sola Agilent Technologies Zorbax GF 250) y una precolumna (3 cm � 0,3 cm) rellena de I 125 o de un material de eficacia equivalente
  • 6.11.4. Horno de columna termostatizado a 35 � 1 癈
  • 6.11.5. Detector por luz ultravioleta de longitud de onda variable, que permita efectuar mediciones de 205 mm de una sensibilidad de 0,008 �
  • 6.11.6. Integrador que pueda integrar de valle a valle

  Nota: Se puede trabajar con columnas mantenidas a temperatura ambiente, pero su poder de resoluci髇 es ligeramente menor. En este caso, las variaciones de temperatura durante una misma serie de an醠isis deber醤 ser inferiores a � 5 癈.

  7. MUESTREO

  7.1. Las muestras se tomar醤 seg鷑 el procedimiento establecido por la Norma Internacional ISO 707. No obstante, los Estados miembros podr醤 utilizar otro m閠odo de toma de muestras, siempre que se atenga a los principios de la norma antes citada.

  7.2. La muestra se debe conservar en condiciones que eviten cualquier deterioro o modificaci髇 de su composici髇.

  8. PROCEDIMIENTO

  8.1. Preparaci髇 de la muestra problema

  Se pasa la leche en polvo a un recipiente de capacidad aproximadamente doble del volumen de la leche en polvo, provisto de tapadera herm閠ica al aire. Se cierra el recipiente inmediatamente. Se mezcla bien la leche en polvo invirtiendo varias veces el recipiente.

  8.2. Porci髇 anal韙ica

  Se pesan 2,000 � 0,001 g de la muestra problema y se pasan a un tubo de centr韋uga (6.2) o a un matraz apropiado con tap髇 (50 ml).

  8.3. Eliminaci髇 de la grasa y las prote韓as

  8.3.1. Se a馻den 20,0 ml de agua tibia (50 癈) a la porci髇 anal韙ica. Se disuelve el polvo agitando durante 5 minutos con ayuda del agitador mec醤ico (6.3). Se coloca el tubo en el ba駉 Mar韆 (6.10) y se deja que se equilibre a 25 癈.

  8.3.2. Se a馻den, en 2 minutos, 10,0 ml de la soluci髇 de 醕ido tricloroac閠ico (5.1) a unos 25 癈, agitando en閞gicamente con el agitador magn閠ico (6.4). Se coloca el tubo en el ba駉 Mar韆 (6.10) y se deja durante 60 minutos.

  8.3.3. Se centrifuga (6.2) durante 10 minutos a 2 200 g, o se pasa a trav閟 de un filtro de papel (6.6), desechando los primeros 5 ml del filtrado.

  8.4. Determinaci髇 cromatogr醘ica

  8.4.1. Se inyectan de 15 a 30 μl, medidos con exactitud, de sobrenadante o de filtrado (8.3.3) en el aparato de HPLC (6.11) regulado a un caudal de 1,0 ml de soluci髇 eluyente (5.2) por minuto.

  Nota 1. Puede utilizarse otro caudal, en funci髇 del di醡etro interior de las columnas empleadas o de las instrucciones del fabricante de la columna.

  Nota 2. En cada interrupci髇, enjuagar las columnas con agua. Nunca se debe dejar en ellas la soluci髇 eluyente (5.2).

  Antes de toda interrupci髇 superior a 24 horas, enjuagar las columnas con agua y despu閟 lavarlas con la soluci髇 (5.3) durante por lo menos 3 horas con un caudal de 0,2 ml por minuto.

  8.4.2. Los resultados del an醠isis cromatogr醘ico de la muestra problema [E] se obtienen en forma de un cromatograma en el que cada pico se identifica por su tiempo de retenci髇 RT, de la forma siguiente:

  Pico II:	El segundo pico del cromatograma, con un RT de unos 12,5 minutos
  Pico III:	El tercer pico del cromatograma, correspondiente a los CMP, con un RT de 15,5 minutos.

  La calidad de las columnas elegidas puede influir mucho en los tiempos de retenci髇 de los diferentes picos.

  El integrador (6.11.6) calcula autom醫icamente la superficie A de cada pico:

  AII:	superficie del pico II
  AIII:	superficie del pico III

  Con el fin de detectar las eventuales anomal韆s debidas ya sea a un mal funcionamiento del equipo o de las columnas, ya sea al origen y naturaleza de la muestra analizada, es fundamental observar el aspecto de cada cromatograma antes de pasar a la interpretaci髇 cuantitativa.

  En caso de duda, ha de repetirse el an醠isis.

  8.5. Calibraci髇

  8.5.1. Se aplica exactamente a las muestras patr髇 (5.4) el procedimiento descrito desde el punto 8.2 al punto 8.4.2.

  Deben utilizarse soluciones reci閚 preparadas, pues los CMP se degradan en medio con tricloroac閠ico al 8 %. La p閞dida se estima en 0,2 % por hora a 30 癈.

  8.5.2. Antes de proceder a la determinaci髇 cromatogr醘ica de las muestras, se acondicionan las columnas mediante inyecciones repetidas de la soluci髇 (8.5.1) de la muestra patr髇 (5.4.2) hasta que la superficie y el tiempo de retenci髇 del pico correspondiente a los CMP sean constantes.

  8.5.3. Se determinan los factores de respuesta R inyectando el mismo volumen de filtrados (8.5.1) utilizado para las muestras.

  9. EXPRESI覰 DE LOS RESULTADOS

  9.1. Modo de c醠culo y f髍mulas

  9.1.1. C醠culo de los factores de respuesta R:

  Pico II:

  RII = 100/(AII[0])

  siendo:

  RII	=	los factores de respuesta de los picos II,
  AII [0]	=	las 醨eas de los picos II de la muestra patr髇 [0] obtenidas en 8.5.3

  Pico III:

  燫III = W/(AIII[5] – AIII[0])

  siendo:

  RIII	=	el factor de respuesta del pico III,
  AIII [0] y AIII [5]	=	Las 醨eas del pico III en las muestras patr髇 [0] y [5] respectivamente obtenidas en 8.5.3,
  W	=	la cantidad de suero presente en la muestra patr髇 [5], o sea 5.

  9.1.2. C醠culo del 醨ea relativa de los picos de la muestra [E]

  S_II[E] = R_II � A_II[E]

  S_III[E] = R_III � A_III[E]

  S_IV[E] = R_IV � A_IV[E]

  siendo:

  SII [E], SIII [E], SIV [E]	=	las 醨eas relativas de los picos II, III y IV respectivamente en la muestra [E],
  AII [E], AIII [E]	=	las 醨eas de los picos II y III respectivamente en la muestra [E] obtenidas en 8.4.2,
  RII, RIII	=	los factores de respuesta calculados en 9.1.1.

  9.1.3. C醠culo del tiempo de retenci髇 relativo del pico III de la muestra [E]:

  RRT_III[E] = (RT_III[E])/(RT_III[5])

  siendo:

  RRTIII [E]	=	el tiempo de retenci髇 relativo del pico III de la muestra [E],
  RTIII [E]	=	el tiempo de retenci髇 del pico III de la muestra [E] obtenido en 8.4.2,
  RTIII [5]	=	el tiempo de retenci髇 del pico III de la muestra testigo [5] obtenido en el punto 8.5.3.

  9.1.4. Por la experimentaci髇, se ha visto que existe una relaci髇 lineal entre el tiempo de retenci髇 relativo del pico III, es decir, RRT_III [E] y el porcentaje de suero en polvo a馻dido hasta el 10 %.

  • - El RRT_III [E] es < 1,000 si el contenido de suero es > 5 %.
  • - El RRT_III [E] es ≥ 1,000 si el contenido de suero es ≤ 5 %.

  La incertidumbre admitida para los valores de RRT_III es � 0,002.

  Normalmente, el valor de RRT_III [0] es poco diferente de 1,034. Seg鷑 el estado de las columnas, el valor puede aproximarse a 1,000, pero siempre ser� superior a esta cifra.

  9.2. C醠culo del porcentaje de suero de cuajo en polvo presente en la muestra:

  W = S_III[E] - [1, 3 + (S_III[0] - 0, 9)]

  siendo:

  W	=	el porcentaje (m/m) de suero de cuajo en la muestra [E];
  SIII [E]	=	el 醨ea relativa del pico III de la muestra problema [E] obtenida en 9.1.2;
  1,3	=	el 醨ea media relativa del pico III expresada en gramos de suero de cuajo por 100 g determinada en leche desnatada en polvo no adulterada, de distintos or韌enes; esta cifra se ha obtenido experimentalmente;
  SIII [0]	=	el 醨ea relativa del pico III que es igual a RIII � AIII [0]; estos valores se han obtenido en 9.1.1 y 8.5.3, respectivamente;
  (SIII [0] – 0,9)	=	la correcci髇 que debe hacerse al 醨ea media relativa 1,3 cuando SIII [0] no es igual a 0,9; experimentalmente, el 醨ea media relativa del pico III de la muestra testigo [0] es 0,9.

  9.3. Exactitud del m閠odo

  9.3.1. Repetibilidad

  La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simult醤eamente o en un breve intervalo de tiempo por el mismo analista, empleando los mismos aparatos y la misma muestra, no debe exceder del 0,2 % (m/m).

  9.3.2. Reproducibilidad

  La diferencia entre dos resultados particulares e independientes obtenidos en dos laboratorios diferentes, con la misma muestra, no debe exceder del 0,4 % (m/m).

  9.4. Interpretaci髇

  9.4.1. Se acepta que no existe suero si el 醨ea relativa del pico III, S_III [E], expresada en gramos de suero de cuajo por 100 g de producto, es ≤ 2,0 + (S_III[0] - 0,9),

  siendo

  2,0	el valor m醲imo permitido para el 醨ea relativa del pico III teniendo en cuenta el 醨ea media relativa del pico III, es decir, 1,3, la incertidumbre debida a las variaciones en la composici髇 de la leche desnatada en polvo y la reproducibilidad del m閠odo (9.3.2)
  (SIII [0] – 0,9)	la correcci髇 que debe hacerse cuando el 醨ea SIII [0] es distinta de 0,9 (v閍se el punto 9.2).

  9.4.2. Si el 醨ea relativa del pico III, S_III [E], es > 2,0 + (S_III [0] - 0,9) y el 醨ea relativa del pico II, S_II [E] ≤ 160, se determina el contenido en suero de cuajo como se indica en el punto 9.2.

  9.4.3. Si el 醨ea relativa del pico III, S_III [E], es > 2,0 + (S_III [0] - 0,9) y el 醨ea relativa del pico II, S_II [E] ≤ 160, se determina el contenido en prote韓as totales (P %); se examinan luego los gr醘icos 1 y 2.

  9.4.3.1. Los datos obtenidos tras el an醠isis de muestras de leches desnatadas en polvo no adulteradas, con alto contenido en prote韓as totales, se re鷑en en los gr醘icos 1 y 2.

  La l韓ea continua representa la regresi髇 lineal, cuyos coeficientes se calculan mediante el m閠odo de los m韓imos cuadrados.

  La recta de trazo discontinuo determina el l韒ite superior del 醨ea relativa del pico III, con una probabilidad de que no se sobrepasa en el 90 % de los casos.

  Las ecuaciones de las rectas que aparecen con trazo discontinuo en los gr醘icos 1 y 2 son las siguientes:

  SIII = 0,376 P % – 10,7	(gr醘ico 1)
  SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93	(gr醘ico 2)

  respectivamente, siendo:

  SIII	el 醨ea relativa del pico III calculada bien a partir del contenido en prote韓as totales, bien a partir del 醨ea relativa del pico SII [E],
  P %	el contenido en prote韓as totales expresado en porcentaje ponderal,
  SII [E]	el 醨ea relativa de la muestra calculada en el punto 9.1.2.

  Estas ecuaciones son equivalentes a la cifra 1,3 mencionada en el n鷐ero 9.2.

  La diferencia (T₁ y T₂) entre el 醨ea relativa S_III [E] hallada y el 醨ea relativa S_III viene dada por las relaciones siguientes: T₁ = S_III[E] - [(0,376 P% - 10,7) + (S_III[0] - 0,9)]T₂ = S_III[E] - [(0,0123 S_II[E] + 0,93) + (S_III[0] - 0,9)]

  9.4.3.2.

  Si T1 y/o T2	son iguales o inferiores a cero, no puede determinarse la presencia de suero de cuajo.
  Si T1 y T2	son superiores a cero, hay presencia de suero de cuajo.

  El contenido en suero de cuajo existente se calcular� mediante la f髍mula siguiente: W = T₂ + 0,91

  siendo:

  0,91 la distancia sobre el eje vertical entre la l韓ea de trazo continuo y la recta de trazo discontinuo.

  

  Ap閚dice III
  
  DETERMINACI覰 DE LOS S覮IDOS DE SUERO DE CUAJO EN LA LECHE DESNATADA EN POLVO

  1. OBJETO: DETECCI覰 DE LA ADICI覰 DE S覮IDOS DE SUERO DE CUAJO A LA LECHE DESNATADA EN POLVO

  2. REFERENCIAS: NORMA INTERNACIONAL ISO 707

  3. DEFINICI覰

  El contenido en s髄idos de suero de cuajo se define como el porcentaje en masa determinado por el contenido en caseinomacrop閜tido mediante el procedimiento descrito.

  4. PRINCIPIO

  Las muestras se analizan para detectar la presencia de caseinomacrop閜tido A por el procedimiento de cromatograf韆 de l韖uidos de alto rendimiento en fase inversa (procedimiento HPLC). El resultado se eval鷄 por comparaci髇 con muestras patr髇 constituidas por leche desnatada en polvo con y sin un porcentaje conocido de suero en polvo. Un resultado superior al 1 % (m/m) indica la presencia de s髄idos de suero de cuajo.

  5. REACTIVOS

  Todos los reactivos deben ser de pureza anal韙ica reconocida. El agua utilizada debe ser agua destilada o agua de pureza al menos equivalente. El acetonitrilo debe ser de calidad espectrosc髉ica o adecuada para HPLC.

  5.1. Soluci髇 de 醕ido tricloroac閠ico

  Se disuelven 240 g de 醕ido tricloroac閠ico (CCl₃COOH) en agua y se completa hasta 1 000 ml. La soluci髇 debe ser clara e incolora.

  5.2. Eluyentes A y B

  Eluyente A: se introducen, en un matraz aforado de 1 000 ml, 150 ml de acetonitrilo (CH₃CN), 20 ml de isopropanol (CH₃CHOHCH₃) y 1,00 ml de 醕ido trifluoroac閠ico (TFA, CF₃COOH). Se enrasa con agua a 1 000 ml.

  Eluyente B: se introducen, en un matraz aforado de 1 000 ml, 550 ml de acetonitrilo, 20 ml de isopropanol y 1,00 ml de TFA. Se enrasa con agua a 1 000 ml. Antes de utilizarla, se filtra la soluci髇 eluyente a trav閟 de un filtro de membrana con un di醡etro de poro de 0,45 μm.

  5.3. Conservaci髇 de la columna

  Tras los an醠isis, la columna se lava con el eluyente B (mediante un gradiente) y a continuaci髇 se lava con acetonitrilo (mediante un gradiente durante 30 minutos). La columna se conserva en acetonitrilo.

  5.4. Muestras patr髇

  5.4.1. Leche desnatada en polvo que se ajuste a los requisitos aplicables al almacenamiento p鷅lico (es decir [0]).

  5.4.2. La misma leche desnatada en polvo adulterada con 5 % (m/m) de suero tipo cuajo en polvo de composici髇 normal, o sea [5].

  5.4.3. La misma leche desnatada en polvo adulterada con 50 % (m/m) de suero tipo cuajo en polvo de composici髇 normal, o sea [50].

  6. INSTRUMENTAL

  6.1. Balanza anal韙ica

  6.2. Centrifugadora optativa que pueda alcanzar una aceleraci髇 de 2 200 g, provista de tubos de centr韋uga con tap髇 o capucha, de unos 50 ml de capacidad

  6.3. Agitador mec醤ico

  6.4. Agitador magn閠ico

  6.5. Embudos de vidrio de unos 7 cm de di醡etro

  6.6. Filtros de papel de filtraci髇 media, de unos 12,5 cm de di醡etro

  6.7. Dispositivo de filtraci髇 de vidrio provisto de membrana filtrante de 0,45 μm de di醡etro de poro

  6.8. Pipetas graduadas que permitan medir 10 ml (ISO 648, clase A, o ISO/R 835) o un sistema capaz de introducir 10,0 ml en 2 minutos

  6.9. Sistema capaz de introducir 20,0 ml de agua a unos 50 癈

  6.10. Ba駉 Mar韆 termostatizado a 25 � 0,5 癈

  6.11. Equipo de HPLC que comprenda lo siguiente:

  • 6.11.1. Sistema de bombeo de gradiente binario
  • 6.11.2. Inyector, manual o autom醫ico, con capacidad de 100 μl
  • 6.11.3. Columna Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (25 cm de longitud; 0,46 cm de di醡etro interior) o una columna equivalente de fase inversa de poro grueso, a base de s韑ice
  • 6.11.4. Horno de columna termostatizado a 35 � 1 癈
  • 6.11.5. Detector de luz ultravioleta de longitud de onda variable, que permita tomar medidas a 210 nm (de ser necesario, puede utilizarse una longitud de onda mayor, hasta 220 nm), con una sensibilidad de 0,02 �.
  • 6.11.6. Integrador que pueda efectuar la integraci髇 a una l韓ea base com鷑 o de valle a valle

  Nota: se puede trabajar con la columna a temperatura ambiente, con tal de que esta no fluct鷈 en m醩 de 1 癈; de no cumplirse esta condici髇, se produce una variaci髇 excesiva del tiempo de retenci髇 del CMP_A.

  7. MUESTREO

  7.1. Las muestras se tomar醤 seg鷑 el procedimiento establecido por la Norma Internacional ISO 707. No obstante, los Estados miembros podr醤 utilizar otro m閠odo de toma de muestras, siempre que se atenga a los principios de la norma antes citada.

  7.2. La muestra se debe conservar en condiciones que eviten cualquier deterioro o modificaci髇 de su composici髇.

  8. PROCEDIMIENTO

  8.1. Preparaci髇 de la muestra problema

  Se pasa la leche en polvo a un recipiente de capacidad aproximadamente doble del volumen de la leche en polvo, provisto de tapadera herm閠ica al aire. Se cierra el recipiente inmediatamente. Se mezcla bien la leche en polvo invirtiendo varias veces el recipiente.

  8.2. Porci髇 anal韙ica

  Se pesan 2,00 � 0,001 g de la muestra problema en un tubo de centr韋uga (6.2) o en un matraz apropiado con tap髇 (50 ml).

  Nota: si se trata de una mezcla, debe pesarse una cantidad de muestra problema tal que la porci髇 de muestra desengrasada corresponda a 2,00 g.

  8.3. Eliminaci髇 de la grasa y las prote韓as

  8.3.1. Se a馻den 20,0 ml de agua tibia (50 癈) a la porci髇 anal韙ica. Se disuelve el polvo agitando durante 5 minutos con ayuda del agitador mec醤ico (6.3). Se coloca el tubo en el ba駉 Mar韆 (6.10) y se deja que se equilibre a 25 癈.

  8.3.2. Se a馻den en 2 minutos, de forma constante, 10,0 ml de soluci髇 de 醕ido tricloroac閠ico a 25 癈 (5.1) a la vez que se agita vigorosamente con el agitador magn閠ico (6.4). Se coloca el tubo en el ba駉 Mar韆 (6.10) y se deja durante 60 minutos.

  8.3.3. Se centrifuga (6.2) durante 10 minutos a 2 200 g, o se pasa a trav閟 de un filtro de papel (6.6), desechando los primeros 5 ml del filtrado.

  8.4. Determinaci髇 cromatogr醘ica

  8.4.1. El m閠odo HPLC en fase inversa excluye la posibilidad de falsos positivos debidos a la presencia de suero de mantequilla 醕ida en polvo.

  8.4.2. Antes de llevar a cabo el an醠isis por HPLC en fase inversa, deben optimizarse las condiciones de gradiente. Un tiempo de retenci髇 de 26 � 2 minutos para el CMP _A es 髉timo para sistemas de gradiente con un volumen muerto de unos 6 ml (volumen desde el punto en que confluyen los disolventes hasta el volumen del circuito de inyecci髇, incluido este 鷏timo). Para los sistemas de gradiente con un volumen muerto inferior (por ejemplo, 2 ml) debe emplearse un tiempo de retenci髇 髉timo de 22 minutos.

  Se toman soluciones de las muestras patr髇 (5.4) con y sin un 50 % de suero de cuajo.

  Se inyectan 100 μl de sobrenadante o filtrado (8.3.3) en el aparato de HPLC, que deber� funcionar en las condiciones de gradiente de exploraci髇 que figuran en el cuadro 1.

  Cuadro 1

  Condiciones de gradiente de exploraci髇 para la optimizaci髇 de la cromatograf韆

  Tiempo (min)	Caudal (ml/min)	% A	% B	Curva
  Inicial	1,0	90	10	*
  27	1,0	60	40	Lineal
  32	1,0	10	90	Lineal
  37	1,0	10	90	Lineal
  42	1,0	90	10	Lineal

  La situaci髇 del pico del CMP_Α se obtendr� por comparaci髇 de los dos cromatogramas.

  Mediante la f髍mula indicada a continuaci髇 puede calcularse la composici髇 inicial del disolvente que ha de utilizarse para el gradiente normal (v閍se 8.4.3) % B = 10 - 2,5 + (13,5 + (RT_cmpA - 26) / 6) � 30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RT_cmpA - 26) / 6) � 1,101

  Siendo:

  RTcmpA	:	el tiempo de retenci髇 del CMPΑ en el gradiente de exploraci髇
  10	:	el % B inicial del gradiente de exploraci髇
  2,5	:	% B en el punto medio menos % B en el punto inicial del gradiente normal
  13,5	:	el tiempo correspondiente al punto medio del gradiente de exploraci髇
  26	:	el tiempo de retenci髇 requerido del CMPΑ
  6	:	la proporci髇 de las pendientes del gradiente de exploraci髇 y del normal
  30	:	% B en el punto inicial menos % B a 27 minutos en el gradiente de exploraci髇
  27	:	tiempo de desarrollo del gradiente de exploraci髇.

  8.4.3. Se toman soluciones de las muestras problema

  Se inyectan 100 μl de sobrenadante o filtrado (8.3.3), medidos con exactitud, en el aparato de HPLC que funcionar� con un caudal de 1,0 ml de soluci髇 de eluyente (5.2) por minuto.

  La composici髇 del eluyente al iniciarse el an醠isis se obtiene de 8.4.2. Normalmente suele estar cerca de A:B = 76:24 (5.2). Inmediatamente despu閟 de la inyecci髇 se inicia un gradiente lineal que da lugar, al cabo de 27 minutos, a un porcentaje de B superior en un 5 %. A continuaci髇 comienza un gradiente lineal por el cual la composici髇 del eluyente alcanza el 90 % de B en 5 minutos. Esta composici髇 se mantiene durante 5 minutos, transcurridos los cuales la composici髇 se modifica mediante un gradiente lineal para alcanzar en 5 minutos la composici髇 inicial. Dependiendo del volumen interno del sistema de bombeo, la siguiente inyecci髇 puede llevarse a cabo 15 minutos despu閟 de haberse alcanzado las condiciones iniciales.

  Nota 1. El tiempo de retenci髇 del CMP_A debe ser de 26 � 2 minutos. Puede conseguirse variando las condiciones iniciales y finales del primer gradiente. Sin embargo, la diferencia de % B entre las condiciones iniciales y finales del primer gradiente se mantendr� en 5 % B.

  Nota 2. Los eluyentes deben desgasificarse suficientemente y mantenerse desgasificados. Ello es esencial para que el sistema de bombeo por gradiente pueda funcionar correctamente. La desviaci髇 t韕ica del tiempo de retenci髇 del pico del CMP_A debe ser inferior a 0,1 minutos (n = 10).

  Nota 3. Cada 5 muestras debe inyectarse la muestra de referencia [5] y emplearse para calcular un nuevo factor de respuesta R (9.1.1).

  8.4.4. Los resultados del an醠isis cromatogr醘ico de la muestra problema (E) se obtienen en forma de cromatograma en el que el pico del CMP_A se identifica por su tiempo de retenci髇 de unos 26 minutos.

  El integrador (6.11.6) calcula autom醫icamente la altura H del pico del CMP_A. La situaci髇 de la l韓ea de base debe comprobarse en cada cromatograma. Hay que repetir el an醠isis o la integraci髇 si la l韓ea de base est� situada incorrectamente.

  Nota: si el pico del CMP_A est� separado suficientemente de los otros picos, debe aplicarse la asignaci髇 de la l韓ea de base valle a valle; en caso contrario, hay que trazar perpendiculares a una l韓ea de base com鷑, cuyo punto de inicio debe estar pr髕imo al pico del CMP_A (por tanto, o a t = 0 min!). Para el patr髇 y las muestras hay que utilizar el mismo tipo de integraci髇 y comprobar, en el caso de una l韓ea de base com鷑, su coherencia en relaci髇 con las muestras y el patr髇.

  Con el fin de detectar las anomal韆s eventuales debidas ya sea a un mal funcionamiento del aparato o de la columna, ya sea al origen y naturaleza de la muestra analizada, es fundamental observar el aspecto de cada cromatograma antes de efectuar la interpretaci髇 cuantitativa. En caso de duda, ha de repetirse el an醠isis.

  8.5. Calibraci髇

  8.5.1. Aplicar a las muestras patr髇 (5.4.1 y 5.4.2) el procedimiento desde el punto 8.2 al 8.4.4, exactamente tal y como se describe. Hay que utilizar soluciones reci閚 preparadas, pues los CMP se degradan en medio de 醕ido tricloroac閠ico al 8 % a temperatura ambiente. A 4 癈, la soluci髇 permanece estable durante 24 horas. Cuando se realice una larga serie de an醠isis, es recomendable emplear una bandeja refrigerada para las muestras en el inyector autom醫ico.

  Nota: el punto 8.4.2 puede omitirse si el % B en las condiciones iniciales se conoce por an醠isis previos.

  El cromatograma de la muestra patr髇 [5] deber韆 ser an醠ogo al representado en la figura 1. Aqu�, el pico del CMP_A viene precedido por dos picos peque駉s. Es imprescindible obtener una separaci髇 similar.

  8.5.2. Antes de proceder a la determinaci髇 cromatogr醘ica de las muestras, se inyectan 100 μl de la muestra patr髇 sin suero de cuajo [0] (5.4.1).

  El cromatograma no debe presentar ning鷑 pico al tiempo de retenci髇 del pico del CMP_A.

  8.5.3. Se determinan los factores de respuesta R inyectando el mismo volumen de filtrado (8.5.1) utilizado para las muestras.

  9. EXPRESI覰 DE LOS RESULTADOS

  9.1. Modo de c醠culo y f髍mulas

  9.1.1. C醠culo del factor de respuesta R:

  Pico del CMP_A: R = W/H

  Siendo:

  R	=	el factor de respuesta del pico del CMPA
  H	=	la altura del pico del CMPA
  W	=	la cantidad de suero de la muestra patr髇 [5].

  9.2. C醠culo del porcentaje de suero de cuajo en polvo presente en la muestra

  W(E) = R � H(E)

  Siendo:

  W(E)	=	el porcentaje (m/m) de suero de cuajo en la muestra (E)
  R	=	el factor de respuesta del pico del CMPA (9.1.1)
  H(E)	=	la altura del pico del CMPA de la muestra (E)

  Si W(E) es superior al 1 % y la diferencia entre el tiempo de retenci髇 de la muestra y el de la muestra patr髇 [5] es inferior a 0,2 minutos, se confirma la presencia de s髄idos de suero de cuajo.

  9.3. Exactitud del m閠odo

  9.3.1. Repetibilidad

  La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simult醤eamente o en un breve intervalo de tiempo por el mismo analista, empleando los mismos aparatos y la misma muestra, no debe exceder del 0,2 % (m/m).

  9.3.2. Reproducibilidad

  No determinada.

  9.3.3. Linealidad

  Entre 0 y 16 % de suero de cuajo, debe obtenerse una relaci髇 lineal con un coeficiente de correlaci髇 > 0,99.

  9.4. Interpretaci髇

  El l韒ite del 1 % incluye la incertidumbre debida a la reproducibilidad.

  Figura 1

  Patr髇 Ni-4.6

  

  
• 3) Se a馻den los anexos siguientes:

  � ANEXO VI
  
  M閠odos de an醠isis de la mantequilla objeto de almacenamiento privado

  Par醡etro	M閠odo
  Grasa (11)	ISO 17189 o ISO 3727 parte 3
  Agua	ISO 3727 parte 1
  S髄idos no grasos (excluida la sal)	ISO 3727 parte 2
  Sal	ISO 15648

  ANEXO VII
  
  M閠odos de an醠isis de la leche desnatada en polvo objeto de almacenamiento privado

  Par醡etro	M閠odo
  Grasa	ISO 1736
  Prote韓as	ISO 8968 parte 1
  Agua	ISO 5537

  ANEXO VIII
  
  M閠odos de an醠isis de los quesos objeto de almacenamiento privado

  1. Para garantizar que el queso hecho exclusivamente de leche de oveja, de cabra o de b鷉ala, o de una mezcla de estas leches, no contiene case韓a de leche de vaca se utilizar� el m閠odo de an醠isis establecido en el ap閚dice.

  Se considera que hay presencia de case韓a de leche de vaca si el contenido de case韓a de leche de vaca de la muestra analizada es igual o superior al contenido de la muestra de referencia que contiene 1 % de leche de vaca, seg鷑 se establece en el ap閚dice.

  2. Podr醤 utilizarse otros m閠odos para detectar la case韓a de leche de vaca en los quesos citados en el apartado 1, siempre que:

  • a) el l韒ite de detecci髇 sea como m醲imo del 0,5 %, y
  • b) no haya falsos positivos, y
  • c) la case韓a de leche de vaca siga siendo detectable con la sensibilidad exigida incluso tras largos per韔dos de maduraci髇, como puede suceder en condiciones comerciales normales.

  Si no se cumple alguna de las condiciones citadas, se utilizar� el m閠odo establecido en el ap閚dice.

  Ap閚dice
  
  M蒚ODO PARA LA DETECCI覰 DE LECHE DE VACA Y DE CASEINATO DE LECHE DE VACA EN QUESOS DE LECHE DE OVEJA, LECHE DE CABRA O LECHE DE B贔ALA, O MEZCLAS DE LECHE DE OVEJA, CABRA Y B贔ALA

  1. OBJETO

  Detecci髇 de leche de vaca y de caseinato de leche de vaca en quesos de leche de oveja, leche de cabra o leche de b鷉ala, o mezclas de leche de oveja, cabra y b鷉ala, mediante isoelectroenfoque de γ-case韓as tras plasmin髄isis.

  2. 罬BITO DE APLICACI覰

  El m閠odo es adecuado para la detecci髇 sensible y espec韋ica de leche de vaca y de caseinato de leche de vaca, tanto crudo como con tratamiento t閞mico, en quesos frescos y madurados elaborados con leche de oveja, leche de cabra o leche de b鷉ala, o mezclas de leche de oveja, cabra y b鷉ala. No es adecuado para la detecci髇 de la adulteraci髇 de leche y queso con concentrados de prote韓as de suero de leche de bovino tratados t閞micamente.

  3. PRINCIPIO DEL M蒚ODO

  3.1. Aislamiento de case韓as de queso y patrones de referencia

  3.2. Disoluci髇 de las case韓as aisladas y ruptura con plasmina (EC.3.4.21.7)

  3.3. Isoelectroenfoque de las case韓as tratadas con plasmina en presencia de urea y tinci髇 de las prote韓as

  3.4. Evaluaci髇 de las manchas te駃das de γ₃ y γ₂-case韓a (prueba de la presencia de leche de vaca) comparando las manchas obtenidas de la muestra con las producidas en el mismo gel por los patrones de referencia que contienen 0 % y 1 % de leche de vaca

  4. REACTIVOS

  A menos que se indique lo contrario, se utilizar醤 sustancias de grado anal韙ico. Debe utilizarse agua bidestilada o de pureza equivalente.

  Nota: los datos siguientes se refieren a geles de poliacrilamida con urea, preparados en el laboratorio, de unas dimensiones de 265 � 125 � 0,25 mm. Si se utilizan geles de otro tipo o dimensiones, es posible que deban modificarse las condiciones de separaci髇.

  Isoelectroenfoque

  4.1. Reactivos para la obtenci髇 de los geles de poliacrilamida con urea

  4.1.1. Soluci髇 de gel madre

  Se disuelven:

  4,85 g de acrilamida

  0,15 g de N,N′-metilen-bis-acrilamida (BIS)

  48,05 g de urea

  15,00 g de glicerol (87 % p/p),

  en agua; se lleva a 100 ml y se guarda en un frasco de vidrio topacio en el frigor韋ico.

  Nota: puede utilizarse una soluci髇 de acrilamida/BIS premezcladas, presente en el comercio, en vez de los pesos fijos indicados de las acrilamidas neurot髕icas. Si una soluci髇 de este tipo contiene un 30 % p/v de acrilamida y un 0,8 % p/v de BIS, deber� utilizarse para la formulaci髇 un volumen de 16,2 ml, en lugar de los pesos fijos. El plazo de validez de la soluci髇 madre es como m醲imo de 10 d韆s; si su conductividad es superior a 5 μS, debe desionizarse agitando con 2 g de amberlita MB-3 durante 30 minutos, y filtrarse despu閟 por una membrana de 0,45 μm.

  4.1.2. Soluci髇 de gel

  Se prepara una soluci髇 de gel mezclando aditivos y anfolitos (*) con la soluci髇 de gel madre (v閍se 4.1.1):

  9,0 ml de soluci髇 madre

  24 mg de β-alanina

  500 μl de anf髄ito pH 3,5-9,5

  250 μl de anf髄ito pH 5-7

  250 μl de anf髄ito pH 6-8

  Se mezcla la soluci髇 de gel y se desgasifica durante dos o tres minutos en un ba駉 de ultrasonidos o en vac韔.

  Nota: la soluci髇 de gel se prepara justo antes de verterla (v閍se 6.2).

  4.1.3. Soluciones catalizadoras

  4.1.3.1. N,N,N′,N′-tetrametiletilendiamina (Temed)

  4.1.3.2. Persulfato am髇ico al 40 % p/v (PER):

  Se disuelven 800 mg de PER en agua y se completa hasta 2 ml.

  Nota: debe utilizarse siempre una soluci髇 de PER reci閚 preparada.

  4.2. L韖uido de contacto

  Queroseno o parafina l韖uida

  4.3. Soluci髇 an骴ica

  Se disuelven 5,77 g de 醕ido fosf髍ico (85 % p/p) en agua y se diluye hasta 100 ml.

  4.4. Soluci髇 cat骴ica

  Se disuelven 2,00 g de hidr髕ido s骴ico en agua y se diluye hasta 100 ml con agua.

  Preparaci髇 de la muestra

  4.5. Reactivos para el aislamiento de las prote韓as

  4.5.1. 羉ido ac閠ico diluido (25,0 ml de 醕ido ac閠ico glacial llevados a 100 ml con agua)

  4.5.2. Diclorometano

  4.5.3. Acetona

  4.6. Amortiguador de disoluci髇 de prote韓as

  Se disuelven:

  5,75 g de glicerol (87 % p/p)

  24,03 g de urea

  250 mg de ditiotreitol

  en agua y se completa hasta 50 ml.

  Nota: se debe conservar en frigor韋ico durante un plazo m醲imo de una semana.

  4.7. Reactivos para la ruptura con plasmina de las case韓as

  4.7.1. Amortiguador de carbonato am髇ico

  Se ajusta a pH 8 una soluci髇 de hidrogenocarbonato am髇ico 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml de agua) que contiene 0,05 mol/l de 醕ido etilendiaminotetraac閠ico (EDTA, 1,46 g/100 ml) con una soluci髇 de carbonato am髇ico 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml de agua) que contiene 0,05 mol/l de EDTA.

  4.7.2. Plasmina bovina (EC. 3.4.21.7), con una actividad m韓ima de 5 U/ml

  4.7.3. Soluci髇 de 醕ido ε-aminocaproico para inhibici髇 enzim醫ica

  Se disuelven 2,624 g de 醕ido ε-aminocaproico (醕ido 6-amino-n-hexanoico) en 100 ml de etanol del 40 % (v/v).

  4.8. Patrones

  4.8.1. En el Instituto de Medidas y Materiales de Referencia de la Comisi髇, B-2440 Geel, B閘gica, pueden conseguirse patrones de referencia certificados de una mezcla de leche desnatada cuajada de oveja y de cabra, con un 0 % y un 1 % de leche de vaca.

  4.8.2. Preparaci髇 de patrones provisionales de laboratorio de leche cuajada de b鷉ala con un 0 % y un 1 % de leche de vaca.

  Se prepara la leche desnatada mediante centrifugaci髇 de leche cruda de vaca o de b鷉ala a granel a 37 癈 a 2 500 g durante 20 minutos. Tras enfriar el tubo y su contenido r醦idamente a 6-8 癈, se elimina completamente la capa grasa superior. Para la preparaci髇 del patr髇 del 1 %, se a馻den 5,00 ml de leche desnatada de vaca a 495 ml de leche desnatada de b鷉ala en un vaso de 1 litro y se ajusta el pH a 6,4 mediante adici髇 de 醕ido l醕tico diluido (10 % p/v). Se ajusta la temperatura a 35 癈 y se a馻den 100 μl de cuajo de ternero (actividad del cuajo 1:10 000, aprox. 3 000 U/ml), se agita durante 1 minuto y se deja el vaso en reposo, cubierto con l醡ina de aluminio, a 35 癈 durante 1 hora, para que se pueda formar la cuajada. Una vez formada esta, se liofiliza toda la leche cuajada, sin que haya previamente homogeneizaci髇 ni eliminaci髇 del suero. Tras la liofilizaci髇, se tritura bien para obtener un polvo homog閚eo. Para la preparaci髇 del patr髇 del 0 %, se sigue el mismo procedimiento utilizando leche desnatada pura de b鷉ala. Los patrones deben conservarse a - 20 癈.

  Nota: es conveniente comprobar la pureza de la leche de b鷉ala mediante isoelectroenfoque de las case韓as tratadas con plasmina antes de la preparaci髇 de los patrones.

  Reactivos de tinci髇 de prote韓as

  4.9. Fijador

  Se disuelven 150 g de 醕ido tricloroac閠ico en agua y se lleva a 1 000 ml.

  4.10. Soluci髇 decolorante

  Se diluyen 500 ml de metanol y 200 ml de 醕ido ac閠ico glacial hasta 2 000 ml con agua destilada.

  Nota: la soluci髇 decolorante debe prepararse cada d韆; puede hacerse mezclando vol鷐enes iguales de soluciones madre de metanol del 50 % (v/v) y de 醕ido ac閠ico glacial del 20 % (v/v).

  4.11. Soluciones colorantes

  4.11.1. Soluci髇 colorante (soluci髇 madre 1)

  Se disuelven 3,0 g de azul brillante Coomassie G 250 (C.I.42655) en 1 000 ml de metanol del 90 % (v/v) utilizando un agitador magn閠ico (durante unos 45 minutos) y se filtra a trav閟 de dos filtros de pliegues de velocidad media.

  4.11.2. Soluci髇 colorante (soluci髇 madre 2)

  Se disuelven 5,0 g de sulfato de cobre pentahidratado en 1 000 ml de 醕ido ac閠ico del 20 % (v/v).

  4.11.3. Soluci髇 colorante (soluci髇 de trabajo)

  Se mezclan 125 ml de cada una de las soluciones madre (4.11.1, 4.11.2), justo antes de realizar la tinci髇.

  Nota: la soluci髇 colorante solo debe utilizarse el mismo d韆 en que se haya preparado.

  5. EQUIPO

  5.1. Placas de vidrio (265 � 125 � 4 mm); rodillo de caucho (15 cm de ancho); mesa de nivelaci髇

  5.2. Hoja de soporte del gel (265 � 125 mm)

  5.3. Hoja de cobertura (280 � 125 mm). Se pega una tira de cinta adhesiva (280 � 6 � 0,25 mm) a cada uno de los bordes largos (v閍se la figura 1).

  5.4. C醡ara de electroenfoque con placa de refrigeraci髇 (por ejemplo, 265 � 125 mm) con fuente de alimentaci髇 adecuada (≥ 2,5 kV) o equipo autom醫ico de electroforesis

  5.5. Criostato de circulaci髇, termostatizado a 12 � 0,5 癈

  5.6. Centr韋uga, ajustable a 3 000 g

  5.7. Tiras de electrodos (≥ 265 mm de longitud)

  5.8. Frascos de pl醩tico para el goteo de las soluciones an骴ica y cat骴ica

  5.9. Aplicadores de la muestra (10 � 5 mm, papel de filtro de escasa adsorci髇 de prote韓as o viscosa)

  5.10. Placas de cristal o acero inoxidable para te駃r y decolorar (por ejemplo, bandejas de instrumentos de 280 � 150 mm)

  5.12. Homogeneizador de varilla ajustable (10 mm de di醡etro del cilindro, velocidad entre 8 000 y 20 000 rpm)

  5.13. Agitador magn閠ico

  5.14. Ba駉 ultras髇ico

  5.15. Soldador de pel韈ulas

  5.16. Micropipetas de 25 μl

  5.17. Concentrador a vac韔 o liofilizador

  5.18. Ba駉 Mar韆 termostatizado a 35 y 40 � 1 癈 con agitador

  5.19. Equipo de densitometr韆 capaz de medir a λ = 634 nm

  6. PROCEDIMIENTO

  6.1. Preparaci髇 de la muestra

  6.1.1. Aislamiento de las case韓as

  Se pesa la cantidad equivalente a 5 g de peso seco de queso o de patr髇 de referencia en un tubo de centr韋uga de 100 ml, se a馻den 60 ml de agua destilada y se homogeneiza con un homogeneizador de varilla (8 000-10 000 rpm). Se ajusta el pH a 4,6 con 醕ido ac閠ico diluido (4.5.1) y se centrifuga (5 minutos, 3 000 g). Se decantan la grasa y el suero, se homogeneiza el residuo a 20 000 rpm en 40 ml de agua destilada [con el pH ajustado a 4,5 con 醕ido ac閠ico diluido (4.5.1)], se a馻den 20 ml de diclorometano (4.5.2), se homogeneiza de nuevo y se centrifuga (5 minutos, 3 000 g). Con una esp醫ula se extrae la capa de case韓a que se halla entre las fases acuosa y org醤ica (v閍se la figura 2) y se decantan ambas fases. Se vuelve a homogeneizar la case韓a en 40 ml de agua destilada (v閍se m醩 arriba) y 20 ml de diclorometano (4.5.2), y se centrifuga. Se repite esta operaci髇 hasta que las dos fases de extracci髇 sean incoloras (2 o 3 veces). Se homogeneiza el residuo de prote韓a con 50 ml de acetona (4.5.3) y se pasa a trav閟 de un filtro de papel de pliegues de velocidad media. Se lava dos veces el residuo que queda en el filtro con 25 ml de acetona cada vez, y se deja secar al aire o en corriente de nitr骻eno; despu閟 se pulveriza bien en mortero.

  Nota: la case韓a aislada seca debe conservarse a - 20 癈.

  6.1.2. Ruptura de las β-case韓as con plasmina para intensificar las γ-case韓as

  Se suspenden 25 mg de case韓as aisladas (6.1.1) en 0,5 ml de soluci髇 amortiguadora de carbonato am髇ico (4.7.1) y se homogeneiza durante 20 minutos, por ejemplo con ultrasonidos. Se calienta a 40 癈 y se a馻den 10 μl de plasmina (4.7.2), se mezcla y se incuba durante una hora a 40 癈 sin dejar de agitar. Para inhibir la enzima se a馻den 20 μl de soluci髇 de 醕ido ε-aminocaproico (4.7.3) y se a馻den despu閟 200 mg de urea s髄ida y 2 mg de ditiotreitol.

  Nota: para obtener mayor simetr韆 en las bandas de case韓a enfocada, es conveniente liofilizar la soluci髇 tras a馻dir el 醕ido ε-aminocaproico y disolver despu閟 el residuo en 0,5 ml de soluci髇 amortiguadora de disoluci髇 de prote韓as (4.6).

  6.2. Preparaci髇 de los geles de poliacrilamida con urea

  Con ayuda de unas cuantas gotas de agua, se extiende la hoja de soporte del gel (5.2) sobre una placa de vidrio (5.1), y se elimina el exceso de agua con toallas o pa駏elos de papel. Se extiende la hoja de cobertura (5.3) con espaciadores (0,25 mm) sobre otra placa de vidrio de la misma forma. Se coloca la placa horizontalmente sobre una mesa de nivelaci髇.

  Se a馻den 10 μl de Temed (4.1.3.1) a la soluci髇 de gel preparada y desgasificada (4.1.2), se agita y se a馻den 10 μl de soluci髇 de PER (4.1.3.2), se mezcla bien y se vierte de inmediato y uniformemente en el centro de la hoja de cobertura. Se coloca un extremo de la placa de soporte del gel (con la cara de la hoja hacia abajo) sobre la placa de la hoja de cobertura y se baja lentamente de manera que se forme una pel韈ula de gel entre las hojas, extendi閚dose de forma regular y sin burbujas (figura 3). Con una fina esp醫ula se hace bajar cuidadosa y completamente la placa de soporte del gel y se colocan otras tres placas de vidrio encima para que act鷈n de peso. Una vez completada la polimerizaci髇 (alrededor de 60 minutos), se extrae el gel polimerizado sobre la hoja de soporte del gel junto con la hoja de cobertura, dando golpecitos en las placas de vidrio. Se limpia cuidadosamente el rev閟 de la hoja de soporte para eliminar los residuos de gel y la urea. Se suelda el “emparedado de gel” para formar un tubo de pel韈ula, y se guarda en frigor韋ico (durante 6 semanas como m醲imo).

  Nota: la hoja de cobertura con los espaciadores puede volver a utilizarse. El gel de poliacrilamida puede cortarse en trozos m醩 peque駉s, lo que es recomendable cuando hay pocas muestras o si se utiliza un equipo autom醫ico de electroforesis (dos geles de 4,5 � 5 cm).

  6.3. Isoelectroenfoque

  Se grad鷄 el termostato de refrigeraci髇 a 12 癈. Se frota el rev閟 de la hoja de soporte del gel con queroseno y despu閟 se dejan caer unas cuantas gotas de queroseno (4.2) sobre el centro del bloque de refrigeraci髇. Se extiende encima el “emparedado de gel”, con la cara del soporte hacia abajo, con cuidado para evitar la formaci髇 de burbujas. Se enjuga el exceso de queroseno y se quita la hoja de cobertura. Se empapan las tiras de los electrodos con las soluciones electr骴icas (4.3 y 4.4), se cortan para ajustarlas a la longitud del gel y se colocan en los lugares previstos (a 9,5 cm de distancia de los electrodos).

  Condiciones del isoelectroenfoque:

  • 6.3.1. Tama駉 del gel: 265 � 125 � 0,25 mm

    Etapa	Tiempo (min)	Tensi髇 (V)	Intensidad de corriente (mA)	Potencia (W)	Voltios-hora (Vh)
    1.-Pre-enfoque	30	m醲ima 2 500	m醲ima 15	constante 4	aprox. 300
    2.-Enfoque de la muestra (12)	60	m醲ima 2 500	m醲ima 15	constante 4	aprox. 1 000
    3.-Enfoque final	60	m醲ima 2 500	m醲ima 5	m醲ima 20	aprox. 3 000
    �	40	m醲ima 2 500	m醲ima 6	m醲ima 20	aprox. 3 000
    �	30	m醲ima 2 500	m醲ima 7	m醲ima 25	aprox. 3 000

    
    
    Nota: si se modifica el espesor o la anchura de los geles, habr� que ajustar convenientemente los valores de intensidad y potencia (por ejemplo, habr� que duplicar los valores de intensidad de corriente el閏trica y de potencia si se utiliza un gel de 265 � 125 � 0,5 mm).
  • 6.3.2. Ejemplo de programa de tensi髇 para un equipo autom醫ico de electroforesis (2 geles de 5,0 � 4,5 cm), cuyos electrodos sin tiras se aplican directamente al gel

    Etapa	Tensi髇	Intensidad de corriente	Potencia	Temperatura	Voltios-hora
    1.-Pre-enfoque	1 000 V	10,0 mA	3,5 W	8 癈	85 Vh
    2.-Enfoque de la muestra	250 V	5,0 mA	2,5 W	8 癈	30 Vh
    3.-Enfoque	1 200 V	10,0 mA	3,5 W	8 癈	80 Vh
    4.-Enfoque	1 500 V	5,0 mA	7,0 W	8 癈	570 Vh

    
    
    El aplicador de muestra se coloca en la etapa 2 a 0 Vh.
    
    El aplicador de muestra se retira en la etapa 2 a 30 Vh.

  6.4. Tinci髇 de las prote韓as

  6.4.1. Fijaci髇 de las prote韓as

  Se retiran las tiras de los electrodos inmediatamente despu閟 de cortar la corriente y se pone el gel inmediatamente en un recipiente de tinci髇/decoloraci髇 con 200 ml de fijador (4.9); se deja durante 15 minutos, agitando continuamente.

  6.4.2. Lavado y tinci髇 de la placa de gel

  Se escurre totalmente el fijador y se lava la placa de gel dos veces durante 30 segundos cada vez con 100 ml de soluci髇 decolorante (4.10). Se retira la soluci髇 decolorante y se llena el recipiente con 250 ml de soluci髇 colorante (4.11.3); se ti馿 durante 45 minutos con agitaci髇 suave.

  6.4.3. Decoloraci髇 de la placa de gel

  Se retira la soluci髇 colorante, se lava la placa de gel dos veces con 100 ml de soluci髇 decolorante (4.10) cada vez; despu閟 se agita durante 15 minutos con 200 ml de soluci髇 decolorante y se repite la etapa de decoloraci髇 al menos 2 o 3 veces hasta que el fondo se vea claro e incoloro. A continuaci髇, se enjuaga la placa de gel con agua destilada (2 � 2 minutos) y se deja secar al aire (de 2 a 3 horas) o con un secador de pelo (de 10 a 15 minutos).

  Nota 1: la fijaci髇, el lavado, la tinci髇 y la decoloraci髇 se deben realizar a 20 癈. No deben emplearse temperaturas elevadas.

  Nota 2: si se prefiere utilizar una tinci髇 de plata (por ejemplo, Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, C骴igo n.� 17-1150-01), de mayor sensibilidad, las muestras de case韓a tratadas con plasmina deben diluirse a 5 mg/ml.

  7. EVALUACI覰

  La evaluaci髇 se realiza comparando las manchas de prote韓as de la muestra desconocida con los patrones de referencia en el mismo gel. La detecci髇 de leche de vaca en quesos de leche de oveja, leche de cabra y leche de b鷉ala o sus mezclas se realiza por medio de las γ₃- y γ₂-case韓as, cuyos puntos isoel閏tricos se sit鷄n entre los pH 6,5 y 7,5 (figuras 4a, 4b y 5). El l韒ite de detecci髇 es inferior al 0,5 %.

  7.1. Estimaci髇 visual

  Para la evaluaci髇 visual de la cantidad de leche de vaca es conveniente ajustar las concentraciones de las muestras y patrones para obtener el mismo nivel de intensidad de las γ₂- y γ₃-case韓as de oveja, cabra y b鷉ala (v閍se “γ₂ E,G,B” y “γ₃ E,G,B”, en las figuras 4a, 4b y 5). A continuaci髇 podr� evaluarse directamente la cantidad de leche de vaca (menor, igual o mayor que el 1 %) en la muestra desconocida comparando la intensidad de las γ₃- y γ₂-case韓as de vaca (v閍se “γ₃ C” y “γ₂ C” en las figuras 4a, 4b y 5) con las de los patrones de referencia del 0 % y el 1 % (oveja, cabra) o con los patrones provisionales de laboratorio (b鷉ala).

  7.2. Estimaci髇 densitom閠rica

  Cuando sea posible, se aplica la densitometr韆 (5.19) para determinar la relaci髇 de las 醨eas de los picos de las γ₂- y γ₃-case韓as de vaca con respecto a las de oveja, cabra y b鷉ala (v閍se la figura 5). Este valor se compara con la relaci髇 de las 醨eas de los picos de las γ₂- y γ₃-case韓as del patr髇 de referencia del 1 % (oveja, cabra) o del patr髇 provisional de laboratorio (b鷉ala) analizados en el mismo gel.

  Nota: el m閠odo funciona satisfactoriamente si se encuentra una se馻l positiva clara de las dos case韓as de vaca (γ₂ y γ₃) en el patr髇 de referencia del 1 % pero no en el del 0 %. En caso contrario, deber� optimizarse el procedimiento respetando los detalles del m閠odo con precisi髇.

  Una muestra se considerar� positiva cuando las dos case韓as de vaca (γ₂ y γ₃) o las relaciones de las 醨eas de los picos correspondientes sean iguales o superiores al nivel del patr髇 de referencia del 1 %.

  8. BIBLIOGRAF虯

  Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: “Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ₂-caseins”. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

  Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: “A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting”. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

  Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: “Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier”. En: “Electrophoresis-Forum 89” (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, M黱chen (1989).

  Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: “Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -k鋝e durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen”. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

  Radola B.J.: “Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films”. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

  Figura 1

  Esquema de la hoja de cobertura

  

  Figura 2

  Capa de case韓a flotando entre las fases acuosa y org醤ica tras la centrifugaci髇

  

  Figura 3

  T閏nica de inclinaci髇 para moldear geles ultrafinos de poliacrilamida

  

  a = cinta espaciadora (0,25 mm); b = hoja de cobertura (5.3); c, e = placas de vidrio (5.1); d = soluci髇 de gel (4.1.2); f = hoja de soporte de gel (5.2)

  Figura 4a

  Isoelectroenfoque de case韓as tratadas con plasmina de queso elaborado con leche de oveja y cabra con cantidades diferentes de leche de vaca

  

  % CM = porcentaje de leche de vaca, C = vaca, E = oveja, G = cabra

  Se muestra la mitad superior del gel de IEF.

  Figura 4b

  Isoelectroenfoque de case韓as tratadas con plasmina de queso elaborado con mezclas de leche de oveja, cabra y b鷉ala con cantidades diferentes de leche de vaca

  

  % CM = porcentaje de leche de vaca; 1 + = muestra que contiene un 1 % de leche de vaca en la que se ha inyectado case韓a pura de vaca a mitad del recorrido; C = vaca, E = oveja, G = cabra, B = b鷉ala.

  Se muestra la distancia de separaci髇 total del gel de IEF.

  Figura 5

  Superposici髇 de densitogramas de patrones (STD) y muestras de quesos elaborados con una mezcla de leche de oveja y cabra tras el isoelectroenfoque

  

  a, b = patrones con 0 % y 1 % de leche de vaca; c-g = muestras de quesos con 0, 1, 2, 3 y 7 % de leche de vaca; C = vaca, E = oveja, G = cabra.

  La mitad superior del gel de IEF se ley� a λ = 634 nm.

  ANEXO IX
  
  Evaluaci髇 de los an醠isis

  1. Garant韆 de calidad

  Los an醠isis los realizar醤 laboratorios designados de conformidad con el art韈ulo 12 del Reglamento (CE) n.� 882/2004 (13) o que designen las autoridades competentes del Estado miembro.

  2. Muestreo y controversias sobre los resultados de los an醠isis

  1. El muestreo se efectuar� de acuerdo con la normativa aplicable al producto estudiado. En caso de que no se prevean expresamente disposiciones sobre muestreo, se utilizar醤 las disposiciones establecidas en la norma ISO 707: Leche y productos l醕teos. Directrices para la toma de muestras.

  2. Los informes de laboratorio de los resultados de los an醠isis deber醤 incluir suficiente informaci髇 para que se pueda hacer una evaluaci髇 de dichos resultados seg鷑 el ap閚dice.

  3. Para los an醠isis exigidos por la normativa de la Uni髇 se tomar醤 muestras por duplicado.

  4. En caso de controversia sobre los resultados, el organismo pagador har� que se repita el an醠isis necesario del producto de que se trate, debiendo correr con los costes la parte perdedora.

  El an醠isis antes mencionado se efectuar� siempre que se disponga de duplicados sellados de las muestras del producto que hayan sido conservados de forma adecuada por la autoridad competente. El fabricante enviar� una solicitud al organismo pagador para realizar el an醠isis en el plazo de siete d韆s laborables a partir de la notificaci髇 de los resultados del primer an醠isis. El an醠isis deber� realizarlo el organismo pagador en el plazo de veinti鷑 d韆s laborables a partir de la recepci髇 de la solicitud.

  5. El resultado derivado del recurso ser� el definitivo.

  6. Si el fabricante puede demostrar, en el plazo de cinco d韆s laborables desde la fecha del muestreo, que este no se hab韆 efectuado de forma correcta, se repetir� el muestreo siempre que sea posible. Si no puede repetirse el muestreo, se aceptar� el env韔.

  Ap閚dice

  Evaluaci髇 del cumplimiento de un env韔 respecto al l韒ite legal

  1. Principio

  Cuando la normativa aplicable al r間imen de intervenci髇 p鷅lica y al almacenamiento privado establezca procedimientos de muestreo detallados, deber醤 seguirse esos procedimientos. En todos los dem醩 casos se utilizar� una muestra formada por al menos tres unidades de muestra tomadas aleatoriamente del env韔 objeto de control. Podr� prepararse una muestra compuesta. El resultado obtenido se comparar� con los l韒ites legales calculando un intervalo de confianza del 95 % como dos veces la desviaci髇 t韕ica, dependiendo la desviaci髇 t韕ica correspondiente de si: 1) el m閠odo est� validado mediante colaboraci髇 internacional con valores de σ_r y σ_R, o si 2) se ha calculado la reproducibilidad interna en caso de validaci髇 dentro del propio laboratorio. Este intervalo de confianza se iguala entonces a la incertidumbre de la medici髇 del resultado.

  2. El m閠odo est� validado mediante colaboraci髇 internacional

  En este caso, se han establecido la desviaci髇 t韕ica de la repetibilidad σ_r y la desviaci髇 t韕ica de la reproducibilidad σ_R y el laboratorio puede demostrar el cumplimiento con las caracter韘ticas de funcionamiento del m閠odo validado.

  Se calcula la media aritm閠ica de las n mediciones repetidas.

  Se calcula la incertidumbre ampliada (k = 2) de del modo siguiente:

  

  Si el resultado final x de la medici髇 se calcula utilizando una f髍mula del tipo x = y ₁ + y ₂, x = y ₁ - y ₂, x = y ₁ · y ₂ o x = y ₁/y ₂ deber醤 seguirse los m閠odos normales para combinar desviaciones t韕icas en tales casos.

  Se considera que el env韔 no se ajusta al l韒ite superior legal UL si

  

  en caso contrario, se considera que s� cumple el UL.

  Se considera que el env韔 no se ajusta al l韒ite inferior legal LL si

  

  en caso contrario, se considera que s� cumple el LL.

  3. Validaci髇 en el propio laboratorio con c醠culo de la desviaci髇 t韕ica de la reproducibilidad interna

  En caso de que se utilicen m閠odos no especificados en el presente Reglamento y no se hayan establecido medidas de la precisi髇, deber� efectuarse una validaci髇 en el propio laboratorio. En las f髍mulas para calcular la incertidumbre ampliada _U se utilizar醤 la desviaci髇 t韕ica de la repetibilidad interna s_ir y la desviaci髇 t韕ica de la reproducibilidad interna s_i R en lugar de σ_r y σ _R , respectivamente.

  En el punto 1 figuran las normas que deben seguirse para determinar la conformidad con el l韒ite legal. Sin embargo, si se considera que el env韔 no cumple el l韒ite legal, habr� que repetir las mediciones con el m閠odo especificado en el presente Reglamento, y el resultado se evaluar� seg鷑 lo indicado en el punto 1.

  (*) Se ha visto que los productos Ampholine� pH 3,5-9,5 (Pharmacia) y Resolyte� pH 5-7 y pH 6-8 (BDH, Merck) son muy adecuados para conseguir la separaci髇 necesaria de las γ-case韓as.�.