ANEXO I
CEREALES

Los cuadros III y IV de la parte V y la letra b) de la parte VI del anexo I, en lo que atañe a las compras de intervención pública, se aplicarán a partir del 1 de julio de 2017, conforme establece el artículo 67 del presente Reglamento.LE0000580209_20180207

PARTE I

1. DEFINICIÓN DE LOS ELEMENTOS QUE NO SON CEREALES DE BASE DE CALIDAD IRREPROCHABLE

1.1. Granos partidos

En el caso del trigo duro, el trigo blando y la cebada, la definición de «granos partidos» es la que figura en la norma EN 15587.

En el caso del maíz, la definición es la que figura en la norma EN 16378.

1.2. Impurezas constituidas por granos

• a) Granos asurados

  En el caso del trigo duro, el trigo blando y la cebada, la definición de «granos asurados» es la que figura en la norma EN 15587. No obstante, en el caso de la cebada de Estonia, Letonia, Finlandia y Suecia, se consideran «granos asurados» los granos de un peso específico igual o superior a 64 kilogramos por hectolitro ofertados o licitados, o presentados, para intervención en esos Estados miembros que, después de haberse eliminado todos los demás elementos contemplados en el presente anexo, pasen por un tamiz de ranuras de 2,0 milímetros.

  Los granos asurados no se aplican al maíz.

• b) Otros cereales

  En el caso del trigo duro, el trigo blando y la cebada, la definición de «otros cereales» es la que figura en la norma EN 15587.

  En el caso del maíz, la definición es la que figura en la norma EN 16378.

• c) Granos dañados por plagas

  En el caso del trigo duro, el trigo blando y la cebada, la definición de «granos dañados por plagas» es la que figura en la norma EN 15587.

  En el caso del maíz, la definición es la que figura en la norma EN 16378.

• d) Granos con germen coloreado

  En el caso del trigo duro y el trigo blando, la definición es la que figura en la norma EN 15587.

  Los «granos con germen coloreado» no se aplican a la cebada ni al maíz.

• e) Granos recalentados durante el secado

  En el caso del trigo duro, el trigo blando y la cebada, la definición de «granos recalentados durante el secado» es la que figura en la norma EN 15587.

  En el caso del maíz, la definición es la que figura en la norma EN 16378.

• f) Granos atizonados

  En el caso del trigo duro, la definición de «granos atizonados» es la que figura en la norma EN 15587.

  Los granos atizonados no se aplican al trigo blando, ni a la cebada ni al maíz.

1.3. Granos germinados

En el caso del trigo duro, el trigo blando y la cebada, la definición de «granos germinados» es la que figura en la norma EN 15587.

En el caso del maíz, la definición es la que figura en la norma EN 16378.

1.4. Impurezas varias

• a) Granos extraños

  En el caso del trigo duro, el trigo blando y la cebada, la definición de «granos extraños» es la que figura en la norma EN 15587.

  En el caso del maíz, la definición es la que figura en la norma EN 16378.

  Se consideran «granos nocivos» los granos tóxicos para el hombre y los animales, los granos que dificultan o complican la limpieza y la molienda de los cereales y los que modifican la calidad de los productos elaborados con cereales.

• b) Granos dañados

  En el caso del trigo duro, el trigo blando y la cebada, la definición de «granos dañados» es la que figura en la norma EN 15587.

  En el caso del maíz, la definición es la que figura en la norma EN 16378.

  En la norma EN 15587, en el caso del trigo duro, el trigo blando y la cebada, la definición de «granos atacados por Fusarium» está incluida en la de «granos dañados».

• c) Impurezas propiamente dichas

  En el caso del trigo duro, el trigo blando y la cebada, la definición de las «impurezas propiamente dichas» es la que figura en la norma EN 15587.

  En el caso del maíz, la definición es la que figura en la norma EN 16378.

• d) Glumas (en el caso del maíz, fragmentos de zuros)
• e) Cornezuelos
• f) Granos cariados

  En el caso del trigo duro y el trigo blando, la definición de «granos cariados» es la que figura en la norma EN 15587.

  Los «granos cariados» no se aplican a la cebada ni al maíz.

• g) Impurezas de origen animal

1.5. Plagas vivas

1.6. Granos harinosos

Se consideran granos de trigo duro harinosos los granos cuyo endospermo no puede considerarse plenamente vítreo. Están definidos en la norma EN 15585.

2. ELEMENTOS QUE TIENEN QUE TENERSE EN CUENTA EN CADA CEREAL PARA LA DEFINICIÓN DE IMPUREZAS

2.1. Trigo duro

Por impurezas constituidas por granos se entenderá los granos asurados, los granos de otros cereales, los granos dañados por plagas, los granos que presenten coloraciones del germen, los granos atizonados y los granos recalentados durante el secado.

Las impurezas diversas estarán compuestas por granos extraños, granos dañados (incluidos los atacados por Fusarium), impurezas propiamente dichas, glumas, cornezuelo, granos cariados e impurezas de origen animal.

2.2. Trigo blando

Por impurezas constituidas por granos se entenderá los granos asurados, los granos de otros cereales, los granos dañados por plagas, los granos que presenten coloraciones del germen (únicamente si el contenido supera el 8 %) y los granos recalentados durante el secado.

Las impurezas diversas estarán compuestas por granos extraños, granos dañados (incluidos los atacados por Fusarium), impurezas propiamente dichas, glumas, cornezuelo, granos cariados e impurezas de origen animal.

2.3. Cebada

Por impurezas constituidas por granos se entenderá los granos asurados, los granos de otros cereales, los granos dañados por plagas y los granos recalentados durante el secado.

Las impurezas diversas estarán compuestas por granos extraños, granos dañados (incluidos los atacados por Fusarium), impurezas propiamente dichas, glumas e impurezas de origen animal.

2.4. Maíz

Por «impurezas constituidas por granos» se entenderá los granos de otros cereales, los granos dañados por plagas y los granos recalentados durante el secado.

Las «impurezas diversas» estarán compuestas por granos extraños, granos dañados, impurezas propiamente dichas, fragmentos de zuros e impurezas de origen animal.

PARTE II
Métodos utilizados para determinar la calidad de los cereales ofertados o licitados, o presentados, para intervención

Para determinar la calidad de los cereales ofertados o licitados, o presentados, para intervención, se utilizarán, de conformidad con el artículo 4, los métodos siguientes:

• a) el método de referencia para la determinación de los elementos que no son cereales de base de calidad irreprochable, será el constituido por:
  • i) la norma EN 15587 en el caso del trigo blando, el trigo duro y la cebada,
  • ii) la norma EN 16378 en el caso del maíz;
• b) el método de referencia para la determinación del grado de humedad, será el constituido por:
  • i) la norma EN ISO 6540 en el caso del maíz,
  • ii) la norma EN ISO 712 o un método basado en tecnología de infrarrojos que cumpla la norma EN 15948 en el caso de los cereales distintos del maíz.

  En caso de litigio, únicamente se considerarán válidos los resultados obtenidos tras aplicar la norma EN ISO 6540, en el caso del maíz, o la norma EN ISO 712, en el caso de los cereales distintos del maíz;

• c) el método de referencia para determinar que la masa obtenida del trigo blando no se pega y es mecanizable será el descrito en la parte III del presente anexo;
• d) el método de referencia para la determinación del porcentaje de proteínas del grano de trigo duro y de trigo blando triturado será el constituido por:
  • i) la norma EN ISO 20483, o
  • ii) la norma CEN ISO/TS 16634-2.

  En caso de litigio, únicamente se considerarán válidos los resultados obtenidos tras aplicar la norma EN ISO 20483;

• e) el método de referencia para la determinación del índice de Zeleny del trigo blando triturado será el constituido por la norma EN ISO 5529;
• f) el método de referencia para la determinación del índice de caída de Hagberg (prueba de actividad amilásica) será el constituido por la norma EN ISO 3093;
• g) el método de referencia para la determinación del grado de harinosidad del trigo duro será el constituido por la norma EN 15585;
• h) el método de referencia para la determinación del peso específico será el constituido por la norma EN ISO 7971/3;
• i) los métodos de muestreo y de análisis para la determinación de la tasa de micotoxinas serán los contemplados en el anexo del Reglamento (CE) n.º 1881/2006 de la Comisión (20) y fijados en los anexos I y II del Reglamento (CE) n.º 401/2006 de la Comisión (21) .

PARTE III
Método para determinar que la masa obtenida del trigo blando no se pega y es mecanizable

1. Título

Método para el experimento de panificación de la harina de trigo.

2. Campo de aplicación

El método se aplica a las harinas obtenidas mediante molturación experimental de trigo para producir pan fermentado con levadura.

3. Principio

Se prepara una masa con harina, agua, levadura, sal y sacarosa en una mezcladora determinada. Después de dividir y comprimir la masa, los distintos trozos se dejan reposar 30 minutos, se les da forma, se colocan en placas de cocción y se cuecen después de una fermentación final de una duración determinada. Se anotan las propiedades de manejabilidad de la masa. Las piezas de pan se juzgan según su volumen y altura.

4. Ingredientes

4.1. Levadura

Levadura seca activa del tipo Saccharomyces cerevisiae DHW-Hamburg-Wansbeck o un producto que posea las mismas características.

4.2. Agua del grifo

4.3. Solución azucarada y salada de ácido ascórbico

Disolver 30 ± 0,5 g de cloruro de sodio (de calidad comercial), 30 ± 0,5 g de sacarosa (de calidad comercial) y 0,040 ± 0,001 g de ácido ascórbico en 800 ± 5 g de agua. Preparar una solución fresca cada día.

4.4. Solución azucarada

Disolver 5 ± 0,1 g de sacarosa (de calidad comercial) en 95 ± 1 g de agua. Preparar una solución fresca cada día.

4.5. Harina malteada (con actividad enzimática)

De calidad comercial.

5. Equipo y aparatos

5.1. Horno

Con un sistema de regulación que permita mantener la temperatura entre 22 y 25 °C.

5.2. Refrigerador

Para mantener una temperatura de 4 ± 2 °C.

5.3. Balanza

Carga máxima 2 kg, precisión 2 g.

5.4. Balanza

Carga máxima 0,5 kg, precisión 0,1 g.

5.5. Balanza analítica

Precisión 0,1 × 10^{- 3} g.

5.6. Mezcladora

Stephan UMTA 10, con una fresadora del tipo «Detmold» (Stephan Soehne GmbH) o un aparato similar que posea las mismas características.

5.7. Cámara de fermentación

Con un sistema de regulación que permita mantener una temperatura de 30 ± 1 °C.

5.8. Cajas de plástico abiertas

Fabricadas con polimetilmetacrilato (Plexiglas, Perspex), con unas dimensiones interiores de 25 × 25 cm, una altura de 15 cm y unas paredes con un espesor de 0,5 ± 0,05 cm.

5.9. Placas de plástico cuadradas

De polimetilmetacrilato (Plexiglas, Perspex). De al menos 30 × 30 cm y de un espesor de 0,5 ± 0,05 cm.

5.10. Compresora

Compresora Brabender (Brabender OHG) o un aparato similar que posea las mismas características.

6. Toma de muestras

Según la norma EN ISO 24333.

7. Procedimiento

7.1. Determinación de la hidratación

La absorción de agua se determina según la norma ICC n.º 115/1.

7.2. Determinación de la adición de harina malteada

Determinar el «índice de caída» de la harina según la norma EN ISO 3093. Si el «índice de caída» fuese superior a 250, determinar la cantidad de harina de malta que se deberá añadir para obtener un índice de caída entre 200 y 250, utilizando una serie de mezclas de harina con cantidades cada vez mayores de harina malteada (punto 4.5). Si el índice de caída fuese inferior a 250, no será necesario añadir harina malteada.

7.3. Reactivación de la levadura seca activa

Ajustar la temperatura de la solución azucarada (punto 4.4) a 35 ± 1 °C. Verter una parte en peso de la levadura seca activa en cuatro partes en peso de esta solución azucarada templada. No agitar. Remover ligeramente si es necesario.

Dejar reposar durante 10 ± 1 minuto. A continuación agitar hasta obtener una suspensión homogénea. Utilizar dicha suspensión en los 10 minutos siguientes.

7.4. Ajuste de las temperaturas de la harina y de los ingredientes líquidos

Las temperaturas de la harina y del agua deben ajustarse para que, al final del mezclado, la temperatura de la masa sea de 27 ± 1 °C.

7.5. Composición de la masa

Pesar, con una precisión de 2 g, 10 y/3 g de harina tal como esté (que corresponda a 1 kg de harina con un 14 % de contenido de agua) en la que «y» es la cantidad de harina utilizada en la prueba del farinógrafo (véase la norma ICC n.º 115/1).

Pesar con una precisión de 0,2 g, la cantidad de harina malteada necesaria para que el índice de caída se sitúe entre 200 y 250 (punto 7.2).

Pesar 430 ± 5 g de solución azucarada y salada de ácido ascórbico (punto 4.3) y añadir agua para obtener una masa total de (x - 9) 10 y/3 g, siendo x (véase el punto 10.2) la cantidad de agua utilizada en la prueba del farinógrafo (véase la norma ICC n.º 115/1). Dicha masa total (habitualmente comprendida entre 450 y 650 g) deberá determinarse con una precisión de 1,5 g.

Pesar 90 ± 1 g de suspensión de levadura (punto 7.3).

Anotar la masa total de la masa (P) que resulte de la suma de las masas de harina, de la solución azucarada y salada de ácido ascórbico más agua, de la suspensión de levadura y de la harina malteada.

7.6. Mezclado

Antes de empezar, calentar la mezcladora a una temperatura de 27 ± 1 °C utilizando una cantidad suficiente de agua templada.

Verter los ingredientes líquidos en la mezcladora, después esparcir por la superficie la harina y la harina malteada.

Poner en marcha la mezcladora (primera velocidad, 1 400 revoluciones/minuto), dejarla girar durante sesenta segundos. Veinte segundos después del comienzo del mezclado, girar dos veces la espátula de la tapadera de la cuba de la mezcladora.

Medir la temperatura de la masa. Si no estuviera comprendida entre 26 y 28 °C, tirar la masa y elaborar una nueva después de haber ajustado las temperaturas de los ingredientes.

Anotar las propiedades de la masa utilizando una de las expresiones siguientes:

• - no se pega y es mecanizable, o
• - se pega y no es mecanizable.

Para poder considerar que no se pega y es mecanizable al final del mezclado, la masa debe formar un todo coherente que prácticamente no se adhiera a las paredes de la cuba, ni al eje de la mezcladora; deberá poder ser fácilmente recogida con las manos, y retirada de la cuba de una sola vez, sin pérdidas apreciables.

7.7. División y compresión

Pesar, con una precisión de 2 g, tres trozos de masa con arreglo a la fórmula:

p = 0,25 P, en la que:

• p = masa del trozo de masa,
• P = masa total de la masa.

Comprimir inmediatamente los trozos de masa durante 15 segundos en la compresora (punto 5.10) y colocarlos a continuación durante 30 ± 2 minutos en las placas de plástico (punto 5.9) recubiertas por las cajas de plástico puestas al revés (punto 5.8) en la cámara de fermentación (punto 5.7).

No utilizar harina espolvoreada.

7.8. Elaboración

Colocar los trozos de masa que se encuentran en las placas de plástico recubiertas por las cajas puestas al revés, cerca de la compresora (punto 5.10) y volver a comprimir cada pieza durante 15 segundos. La tapadera que protege el trozo de masa se retirará justo antes de la comprensión. Anotar nuevamente las propiedades de la masa utilizando una de las dos expresiones siguientes:

• a) no se pega y es mecanizable, o
• b) se pega y no es mecanizable.

Para poder considerar que no se pega y que es mecanizable durante el funcionamiento del aparato, la masa solo se adherirá un poco, o nada en absoluto, a las paredes de la cámara, de forma que el trozo de masa tenga un perfecto movimiento de rotación sobre sí mismo, que permita formarse la bola de masa. Al final de la operación, la masa no deberá pegarse a las paredes de la cámara de compresión en el momento en que se levante la tapadera.

8. Informe del ensayo

El informe del ensayo mencionará:

• a) las propiedades de manejabilidad de la masa al final del mezclado y de la elaboración;
• b) el índice de caída de la harina sin adición de harina malteada;
• c) todas las anomalías observadas;
• d) el método utilizado;
• e) todas las referencias necesarias para la identificación de la muestra.

9. Observaciones generales

9.1. La fórmula para el cálculo de la cantidad de los ingredientes líquidos se basa en las siguientes consideraciones:

Una adición de x ml de agua al equivalente de 300 g de harina con un 14 % de humedad proporciona la consistencia deseada. Como en la prueba de panificación se utiliza 1 kg de harina (que alcance hasta un 14 % de contenido en agua) mientras que x se basa en 300 g de harina, es necesario utilizar en la prueba de panificación x dividido por 3 y multiplicado por 10 gramos de agua, es decir 10 x/3 g.

Los 430 g de la solución azucarada y salada de ácido ascórbico contienen 15 g de sal y 15 g de azúcar. Dichos 430 g de solución están incluidos en los ingredientes líquidos. Así pues, para añadir 10 x/3 g de agua a la masa, deben añadirse (10 x/3 + 30) g de ingredientes líquidos, compuestos de 430 g de la solución azucarada y salada de ácido ascórbico y de una cantidad adicional de agua.

Aunque una parte del agua adicionada con la suspensión de levadura sea absorbida por la levadura, dicha suspensión contiene también agua libre. Se supone arbitrariamente que los 90 g de suspensión de levadura contienen 60 g de agua libre. Así pues, debe aplicarse una corrección de 60 g a la cantidad de ingredientes líquidos, con el fin de tener en cuenta el agua libre de la suspensión de levadura, de modo que, finalmente, deben añadirse 10 x/3 g más 30 menos 60 g. Esto puede reformularse como sigue: (10 x/3 + 30) - 60 = 10 x/3 - 30 = (x/3 - 3) 10 = (x - 9) 10/3, es decir, la fórmula del punto 7.5. Si, por ejemplo, la cantidad de agua x, utilizada en la prueba del farinógrafo es de 165 ml, se sustituye este valor en la fórmula, si bien los 430 g de solución azucarada y salada de ácido ascórbico deben aumentarse hasta una masa total de:

(165 - 9) 10/3 = 156 × 10/3 = 520 gramos.

9.2. Este método no es aplicable directamente al trigo. El procedimiento que deberá seguirse para caracterizar el valor panificable de un trigo es el siguiente:

Limpiar la muestra de trigo y determinar el grado de humedad del trigo limpio. No acondicionar el trigo si su grado de humedad está comprendido entre 15,0 y 16,0 %. En caso contrario, ajustar el grado de humedad a 15,5 ± 0,5 %, al menos tres horas antes de la molturación.

Se le extrae la harina utilizando los molinillos de laboratorio Buehler MLU 202 o Brabender Quadrumat Senior, o cualquier otro aparato similar que posea las mismas características.

Escoger un diagrama de molturación de forma que se obtenga, con un índice mínimo de extracción de un 72 %, una harina cuyo contenido de ceniza esté comprendido entre el 0,50 % y el 0,60 % de la materia seca.

Determinar el contenido de cenizas de la harina según el anexo II del Reglamento (UE) n.º 234/2010 de la Comisión (22) y el grado de humedad de acuerdo con el presente Reglamento. Calcular el índice de extracción según la ecuación:

E = (((100 - f) F)/(100 - w) W) × 100 %

en la que:

• E = índice de extracción,
• f = humedad de la harina,
• w = grado de humedad del trigo,
• F = masa de la harina producida con un grado de humedad f,
• W = masa de trigo molturada con un grado de humedad w.

Nota: Las precisiones relativas a los ingredientes y los aparatos utilizados figuran en el documento T/77 300, de 31 de marzo de 1977, publicado por el Instituut voor Graan, Meel en Brood, TNO, Postbus 15, Wageningen (Países Bajos).

PARTE IV
Metodología de muestreo y análisis de cereales

1. Las características cualitativas de cada lote de cereales se comprobarán basándose en una muestra representativa del lote ofertado, formada por muestras tomadas al ritmo de una muestra por cada entrega y por, al menos, cada 60 toneladas.

2. Los métodos de referencia que deben utilizarse para determinar la calidad de los cereales ofertados o licitados, o presentados, para intervención son los establecidos en las partes I, II y III del presente anexo.

3. En caso de litigio, el organismo pagador volverá a someter los cereales de que se trate a las pruebas necesarias y los gastos correspondientes correrán a cargo de la parte perdedora.

PARTE V
Bonificaciones y depreciaciones

Cuadro I

Cuadro II

Cuadro III

Cuadro IV

PARTE VI
Cálculo de las bonificaciones y depreciaciones

Los ajustes de precio previstos en el artículo 26, apartado 1, se expresarán en euros por tonelada en el caso de las ofertas o licitaciones para intervención, multiplicando el precio contemplado en dicho artículo por la suma de los porcentajes de bonificación y depreciación establecidos, según se indica a continuación:

• a) cuando el grado de humedad de los cereales ofertados o licitados para intervención sea inferior al 12,0 %, en el caso del maíz, y al 12,5 %, en el caso de los demás cereales, se aplicarán las bonificaciones indicadas en el cuadro I de la parte V del presente anexo; cuando el grado de humedad de dichos cereales ofertados o licitados para intervención sea superior al 12,5 %, en el caso del maíz, y al 13,0 %, en el caso de los demás cereales, se aplicarán las depreciaciones indicadas en el cuadro II de la parte V del presente anexo;
• b) cuando el contenido de proteínas del trigo blando sea superior al 12,0 %, se aplicarán las bonificaciones indicadas en el cuadro III de la parte V del presente anexo; cuando el contenido de proteínas del trigo blando sea inferior al 11,5 %, se aplicarán las depreciaciones indicadas en el cuadro IV de la parte V del presente anexo,

ANEXO II
ARROZ

PARTE I
Metodología de muestreo y análisis del arroz con cáscara

1. Con miras a la verificación de los requisitos de calidad establecidos en el anexo II, parte I, del Reglamento Delegado (UE) 2016/1238, el organismo pagador tomará muestras en presencia del agente económico o de un representante suyo debidamente autorizado.

Se tomarán tres muestras representativas, cada una de las cuales pesará como mínimo un kilogramo, destinadas, respectivamente:

• a) al agente económico;
• b) al lugar de almacenamiento donde vaya a efectuarse la recepción;
• c) al organismo pagador.

El número de muestras individuales que deben tomarse para constituir las muestras representativas será el que resulte de dividir por diez toneladas la cantidad del lote. Cada muestra individual tendrá el mismo peso. Las muestras representativas estarán constituidas por la suma de las muestras individuales dividida por tres.

La verificación de los requisitos de calidad se hará con la muestra representativa destinada al almacén donde vaya a tener lugar la recepción.

2. Se tomarán muestras representativas de cada entrega parcial (camión, gabarra, vagón) en las condiciones fijadas en el punto 1.

El examen de cada entrega parcial podrá limitarse, antes de su entrada en el almacén de la intervención, a una comprobación del grado de humedad, del índice de impurezas y de la ausencia de insectos vivos. Sin embargo, si posteriormente el resultado final de la comprobación es que una entrega parcial no reúne los requisitos mínimos de calidad, la cantidad de que se trate será rechazada. Si el organismo pagador está en condiciones de controlar todos los requisitos mínimos de calidad de cada entrega parcial antes de la entrada en almacén, rechazará las entregas parciales que no cumplan esos requisitos.

3. El control del nivel de contaminación radiactiva del arroz solo se efectuará si la situación lo exige y durante un período limitado.

4. En caso de litigio, el organismo pagador volverá a someter el arroz con cáscara de que se trate a las pruebas necesarias y los gastos correspondientes correrán a cargo de la parte perdedora.

El organismo pagador encargará a un laboratorio autorizado por él un nuevo análisis, que se efectuará con una nueva muestra representativa constituida, a partes iguales, por muestras conservadas por el agente económico y por el organismo pagador. En los casos en los que se hayan efectuado entregas parciales del lote licitado, el resultado se expresará como media ponderada de los resultados de los análisis de las nuevas muestras representativas tomadas en cada entrega parcial.

PARTE II
Bonificaciones y depreciaciones

1. Los ajustes de precio previstos en el artículo 26, apartado 1, se expresarán en euros por tonelada y se aplicarán a las licitaciones para intervención multiplicando el precio mencionado en dicho artículo por la suma de los porcentajes de bonificación establecidos en los cuadros I, II y III de la presente parte.

2. Las bonificaciones y depreciaciones se aplicarán sobre la base de la media ponderada de los resultados de los análisis de las muestras representativas definidas en la parte I del presente anexo.

ANEXO III
CARNE DE VACUNO

PARTE I
Condiciones y controles de recepción

1. La recepción de los productos entregados estará supeditada a la verificación por el organismo pagador de que satisfacen los requisitos establecidos en el anexo III, parte I, del Reglamento Delegado (UE) 2016/1238. En particular, deberá efectuarse un control sistemático de la presentación, clasificación, peso y etiquetado de las canales, medias canales y cuartos entregados.

2. El incumplimiento de los requisitos establecidos en el anexo III, parte I, del Reglamento Delegado (UE) 2016/1238 dará lugar al rechazo de la recepción. Los productos rechazados no podrán ser presentados de nuevo para su aceptación.

3. El organismo pagador registrará sistemáticamente el resultado de los controles descritos en el punto 1.

PARTE II
Coeficientes de conversión

PARTE III
Deshuesado

I. Condiciones generales de deshuesado

1. El deshuesado solo podrá efectuarse en salas de despiece autorizadas y que funcionen de acuerdo con los requisitos del Reglamento (CE) n.º 853/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo (26) .

2. A los efectos del presente Reglamento, por «operaciones de deshuesado» se entenderán las operaciones materiales para el sector de la carne de vacuno contempladas en el anexo II del Reglamento Delegado (UE) n.º 906/2014.

3. Los cortes deshuesados deberán cumplir los requisitos establecidos en la parte IV del presente anexo.

II. Contratos y pliegos de condiciones

1. El deshuesado se llevará a cabo en virtud de contratos cuyas cláusulas serán fijadas por los organismos pagadores, de acuerdo con sus pliegos de condiciones y con arreglo a los requisitos del presente Reglamento.

2. Los pliegos de condiciones de los organismos pagadores establecerán los requisitos exigibles a las salas de despiece, especificarán las instalaciones y los equipos necesarios e indicarán las condiciones detalladas aplicables a las operaciones de deshuesado.

Indicarán, en particular, las condiciones detalladas que especifiquen el método de preparación, recorte, embalaje, congelación y conservación de los cortes con vistas a su recepción por parte del organismo pagador.

III. Control y seguimiento de las operaciones de deshuesado

Los organismos pagadores adoptarán todas las medidas necesarias para garantizar que las operaciones de deshuesado se efectúen con arreglo a los requisitos del presente Reglamento y a los contratos y pliegos de condiciones descritos en la sección II de la presente parte.

En particular, los organismos pagadores instaurarán un sistema que garantice el continuo seguimiento y verificación de todas las operaciones de deshuesado, cuyos resultados serán registrados.

IV. Almacenamiento de los cortes

Los cortes se almacenarán en almacenes frigoríficos situados en el territorio del Estado miembro del que dependa el organismo pagador.

V. Gastos de las operaciones de deshuesado

Los contratos contemplados en la sección II de la presente parte y los pagos correspondientes a los mismos cubrirán los gastos de las operaciones de deshuesado contempladas en la sección I, punto 2, de la presente parte.

VI. Plazos para las operaciones de deshuesado

Las operaciones de deshuesado, recorte, pesaje, embalaje y congelación rápida deberán finalizarse en los diez días naturales siguientes al sacrificio. No obstante, los organismos pagadores podrán fijar plazos más cortos.

VII. Controles y rechazo de los productos

1. Cuando como consecuencia de los controles previstos en la sección III de la presente parte, se constate que los productos no cumplen los requisitos establecidos en el presente Reglamento ni los contratos y pliegos de condiciones descritos en la sección II de la presente parte, dichos productos serán rechazados.

2. Sin perjuicio de la aplicación de sanciones, los organismos pagadores reclamarán a las partes responsables pagos por un importe igual al precio contemplado en la parte V del presente anexo por los cortes que hayan sido rechazados.

PARTE IV
Instrucciones para el deshuesado de carne de intervención

1. CUARTOS TRASEROS

1.1. Descripción de las piezas

1.1.1. Jarrete de intervención (código INT 11)

Corte y deshuesado: separar mediante un corte que atraviese la articulación femoro-tibiarotuliana y despegar de la tapa y la contratapa siguiendo la dirección natural del músculo; dejar la culata de contra unida al jarrete, quitar los huesos del jarrete (tibia, peroné y calcáneo).

Recorte: recortar los extremos de los tendones de manera que queden pegados a la carne.

Envasado y embalaje: estas piezas deberán ser individualmente envueltas antes de ser embaladas en cajas de cartón.

1.1.2. Babilla de intervención (código INT 12)

Corte y deshuesado: separar de la tapa mediante un corte recto hacia abajo y siguiendo la línea del fémur y, a partir de la contratapa, siguiendo la fibra natural de la carne. La tapilla deberá permanecer unida.

Recorte: quitar la rótula con su cápsula y tendón. La capa externa de grasa no deberá superar 1 centímetro en ningún punto.

1.1.3. Tapa de intervención (código INT 13)

Corte y deshuesado: separar de la contratapa y el jarrete mediante un corte que siga la fibra natural de la carne; separar del fémur; quitar la sínfisis isquio-pubiana.

Recorte: quitar la base del pene con el cartílago y las ternillas que lo rodean, y la glándula escrotal (superficial inguinal). Quitar el cartílago y los tejidos conjuntivos unidos al hueso pelviano. La capa externa de grasa no deberá superar 1 centímetro en ningún punto.

1.1.4. Contratapa de intervención (código INT 14)

Corte y deshuesado: separar de la tapa y el jarrete mediante un corte que siga la fibra natural de la carne; quitar el fémur.

Recorte: quitar el gran cartílago que se halla unido a la articulación del hueso; quitar el ganglio linfático popliteo, la grasa que lo rodea y el tendón. La capa externa de grasa no deberá superar 1 centímetro en ningún punto.

1.1.5. Solomillo de intervención (código INT 15)

Corte: el solomillo deberá ser obtenido en toda su longitud separando la parte más gruesa del hueso ilíaco y despegándolo progresivamente del resto de las vértebras, separándolo del lomo.

Recorte: quitar las glándulas y desgrasar. Dejar la fascia muscular y la cadena muscular intactas y unidas.

1.1.6. Cadera de intervención (código INT 16)

Corte y deshuesado: esta pieza deberá separarse de la contratapa y la babilla mediante un corte recto iniciado en un punto situado aproximadamente a 5 centímetros de la parte posterior de la quinta vértebra sacra, pasando por otro punto situado a unos 5 centímetros de la sínfisis isquiopubiana, teniendo cuidado de no desgarrar la babilla.

Separar del lomo mediante un corte entre la última vértebra lumbar y la primera vértebra sacra, despejando el borde anterior del hueso pélvico. Quitar los huesos y cartílagos.

Recorte: separar la bolsa de grasa de la superficie interior del músculo largo dorsal. La capa externa de grasa no deberá superar 1 centímetro en ningún punto.

1.1.7. Lomo de intervención (código INT 17)

Corte y deshuesado: esta pieza deberá separarse de la cadera mediante un corte recto entre la última vértebra lumbar y la primera vértebra sacra. Deberá separarse del entrecot (cinco costillas) mediante un corte recto entre la décima y la undécima costilla. Quitar limpiamente la espina dorsal. Las costillas y partes de la columna que contienen la apófisis deberán quitarse en una sola pieza.

Recorte: quitar todos los pedazos de cartílago que quedan una vez finalizada la operación de deshuesado. Quitar los tendones. La capa externa de grasa no deberá superar 1 centímetro en ningún punto.

1.1.8. Falda del costillar de intervención (código INT 18)

Corte y deshuesado: separar toda la falda del cuarto trasero desde el corte recto a la altura de la octava costilla, cortando desde el punto en el que se despegue, siguiendo la fibra natural de la carne en torno a la superficie de los músculos traseros, hasta un punto paralelo a la mitad de la última vértebra lumbar.

Seguir cortando hacia abajo en línea recta, de forma paralela al solomillo, desde la decimotercera a la sexta costilla, inclusive, en línea paralela al borde dorsal de la columna vertebral, de forma que el corte no se halle a más de 5 centímetros del extremo lateral del músculo dorsal.

Quitar todos los huesos y cartílagos en una sola capa. La falda deberá quedar en una sola pieza.

Recorte: eliminar la capa de tejido conjuntivo que cubre la grasa pectoral dejando esta grasa intacta. Recortar la grasa de forma que el porcentaje global de grasa visible (externa e intersticial) no supere el 30 %.

1.1.9. Entrecot de intervención (cinco costillas) (código INT 19)

Corte y deshuesado: esta pieza deberá separarse del lomo mediante un corte recto entre la décima y la undécima costilla y deberá incluir las costillas sexta y décima (inclusive). Quitar los músculos intercostales y la pleura de una sola vez junto con las costillas. Quitar la espina dorsal y los cartílagos, así como la punta de la escápula.

Recorte: quitar la espina dorsal. La capa externa de grasa no deberá superar 1 centímetro en ningún punto. La cápsula deberá permanecer unida.

2. CUARTOS DELANTEROS

2.1. Descripción de las piezas

2.1.1. Morcillo de intervención (código INT 21)

Corte y deshuesado: separar mediante un corte siguiendo la articulación que separa el radio y el húmero. Quitar el radio.

Recorte: recortar los extremos de los tendones de manera que queden pegados a la carne.

Los morcillos no deben ser embalados junto con los jarretes.

2.1.2. Paleta de intervención (código INT 22)

Corte y deshuesado: separar la paleta del cuarto delantero cortando en una línea que siga la fibra natural del músculo, alrededor de los bordes de la paleta y el cartílago de prolongación de la escápula, siguiendo la dirección natural. Quitar la escápula. El músculo que se halla debajo de la escápula deberá ser parcialmente despegado, aunque no separado del todo, para permitir un deshuesado más limpio. Quitar el húmero.

Recorte: quitar los cartílagos con sus cápsulas y tendones. Recortar la grasa de forma que el porcentaje global de grasa visible (externa e intersticial) no supere el 10 %.

2.1.3. Pecho de intervención (código INT 23)

Corte y deshuesado: separar del cuadro delantero mediante un corte recto, siguiendo una línea perpendicular a la mitad de la primera costilla. Quitar los músculos intercostales y la pleura junto con las costillas, el esternón y los cartílagos. La cobertura deberá permanecer unida. Deberá separarse la grasa situada debajo de la cobertura, así como la situada debajo del esternón.

Recorte: recortar la grasa de forma que el porcentaje global de grasa visible (externa e intersticial) no supere el 30 %.

2.1.4. Cuarto delantero de intervención (código INT 24)

Corte y deshuesado: la pieza restante tras la separación del pecho, la espalda y el morcillo se clasifica como cuarto delantero.

Los huesos costales han de quitarse de una sola vez y los del cuello, limpiamente.

La cadena muscular (longus colli) debe permanecer unida a esta pieza.

Recorte: quitar los tendones con sus cápsulas y cartílagos. Recortar la grasa de forma que el porcentaje global de grasa visible (externa e intersticial) no supere el 10 %.

PARTE V
Precios individuales de los cortes de intervención rechazados

ANEXO IV
MANTEQUILLA

PARTE I
Muestreo para el análisis químico y microbiológico y la evaluación organoléptica

1. Análisis químico y microbiológico

El muestreo para el análisis microbiológico debe realizarse en condiciones de asepsia.

Pueden combinarse hasta cinco muestras de 100 g en una sola muestra, que se analizará previa homogeneización completa.

Las muestras deben tomarse aleatoriamente de distintas partes de cada lote antes o en el momento de entrar en el almacén frigorífico designado por el organismo pagador.

Preparación de la muestra de mantequilla compuesta (análisis químico):

• a) utilizando una sonda para mantequilla, limpia y seca, u otro instrumento adecuado similar, extraer una porción de mantequilla de 30 g como mínimo y colocarla en un recipiente de muestras; la muestra compuesta debe precintarse y enviarse al laboratorio para su análisis;
• b) en el laboratorio, la muestra compuesta se calienta a 30 ^oC en el recipiente original sin abrir, agitándola frecuentemente hasta obtener una emulsión fluida homogénea, libre de partículas duras; la muestra debe ocupar entre la mitad y dos tercios del recipiente.

De cada productor que presente mantequilla para intervención, deben analizarse dos muestras al año para comprobar la grasa no láctea.

2. Evaluación organoléptica

Tras un período de prueba de almacenamiento de treinta días, las muestras deben tomarse aleatoriamente de diferentes partes de cada lote entre 30 y 45 días después de la entrega de la mantequilla, y clasificarse.

Cada muestra debe evaluarse por separado. No se permite repetir la toma de muestra ni la evaluación.LE0000613811_20180207Párrafo segundo del número 2 del anexo IV redactado por el apartado 1.a) del anexo del Reglamento de Ejecución (UE) 2018/150 de la Comisión, de 30 de enero de 2018, por el que se modifica el Reglamento de Ejecución (UE) 2016/1240 en lo que se refiere a los métodos para el análisis y la evaluación de la calidad de la leche y de los productos lácteos que pueden optar a la intervención pública y a la ayuda para el almacenamiento privado («D.O.U.E.L.» 31 enero).Vigencia: 7 febrero 2018

3. Directrices en caso de detección de defectos en la muestra

a) Análisis químico y microbiológico:

• i) Cuando se analicen muestras individuales, podrá autorizarse la presencia de una muestra con un solo defecto por cada 5 a 10 muestras, o dos muestras con un solo defecto cada una por cada 11 a 15 muestras. En caso de que una muestra presente un defecto, deberán tomarse dos nuevas muestras a cada lado de la muestra defectuosa y se controlará el parámetro defectuoso. Si ninguna de estas dos muestras cumple las condiciones mínimas, deberá rechazarse de la cantidad ofertada la cantidad de mantequilla que se encuentre entre las dos muestras originales a cada lado de la muestra defectuosa.

  Cantidad que debe rechazarse en caso de defecto de la nueva muestra:

  

• ii) Cuando se analicen muestras compuestas, en caso de que una muestra compuesta presente un defecto respecto a un parámetro, la cantidad representada por dicha muestra compuesta se rechazará de la cantidad ofertada. La cantidad representada por una muestra compuesta puede determinarse por subdivisión de la cantidad, antes de someter cada parte por separado a un muestreo aleatorio.

b) Evaluación organoléptica: Cuando una muestra obtenga un mal resultado en la evaluación organoléptica, se rechazará de la cantidad del lote la cantidad de mantequilla situada entre las dos muestras adyacentes a cada lado de la muestra que haya dado el mal resultado.

c) En caso de que se detecte en las muestras un defecto organoléptico y un defecto químico o un defecto microbiológico, se rechazará toda la cantidad.

PARTE II bis
Métodos de análisis de la mantequilla sin salar para la intervención pública

Tabla de valoración

LE0000613811_20180207Parte I bis del anexo IV introducida por el apartado 1.b) del anexo del Reglamento de Ejecución (UE) 2018/150 de la Comisión, de 30 de enero de 2018, por el que se modifica el Reglamento de Ejecución (UE) 2016/1240 en lo que se refiere a los métodos para el análisis y la evaluación de la calidad de la leche y de los productos lácteos que pueden optar a la intervención pública y a la ayuda para el almacenamiento privado («D.O.U.E.L.» 31 enero).Vigencia: 7 febrero 2018

PARTE II
Entrega y embalaje de la mantequilla

1. La mantequilla se entregará en bloques y empaquetada en envases nuevos, de materiales resistentes, concebidos para protegerla durante las operaciones de transporte, entrada en almacén, almacenamiento y retirada de almacén.

2. Los envases incluirán, como mínimo, las siguientes indicaciones, que podrán codificarse, en su caso:

• a) el número de autorización que permita identificar la fábrica y el Estado miembro de producción;
• b) la fecha de producción;
• c) el número del lote de fabricación y el número del paquete; el número del paquete podrá sustituirse por el número de palé que figure en este último;
• d) la indicación «nata dulce», si la mantequilla tiene un pH igual o superior a 6,2.

3. El almacenista llevará un registro en el que los elementos mencionados en el punto 2 se registren en la fecha de entrada en almacén.

ANEXO V
LECHE DESNATADA EN POLVO

PARTE I
Muestreo y análisis de la leche desnatada en polvo ofertada para intervención

1. Las muestras por lote se tomarán según el procedimiento establecido por la Norma Internacional ISO 707. No obstante, los organismos pagadores podrán utilizar otro método de toma de muestras, siempre que se atenga a los principios de dicha norma.

2. Número de envases que deberán seleccionarse para tomar muestras para su análisis:

• a) lotes de hasta 800 sacos de 25 kg: ocho, como mínimo;
• b) lotes de más de 800 sacos de 25 kg: al menos ocho, más uno por cada 800 sacos o fracción adicional.

3. Peso de la muestra: se recogerán muestras de al menos 200 g de cada envase.

4. Agrupación de las muestras: se reunirán como máximo nueve muestras en una muestra global.

5. Análisis de las muestras: cada muestra global se someterá a un análisis mediante el cual se puedan comprobar todas las características cualitativas enumeradas en el anexo V, parte II, del Reglamento Delegado (UE) 2016/1238.

6. En caso de muestras defectuosas:

• a) si una muestra compuesta resulta defectuosa en relación con un parámetro, se rechazará la cantidad representada por dicha muestra;
• b) si una muestra compuesta resulta defectuosa en relación con varios parámetros, se rechazará la cantidad representada por dicha muestra y se efectuará un segundo muestreo del resto de las cantidades del mismo centro de fabricación; el análisis de estas muestras será decisivo; en tal caso:
  • - se duplicará el número de muestras indicado en el punto 2,
  • - si una muestra compuesta resulta defectuosa en relación con uno o varios parámetros, se rechazará la cantidad representada por dicha muestra.

PARTE I bis
Métodos de análisis de la leche desnatada en polvo para la intervención pública

Apéndice I
LECHE DESNATADA EN POLVO: DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FOSFATIDILSERINA Y DE FOSFATIDILETANOLAMINA

Método: HPLC en fase inversa

1. OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN

El presente método describe un procedimiento de determinación del contenido de fosfatidilserina (FS) y fosfatidiletanolamina (FE) de la leche desnatada en polvo (LDP) y permite detectar en ella la presencia de sólidos de suero de mantequilla.

2. DEFINICIÓN

Contenido de FS + FE: porcentaje en de masa de la substancia determinada mediante la aplicación del presente procedimiento. El resultado se expresa en miligramos de dipalmitoil-fosfatidiletanolamina- (DPFE) por 100 g de leche en polvo.

3. PRINCIPIO DEL MÉTODO

Extracción de los aminofosfolípidos, por medio de metanol, de la leche en polvo reconstituida. Determinación del contenido de FS y FE en forma de derivados de o-Ftaldialdehído (OFA) mediante HPLC en fase inversa y detección por fluorescencia. Determinación del contenido de FS y FE en la muestra problema por referencia a una muestra patrón que contiene una cantidad conocida de DPEF.

4. REACTIVOS

Todos los reactivos deben ser de pureza analítica reconocida. El agua utilizada debe ser agua destilada o de pureza al menos equivalente, salvo que se indique lo contrario.

4.1. Material de referencia: DPEF de una pureza mínima del 99 %

Nota: el material de referencia deberá almacenarse a - 18 °C.

4.2. Reactivos para la preparación de la muestra patrón y de la muestra problema

• 4.2.1. Metanol de grado HPLC
• 4.2.2. Cloroformo de grado HPLC
• 4.2.3. Monoclorhidrato de triptamina

4.3. Reactivos para la obtención del derivado de o-ftaldialdehído

• 4.3.1. Hidróxido de sodio, solución acuosa 12 M
• 4.3.2. Ácido bórico, solución acuosa 0,4 M, ajustada a pH 10,0 por medio de hidróxido de sodio (4.3.1)
• 4.3.3. 2-Mercaptoetanol
• 4.3.4. o-Ftaldialdehído (OFA)

4.4. Disolventes de elución de HPLC

• 4.4.1. Los disolventes de elución deberán prepararse con reactivos de grado HPLC
• 4.4.2. Agua de grado HPLC
• 4.4.3. Metanol de pureza fluorimétrica comprobada
• 4.4.4. Tetrahidrofurano
• 4.4.5. Fosfato de sodio y dihidrógeno
• 4.4.6. Acetato sódico
• 4.4.7. Ácido acético

5. INSTRUMENTAL

• 5.1. Balanza analítica, capaz de pesar con una precisión de 1 mg y con una legibilidad de 0,1 mg.
• 5.2. Vasos de precipitados de 25 y 100 ml de capacidad
• 5.3. Pipetas que permitan medir entre 1 y 10 ml
• 5.4. Agitador magnético
• 5.5. Pipetas graduadas que permitan medir 0,2, 0,5 y 5 ml
• 5.6. Matraces aforados de 10, 50 y 100 ml de capacidad
• 5.7. Jeringas de 20 y 100 μl de capacidad
• 5.8. Baño ultrasónico
• 5.9. Centrifugadora que funcione a 27 000 g
• 5.10. Frascos de vidrio de unos 5 ml de capacidad
• 5.11. Probeta de 25 ml de capacidad
• 5.12. pH-metro, con una precisión de 0,1 unidades de pH
• 5.13. Equipo HPLC
  • 5.13.1. Sistema de bombeo de gradiente capaz de funcionar a razón de 1,0 ml/min a 200 bar
  • 5.13.2. Automuestreador con capacidad para formar derivados
  • 5.13.3. Calentador de columna, capaz de mantenerla a 30 °C ± 1 °C
  • 5.13.4. Detector de fluorescencia capaz de funcionar con una longitud de onda de excitación de 330 nm y una longitud de onda de emisión de 440 nm
  • 5.13.5. Integrador o programa de tratamiento de datos capaz de medir el área de los picos
  • 5.13.6. Columna de LiChrospher® - 100 (250 × 4,6 mm) o una columna equivalente rellena de octadecilsilano (C 18) con una granulometría de 5 μm

6. MUESTREO

El muestreo deberá realizarse con arreglo a la norma ISO 707.

7. PROCEDIMIENTO

7.1. Preparación de la solución de patrón interno

7.1.1. Se pesan 30,0 ± 0,1 mg de monoclorhidrato de triptamina (4.2.3) en un matraz aforado de 100 ml (5.6) y se enrasa con metanol (4.2.1).

7.1.2. Se pasa con la pipeta (5.3) 1 ml de esta solución a un matraz aforado de 10 ml (5.6) y se enrasa con metanol (4.2.1) con el fin de obtener una solución de triptamina 0,15 mM.

7.2. Preparación de la solución de muestra problema

7.2.1. Se pesa 1,000 ± 0,001 g de la muestra problema de LDP en un vaso de precipitados de 25 ml (5.2). Se añaden 10 ml de agua destilada a 40 °C ± 1 °C con una pipeta (5.3) y se agita con el agitador magnético (5.4) durante 30 minutos para disolver los grumos.

7.2.2. Se pasan con la pipeta (5.5) 0,2 ml de la leche reconstituida a un matraz aforado de 10 ml (5.6), se añaden 100 μl de solución de triptamina 0,15 mM (7.1) con una jeringa (5.7) y se enrasa con metanol (4.2.1). Se mezcla cuidadosamente por inversión y se somete a ultrasonidos (5.8) durante 15 minutos.

7.2.3. Se centrifuga (5.9) a 27 000 g durante 10 minutos y se recoge la solución sobrenadante en un frasco de vidrio (5.10).

Nota: la solución de muestra problema debe almacenarse a 4 °C hasta que se proceda al análisis por HPLC.

7.3. Preparación de la solución de patrón externo

7.3.1. Se pesan 55,4 mg de DPEF (4.1) en un matraz aforado de 50 ml (5.6) y se añaden unos 25 ml de cloroformo (4.2.2) con una probeta (5.11). Se calienta el matraz con tapón a 50 °C ± 1 °C y se mezcla a fondo hasta que se disuelva el DPEF. Se enfría el matraz hasta 20 °C, se enrasa con metanol (4.2.1) y se mezcla por inversión.

7.3.2. Se pasa con pipeta (5.3) 1 ml de esta solución a un matraz aforado de 100 ml (5.6) y se enrasa con metanol (4.2.1). Se pasa con pipeta (5.3) 1 ml de esta solución a un matraz aforado de 10 ml (5.6), se añaden con una jeringa (5.7) 100 μl de solución de triptamina 0,15 mM (7.1) y se enrasa con metanol (4.2.1). Se mezcla por inversión.

Nota: la solución de la muestra de referencia debe almacenarse a 4 °C hasta que se proceda al análisis por HPLC.

7.4. Preparación del reactivo de derivación

Se pesan 25,0 ± 0,1 mg de OFA (4.3.4) en un matraz aforado de 10 ml (5.6), se añaden con una pipeta graduada (5.5) 0,5 ml de metanol (4.2.1) y se mezcla bien hasta disolver el OFA. Se enrasa con la solución de ácido bórico (4.3.2) y se añaden 20 μl de 2-mercaptoetanol (4.3.3) con una jeringa (5.7).

Nota: el reactivo de derivación debe conservarse a 4 °C en un frasco de vidrio topacio; permanece estable durante una semana.

7.5. Determinación mediante HPLC

7.5.1. Disolventes de elución (4.4)

Disolvente A: solución de fosfato de sodio y dihidrógeno 0,3 mM y de acetato de sodio 3 mM (ajustada a un pH de 6,5 ± 0,1 por medio de ácido acético): metanol: tetrahidrofurano en una proporción de 558:440:2 (v/v/v)

Disolvente B: metanol

7.5.2. Gradiente de elución preconizado:

Nota: el gradiente de elución podrá requerir una ligera modificación con vistas a la obtención de la resolución indicada en la figura 1.

Temperatura de la columna: 30 °C

7.5.3. Volumen de inyección: 50 μl de reactivo de derivación y 50 μl de solución de la muestra

7.5.4. Equilibrado de la columna

El sistema se pone en marcha a diario. Se llena la columna con disolvente B al 100 % durante 15 minutos y, a continuación, se regula la proporción a A:B = 40:60 y se equilibra a 1 ml/min durante 15 minutos. Se efectúa un ciclo en blanco inyectando metanol (4.2.1).

Nota: antes de su almacenamiento a largo plazo, lavar la columna con metanol y cloroformo en una proporción de 80: 20 (v/v) durante 30 minutos.

7.5.5. Determinación del contenido de FS y FE de la muestra problema

7.5.6. Se efectúa la secuencia de análisis cromatográficos sin modificar el tiempo entre ciclos con el fin de obtener períodos de retención constantes. Se inyecta la solución de patrón externo (7.3) cada 5-10 soluciones de muestra problema a fin de calcular el factor de respuesta.

Nota: la columna debe lavarse con disolvente B al 100 % (7.5.1) durante al menos 30 minutos cada 20-25 ciclos.

7.6. Modo de integración

7.6.1. Pico del DPEF

El DPEF se eluye en forma de un solo pico. Se determina el área del pico mediante la integración de valle a valle.

7.6.2. Pico de la triptamina

La triptamina se eluye en forma de un solo pico (figura 1). Se determina el área del pico mediante la integración de valle a valle.

7.6.3. Grupos de picos de FS y FE

En las condiciones descritas (figura 1), la FS se eluye en forma de dos picos principales parcialmente no resueltos precedidos de un pico menor. La FE se eluye en forma de tres picos parcialmente no resueltos. Hay que determinar la superficie total de cada grupo de picos estableciendo la línea de base tal como se indica en la figura 1.

8. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

El contenido de FS y FE de la muestra problema se calculará como sigue:

C = 55,36 × ((A₂)/(A₁)) × ((T₁)/(T₂))

siendo:

C el contenido de FS o FE (mg/100 g de leche en polvo) en la muestra problema

A₁ el área del pico de DPEF de la solución de muestra patrón (7.3)

A₂ el área del pico de FS o FE de la solución de muestra problema (7.2)

T₁ el área del pico de triptamina de la solución de muestra patrón (7.3)

T₂ el área del pico de triptamina de la solución de muestra problema (7.2).

9. EXACTITUD DEL MÉTODO

Nota: los valores relativos a la repetibilidad se han calculado de acuerdo con la norma internacional FIL (32).

9.1. Repetibilidad

La desviación típica relativa de la repetibilidad, que expresa la variabilidad de los resultados de análisis independientes obtenidos por un mismo analista utilizando el mismo equipo en las mismas condiciones y con la misma muestra problema, durante un breve lapso de tiempo, no debe sobrepasar un 2 % en valor relativo. En caso de que se proceda a dos determinaciones en esas condiciones, la diferencia relativa entre ambos resultados no deberá sobrepasar el 6 % de la media aritmética de los resultados.

9.2. Reproducibilidad

En caso de que se efectúen dos determinaciones por parte de analistas de distintos laboratorios, utilizando equipos distintos y en distintas condiciones para el análisis de la misma muestra problema, la diferencia relativa entre ambos resultados no deberá sobrepasar el 11 % de la media aritmética de los resultados.

10. BIBLIOGRAFÍA

10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., “Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids”. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).

Figura 1

Perfil de HPLC de los derivados OFA de la fosfatidilserina (FS) y de la fosfatidiletanolamina (FE) contenidos en el extracto metanólico de la leche desnatada en polvo reconstituida. Se indica el modo de integración de los picos de FS, FE y triptamina (patrón interno)

Apéndice II
DETECCIÓN DE SUERO DE CUAJO EN LA LECHE DESNATADA EN POLVO DESTINADA AL ALMACENAMIENTO PÚBLICO MEDIANTE DETERMINACIÓN DE LOS CASEINOMACROPÉPTIDOS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)

1. OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN

Este método permite detectar la presencia de suero de cuajo en la leche desnatada en polvo destinada al almacenamiento público mediante determinación de los caseinomacropéptidos (CMP).

2. REFERENCIA

Norma Internacional ISO 707: Leche y productos lácteos. Directrices para la toma de muestras.

3. DEFINICIÓN

El contenido en sólidos de suero de cuajo se define como el porcentaje en masa determinado por el contenido en caseinomacropéptidos mediante el procedimiento descrito.

4. PRINCIPIO

• - Reconstitución de la leche desnatada en polvo, eliminación de las materias grasas y las proteínas con ácido tricloroacético, y centrifugación o filtración.
• - Determinación de la cantidad de caseinomacropéptidos (CMP) presentes en el sobrenadante por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
• - Evaluación del resultado obtenido con las muestras en relación con muestras patrón constituidas por leche desnatada en polvo con o sin adición de un porcentaje conocido de suero de leche en polvo.

5. REACTIVOS

Todos los reactivos deben ser de pureza analítica reconocida. El agua utilizada debe ser agua destilada o un agua de pureza al menos equivalente.

5.1. Solución de ácido tricloroacético

Se disuelven 240 g de ácido tricloroacético (CCl₃COOH) en agua y se completa hasta 1 000 ml. La solución debe ser clara e incolora.

5.2. Solución eluyente, pH 6,0

Se disuelven 1,74 g de fosfato de hidrógeno y dipotasio (K₂HPO₄), 12,37 g de fosfato de dihidrógeno y potasio (KH₂PO₄) y 21,41 g de sulfato de sodio (Na₂SO₄) en unos 700 ml de agua. Se ajusta, si es necesario, a pH 6,0 con ayuda de una solución de ácido fosfórico o de hidróxido de potasio.

Completar hasta 1 000 ml con agua y homogeneizar.

Nota: la composición del eluyente se puede modificar para ajustarla al certificado de los patrones o a las recomendaciones del fabricante del material de relleno de la columna.

Antes de utilizarla, se filtra la solución eluyente a través de un filtro de membrana con un diámetro de poro de 0,45 μm.

5.3. Solución de lavado

Se mezcla un volumen de acetonitrilo (CH₃CN) con nueve volúmenes de agua. Antes de utilizarla, se filtra la mezcla a través de un filtro de membrana con un diámetro de poro de 0,45 μm.

Nota: Puede utilizarse cualquier otra solución de lavado que tenga un efecto bactericida y que no altere la eficiencia de resolución de las columnas.

5.4. Muestras patrón

5.4.1. Leche desnatada en polvo que responda a las exigencias del presente Reglamento, o sea [0].

5.4.2. La misma leche desnatada en polvo adulterada con un 5 % (m/m) de suero tipo cuajo en polvo de composición normal, o sea [5].

6. INSTRUMENTAL

6.1. Balanza analítica

6.2. Centrifugadora optativa que pueda alcanzar una aceleración de 2 200 g, provista de tubos de centrífuga con tapón o capucha, de unos 50 ml de capacidad

6.3. Agitador mecánico

6.4. Agitador magnético

6.5. Embudos de vidrio de unos 7 cm de diámetro

6.6. Filtros de papel de filtración media, de unos 12,5 cm de diámetro

6.7. Dispositivo de filtración de vidrio provisto de membrana filtrante de 0,45 μm de diámetro de poro

6.8. Pipetas graduadas que permitan medir 10 ml (ISO 648, clase A, o ISO R/835) o un sistema capaz de introducir 10,0 ml en 2 minutos

6.9. Sistema capaz de introducir 20,0 ml de agua a unos 50 °C

6.10. Baño María termostatizado a 25 ± 0,5 °C

6.11. Equipo de HPLC que comprenda lo siguiente:

• 6.11.1. Bomba
• 6.11.2. Inyector, manual o automático, de 15 a 30 μl de capacidad
• 6.11.3. Dos columnas en serie TSK 2 000-SW (30 cm de longitud, 0,75 cm de diámetro interior) o columnas equivalentes (por ejemplo, una sola TSK 2 000-SWxl, una sola Agilent Technologies Zorbax GF 250) y una precolumna (3 cm × 0,3 cm) rellena de I 125 o de un material de eficacia equivalente
• 6.11.4. Horno de columna termostatizado a 35 ± 1 °C
• 6.11.5. Detector por luz ultravioleta de longitud de onda variable, que permita efectuar mediciones de 205 mm de una sensibilidad de 0,008 Å
• 6.11.6. Integrador que pueda integrar de valle a valle

Nota: Se puede trabajar con columnas mantenidas a temperatura ambiente, pero su poder de resolución es ligeramente menor. En este caso, las variaciones de temperatura durante una misma serie de análisis deberán ser inferiores a ± 5 °C.

7. MUESTREO

7.1. Las muestras se tomarán según el procedimiento establecido por la Norma Internacional ISO 707. No obstante, los Estados miembros podrán utilizar otro método de toma de muestras, siempre que se atenga a los principios de la norma antes citada.

7.2. La muestra se debe conservar en condiciones que eviten cualquier deterioro o modificación de su composición.

8. PROCEDIMIENTO

8.1. Preparación de la muestra problema

Se pasa la leche en polvo a un recipiente de capacidad aproximadamente doble del volumen de la leche en polvo, provisto de tapadera hermética al aire. Se cierra el recipiente inmediatamente. Se mezcla bien la leche en polvo invirtiendo varias veces el recipiente.

8.2. Porción analítica

Se pesan 2,000 ± 0,001 g de la muestra problema y se pasan a un tubo de centrífuga (6.2) o a un matraz apropiado con tapón (50 ml).

8.3. Eliminación de la grasa y las proteínas

8.3.1. Se añaden 20,0 ml de agua tibia (50 °C) a la porción analítica. Se disuelve el polvo agitando durante 5 minutos con ayuda del agitador mecánico (6.3). Se coloca el tubo en el baño María (6.10) y se deja que se equilibre a 25 °C.

8.3.2. Se añaden, en 2 minutos, 10,0 ml de la solución de ácido tricloroacético (5.1) a unos 25 °C, agitando enérgicamente con el agitador magnético (6.4). Se coloca el tubo en el baño María (6.10) y se deja durante 60 minutos.

8.3.3. Se centrifuga (6.2) durante 10 minutos a 2 200 g, o se pasa a través de un filtro de papel (6.6), desechando los primeros 5 ml del filtrado.

8.4. Determinación cromatográfica

8.4.1. Se inyectan de 15 a 30 μl, medidos con exactitud, de sobrenadante o de filtrado (8.3.3) en el aparato de HPLC (6.11) regulado a un caudal de 1,0 ml de solución eluyente (5.2) por minuto.

Nota 1. Puede utilizarse otro caudal, en función del diámetro interior de las columnas empleadas o de las instrucciones del fabricante de la columna.

Nota 2. En cada interrupción, enjuagar las columnas con agua. Nunca se debe dejar en ellas la solución eluyente (5.2).

Antes de toda interrupción superior a 24 horas, enjuagar las columnas con agua y después lavarlas con la solución (5.3) durante por lo menos 3 horas con un caudal de 0,2 ml por minuto.

8.4.2. Los resultados del análisis cromatográfico de la muestra problema [E] se obtienen en forma de un cromatograma en el que cada pico se identifica por su tiempo de retención RT, de la forma siguiente:

La calidad de las columnas elegidas puede influir mucho en los tiempos de retención de los diferentes picos.

El integrador (6.11.6) calcula automáticamente la superficie A de cada pico:

Con el fin de detectar las eventuales anomalías debidas ya sea a un mal funcionamiento del equipo o de las columnas, ya sea al origen y naturaleza de la muestra analizada, es fundamental observar el aspecto de cada cromatograma antes de pasar a la interpretación cuantitativa.

En caso de duda, ha de repetirse el análisis.

8.5. Calibración

8.5.1. Se aplica exactamente a las muestras patrón (5.4) el procedimiento descrito desde el punto 8.2 al punto 8.4.2.

Deben utilizarse soluciones recién preparadas, pues los CMP se degradan en medio con tricloroacético al 8 %. La pérdida se estima en 0,2 % por hora a 30 °C.

8.5.2. Antes de proceder a la determinación cromatográfica de las muestras, se acondicionan las columnas mediante inyecciones repetidas de la solución (8.5.1) de la muestra patrón (5.4.2) hasta que la superficie y el tiempo de retención del pico correspondiente a los CMP sean constantes.

8.5.3. Se determinan los factores de respuesta R inyectando el mismo volumen de filtrados (8.5.1) utilizado para las muestras.

9. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

9.1. Modo de cálculo y fórmulas

9.1.1. Cálculo de los factores de respuesta R:

siendo:

siendo:

9.1.2. Cálculo del área relativa de los picos de la muestra [E]

S_II[E] = R_II × A_II[E]

S_III[E] = R_III × A_III[E]

S_IV[E] = R_IV × A_IV[E]

siendo:

9.1.3. Cálculo del tiempo de retención relativo del pico III de la muestra [E]:

RRT_III[E] = (RT_III[E])/(RT_III[5])

siendo:

9.1.4. Por la experimentación, se ha visto que existe una relación lineal entre el tiempo de retención relativo del pico III, es decir, RRT_III [E] y el porcentaje de suero en polvo añadido hasta el 10 %.

• - El RRT_III [E] es < 1,000 si el contenido de suero es > 5 %.
• - El RRT_III [E] es ≥ 1,000 si el contenido de suero es ≤ 5 %.

La incertidumbre admitida para los valores de RRT_III es ± 0,002.

Normalmente, el valor de RRT_III [0] es poco diferente de 1,034. Según el estado de las columnas, el valor puede aproximarse a 1,000, pero siempre será superior a esta cifra.

9.2. Cálculo del porcentaje de suero de cuajo en polvo presente en la muestra:

W = S_III[E] - [1, 3 + (S_III[0] - 0, 9)]

siendo:

9.3. Exactitud del método

9.3.1. Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o en un breve intervalo de tiempo por el mismo analista, empleando los mismos aparatos y la misma muestra, no debe exceder del 0,2 % (m/m).

9.3.2. Reproducibilidad

La diferencia entre dos resultados particulares e independientes obtenidos en dos laboratorios diferentes, con la misma muestra, no debe exceder del 0,4 % (m/m).

9.4. Interpretación

9.4.1. Se acepta que no existe suero si el área relativa del pico III, S_III [E], expresada en gramos de suero de cuajo por 100 g de producto, es ≤ 2,0 + (S_III[0] - 0,9),

siendo

9.4.2. Si el área relativa del pico III, S_III [E], es > 2,0 + (S_III [0] - 0,9) y el área relativa del pico II, S_II [E] ≤ 160, se determina el contenido en suero de cuajo como se indica en el punto 9.2.

9.4.3. Si el área relativa del pico III, S_III [E], es > 2,0 + (S_III [0] - 0,9) y el área relativa del pico II, S_II [E] ≤ 160, se determina el contenido en proteínas totales (P %); se examinan luego los gráficos 1 y 2.

9.4.3.1. Los datos obtenidos tras el análisis de muestras de leches desnatadas en polvo no adulteradas, con alto contenido en proteínas totales, se reúnen en los gráficos 1 y 2.

La línea continua representa la regresión lineal, cuyos coeficientes se calculan mediante el método de los mínimos cuadrados.

La recta de trazo discontinuo determina el límite superior del área relativa del pico III, con una probabilidad de que no se sobrepasa en el 90 % de los casos.

Las ecuaciones de las rectas que aparecen con trazo discontinuo en los gráficos 1 y 2 son las siguientes:

respectivamente, siendo:

Estas ecuaciones son equivalentes a la cifra 1,3 mencionada en el número 9.2.

La diferencia (T₁ y T₂) entre el área relativa S_III [E] hallada y el área relativa S_III viene dada por las relaciones siguientes: T₁ = S_III[E] - [(0,376 P% - 10,7) + (S_III[0] - 0,9)]T₂ = S_III[E] - [(0,0123 S_II[E] + 0,93) + (S_III[0] - 0,9)]

9.4.3.2.

El contenido en suero de cuajo existente se calculará mediante la fórmula siguiente: W = T₂ + 0,91

siendo:

0,91 la distancia sobre el eje vertical entre la línea de trazo continuo y la recta de trazo discontinuo.

Apéndice III
DETERMINACIÓN DE LOS SÓLIDOS DE SUERO DE CUAJO EN LA LECHE DESNATADA EN POLVO

1. OBJETO: DETECCIÓN DE LA ADICIÓN DE SÓLIDOS DE SUERO DE CUAJO A LA LECHE DESNATADA EN POLVO

2. REFERENCIAS: NORMA INTERNACIONAL ISO 707

3. DEFINICIÓN

El contenido en sólidos de suero de cuajo se define como el porcentaje en masa determinado por el contenido en caseinomacropéptido mediante el procedimiento descrito.

4. PRINCIPIO

Las muestras se analizan para detectar la presencia de caseinomacropéptido A por el procedimiento de cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase inversa (procedimiento HPLC). El resultado se evalúa por comparación con muestras patrón constituidas por leche desnatada en polvo con y sin un porcentaje conocido de suero en polvo. Un resultado superior al 1 % (m/m) indica la presencia de sólidos de suero de cuajo.

5. REACTIVOS

Todos los reactivos deben ser de pureza analítica reconocida. El agua utilizada debe ser agua destilada o agua de pureza al menos equivalente. El acetonitrilo debe ser de calidad espectroscópica o adecuada para HPLC.

5.1. Solución de ácido tricloroacético

Se disuelven 240 g de ácido tricloroacético (CCl₃COOH) en agua y se completa hasta 1 000 ml. La solución debe ser clara e incolora.

5.2. Eluyentes A y B

Eluyente A: se introducen, en un matraz aforado de 1 000 ml, 150 ml de acetonitrilo (CH₃CN), 20 ml de isopropanol (CH₃CHOHCH₃) y 1,00 ml de ácido trifluoroacético (TFA, CF₃COOH). Se enrasa con agua a 1 000 ml.

Eluyente B: se introducen, en un matraz aforado de 1 000 ml, 550 ml de acetonitrilo, 20 ml de isopropanol y 1,00 ml de TFA. Se enrasa con agua a 1 000 ml. Antes de utilizarla, se filtra la solución eluyente a través de un filtro de membrana con un diámetro de poro de 0,45 μm.

5.3. Conservación de la columna

Tras los análisis, la columna se lava con el eluyente B (mediante un gradiente) y a continuación se lava con acetonitrilo (mediante un gradiente durante 30 minutos). La columna se conserva en acetonitrilo.

5.4. Muestras patrón

5.4.1. Leche desnatada en polvo que se ajuste a los requisitos aplicables al almacenamiento público (es decir [0]).

5.4.2. La misma leche desnatada en polvo adulterada con 5 % (m/m) de suero tipo cuajo en polvo de composición normal, o sea [5].

5.4.3. La misma leche desnatada en polvo adulterada con 50 % (m/m) de suero tipo cuajo en polvo de composición normal, o sea [50].

6. INSTRUMENTAL

6.1. Balanza analítica

6.2. Centrifugadora optativa que pueda alcanzar una aceleración de 2 200 g, provista de tubos de centrífuga con tapón o capucha, de unos 50 ml de capacidad

6.3. Agitador mecánico

6.4. Agitador magnético

6.5. Embudos de vidrio de unos 7 cm de diámetro

6.6. Filtros de papel de filtración media, de unos 12,5 cm de diámetro

6.7. Dispositivo de filtración de vidrio provisto de membrana filtrante de 0,45 μm de diámetro de poro

6.8. Pipetas graduadas que permitan medir 10 ml (ISO 648, clase A, o ISO/R 835) o un sistema capaz de introducir 10,0 ml en 2 minutos

6.9. Sistema capaz de introducir 20,0 ml de agua a unos 50 °C

6.10. Baño María termostatizado a 25 ± 0,5 °C

6.11. Equipo de HPLC que comprenda lo siguiente:

• 6.11.1. Sistema de bombeo de gradiente binario
• 6.11.2. Inyector, manual o automático, con capacidad de 100 μl
• 6.11.3. Columna Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (25 cm de longitud; 0,46 cm de diámetro interior) o una columna equivalente de fase inversa de poro grueso, a base de sílice
• 6.11.4. Horno de columna termostatizado a 35 ± 1 °C
• 6.11.5. Detector de luz ultravioleta de longitud de onda variable, que permita tomar medidas a 210 nm (de ser necesario, puede utilizarse una longitud de onda mayor, hasta 220 nm), con una sensibilidad de 0,02 Å.
• 6.11.6. Integrador que pueda efectuar la integración a una línea base común o de valle a valle

Nota: se puede trabajar con la columna a temperatura ambiente, con tal de que esta no fluctúe en más de 1 °C; de no cumplirse esta condición, se produce una variación excesiva del tiempo de retención del CMP_A.

7. MUESTREO

7.1. Las muestras se tomarán según el procedimiento establecido por la Norma Internacional ISO 707. No obstante, los Estados miembros podrán utilizar otro método de toma de muestras, siempre que se atenga a los principios de la norma antes citada.

7.2. La muestra se debe conservar en condiciones que eviten cualquier deterioro o modificación de su composición.

8. PROCEDIMIENTO

8.1. Preparación de la muestra problema

Se pasa la leche en polvo a un recipiente de capacidad aproximadamente doble del volumen de la leche en polvo, provisto de tapadera hermética al aire. Se cierra el recipiente inmediatamente. Se mezcla bien la leche en polvo invirtiendo varias veces el recipiente.

8.2. Porción analítica

Se pesan 2,00 ± 0,001 g de la muestra problema en un tubo de centrífuga (6.2) o en un matraz apropiado con tapón (50 ml).

Nota: si se trata de una mezcla, debe pesarse una cantidad de muestra problema tal que la porción de muestra desengrasada corresponda a 2,00 g.

8.3. Eliminación de la grasa y las proteínas

8.3.1. Se añaden 20,0 ml de agua tibia (50 °C) a la porción analítica. Se disuelve el polvo agitando durante 5 minutos con ayuda del agitador mecánico (6.3). Se coloca el tubo en el baño María (6.10) y se deja que se equilibre a 25 °C.

8.3.2. Se añaden en 2 minutos, de forma constante, 10,0 ml de solución de ácido tricloroacético a 25 °C (5.1) a la vez que se agita vigorosamente con el agitador magnético (6.4). Se coloca el tubo en el baño María (6.10) y se deja durante 60 minutos.

8.3.3. Se centrifuga (6.2) durante 10 minutos a 2 200 g, o se pasa a través de un filtro de papel (6.6), desechando los primeros 5 ml del filtrado.

8.4. Determinación cromatográfica

8.4.1. El método HPLC en fase inversa excluye la posibilidad de falsos positivos debidos a la presencia de suero de mantequilla ácida en polvo.

8.4.2. Antes de llevar a cabo el análisis por HPLC en fase inversa, deben optimizarse las condiciones de gradiente. Un tiempo de retención de 26 ± 2 minutos para el CMP _A es óptimo para sistemas de gradiente con un volumen muerto de unos 6 ml (volumen desde el punto en que confluyen los disolventes hasta el volumen del circuito de inyección, incluido este último). Para los sistemas de gradiente con un volumen muerto inferior (por ejemplo, 2 ml) debe emplearse un tiempo de retención óptimo de 22 minutos.

Se toman soluciones de las muestras patrón (5.4) con y sin un 50 % de suero de cuajo.

Se inyectan 100 μl de sobrenadante o filtrado (8.3.3) en el aparato de HPLC, que deberá funcionar en las condiciones de gradiente de exploración que figuran en el cuadro 1.

Cuadro 1

Condiciones de gradiente de exploración para la optimización de la cromatografía

La situación del pico del CMP_Α se obtendrá por comparación de los dos cromatogramas.

Mediante la fórmula indicada a continuación puede calcularse la composición inicial del disolvente que ha de utilizarse para el gradiente normal (véase 8.4.3) % B = 10 - 2,5 + (13,5 + (RT_cmpA - 26) / 6) × 30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RT_cmpA - 26) / 6) × 1,101

Siendo:

8.4.3. Se toman soluciones de las muestras problema

Se inyectan 100 μl de sobrenadante o filtrado (8.3.3), medidos con exactitud, en el aparato de HPLC que funcionará con un caudal de 1,0 ml de solución de eluyente (5.2) por minuto.

La composición del eluyente al iniciarse el análisis se obtiene de 8.4.2. Normalmente suele estar cerca de A:B = 76:24 (5.2). Inmediatamente después de la inyección se inicia un gradiente lineal que da lugar, al cabo de 27 minutos, a un porcentaje de B superior en un 5 %. A continuación comienza un gradiente lineal por el cual la composición del eluyente alcanza el 90 % de B en 5 minutos. Esta composición se mantiene durante 5 minutos, transcurridos los cuales la composición se modifica mediante un gradiente lineal para alcanzar en 5 minutos la composición inicial. Dependiendo del volumen interno del sistema de bombeo, la siguiente inyección puede llevarse a cabo 15 minutos después de haberse alcanzado las condiciones iniciales.

Nota 1. El tiempo de retención del CMP_A debe ser de 26 ± 2 minutos. Puede conseguirse variando las condiciones iniciales y finales del primer gradiente. Sin embargo, la diferencia de % B entre las condiciones iniciales y finales del primer gradiente se mantendrá en 5 % B.

Nota 2. Los eluyentes deben desgasificarse suficientemente y mantenerse desgasificados. Ello es esencial para que el sistema de bombeo por gradiente pueda funcionar correctamente. La desviación típica del tiempo de retención del pico del CMP_A debe ser inferior a 0,1 minutos (n = 10).

Nota 3. Cada 5 muestras debe inyectarse la muestra de referencia [5] y emplearse para calcular un nuevo factor de respuesta R (9.1.1).

8.4.4. Los resultados del análisis cromatográfico de la muestra problema (E) se obtienen en forma de cromatograma en el que el pico del CMP_A se identifica por su tiempo de retención de unos 26 minutos.

El integrador (6.11.6) calcula automáticamente la altura H del pico del CMP_A. La situación de la línea de base debe comprobarse en cada cromatograma. Hay que repetir el análisis o la integración si la línea de base está situada incorrectamente.

Nota: si el pico del CMP_A está separado suficientemente de los otros picos, debe aplicarse la asignación de la línea de base valle a valle; en caso contrario, hay que trazar perpendiculares a una línea de base común, cuyo punto de inicio debe estar próximo al pico del CMP_A (por tanto, ¡no a t = 0 min!). Para el patrón y las muestras hay que utilizar el mismo tipo de integración y comprobar, en el caso de una línea de base común, su coherencia en relación con las muestras y el patrón.

Con el fin de detectar las anomalías eventuales debidas ya sea a un mal funcionamiento del aparato o de la columna, ya sea al origen y naturaleza de la muestra analizada, es fundamental observar el aspecto de cada cromatograma antes de efectuar la interpretación cuantitativa. En caso de duda, ha de repetirse el análisis.

8.5. Calibración

8.5.1. Aplicar a las muestras patrón (5.4.1 y 5.4.2) el procedimiento desde el punto 8.2 al 8.4.4, exactamente tal y como se describe. Hay que utilizar soluciones recién preparadas, pues los CMP se degradan en medio de ácido tricloroacético al 8 % a temperatura ambiente. A 4 °C, la solución permanece estable durante 24 horas. Cuando se realice una larga serie de análisis, es recomendable emplear una bandeja refrigerada para las muestras en el inyector automático.

Nota: el punto 8.4.2 puede omitirse si el % B en las condiciones iniciales se conoce por análisis previos.

El cromatograma de la muestra patrón [5] debería ser análogo al representado en la figura 1. Aquí, el pico del CMP_A viene precedido por dos picos pequeños. Es imprescindible obtener una separación similar.

8.5.2. Antes de proceder a la determinación cromatográfica de las muestras, se inyectan 100 μl de la muestra patrón sin suero de cuajo [0] (5.4.1).

El cromatograma no debe presentar ningún pico al tiempo de retención del pico del CMP_A.

8.5.3. Se determinan los factores de respuesta R inyectando el mismo volumen de filtrado (8.5.1) utilizado para las muestras.

9. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

9.1. Modo de cálculo y fórmulas

9.1.1. Cálculo del factor de respuesta R:

Pico del CMP_A: R = W/H

Siendo:

9.2. Cálculo del porcentaje de suero de cuajo en polvo presente en la muestra

W(E) = R × H(E)

Siendo:

Si W(E) es superior al 1 % y la diferencia entre el tiempo de retención de la muestra y el de la muestra patrón [5] es inferior a 0,2 minutos, se confirma la presencia de sólidos de suero de cuajo.

9.3. Exactitud del método

9.3.1. Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o en un breve intervalo de tiempo por el mismo analista, empleando los mismos aparatos y la misma muestra, no debe exceder del 0,2 % (m/m).

9.3.2. Reproducibilidad

No determinada.

9.3.3. Linealidad

Entre 0 y 16 % de suero de cuajo, debe obtenerse una relación lineal con un coeficiente de correlación > 0,99.

9.4. Interpretación

El límite del 1 % incluye la incertidumbre debida a la reproducibilidad.

Figura 1

Patrón Ni-4.6

LE0000613811_20180207Parte I bis del anexo V introducida por el apartado 2) del anexo del Reglamento de Ejecución (UE) 2018/150 de la Comisión, de 30 de enero de 2018, por el que se modifica el Reglamento de Ejecución (UE) 2016/1240 en lo que se refiere a los métodos para el análisis y la evaluación de la calidad de la leche y de los productos lácteos que pueden optar a la intervención pública y a la ayuda para el almacenamiento privado («D.O.U.E.L.» 31 enero).Vigencia: 7 febrero 2018

PARTE II
Entrega y envasado de la leche desnatada en polvo

1. La leche desnatada en polvo se envasará en sacos nuevos de papel, limpios, secos e intactos, que satisfagan los requisitos siguientes:

• a) los sacos se compondrán de un mínimo de tres capas que en conjunto correspondan a un mínimo de 420 J/m² TEA media;
• b) la segunda capa estará recubierta de una capa de polietileno de 15 g/m² como mínimo;
• c) en el interior de las capas de papel, se encontrará un saco de polietileno de un espesor mínimo de 0,08 mm, soldado en el fondo;
• d) los sacos se ajustarán a la norma EN 770;
• e) al llenar los sacos, la leche en polvo deberá comprimirse bien. Se habrá de evitar absolutamente la penetración de leche en polvo entre las diferentes capas.

2. Los sacos incluirán las siguientes indicaciones, que podrán codificarse, en su caso:

• a) el número de autorización que permita identificar la fábrica y el Estado miembro de producción;
• b) la fecha o, en su caso, la semana de producción;
• c) el número del lote de producción;
• d) la denominación «leche desnatada en polvo spray».

3. El almacenista llevará un registro en el que los elementos mencionados en el punto 2 se registren en la fecha de entrada en almacén.

ANEXO VI
Métodos de análisis de la mantequilla objeto de almacenamiento privado

LE0000613811_20180207Anexo VI introducido por el apartado 3) del anexo del Reglamento de Ejecución (UE) 2018/150 de la Comisión, de 30 de enero de 2018, por el que se modifica el Reglamento de Ejecución (UE) 2016/1240 en lo que se refiere a los métodos para el análisis y la evaluación de la calidad de la leche y de los productos lácteos que pueden optar a la intervención pública y a la ayuda para el almacenamiento privado («D.O.U.E.L.» 31 enero).Vigencia: 7 febrero 2018

ANEXO VII
Métodos de análisis de la leche desnatada en polvo objeto de almacenamiento privado

LE0000613811_20180207Anexo VII introducido por el apartado 3) del anexo del Reglamento de Ejecución (UE) 2018/150 de la Comisión, de 30 de enero de 2018, por el que se modifica el Reglamento de Ejecución (UE) 2016/1240 en lo que se refiere a los métodos para el análisis y la evaluación de la calidad de la leche y de los productos lácteos que pueden optar a la intervención pública y a la ayuda para el almacenamiento privado («D.O.U.E.L.» 31 enero).Vigencia: 7 febrero 2018

ANEXO VIII
Métodos de análisis de los quesos objeto de almacenamiento privado

1. Para garantizar que el queso hecho exclusivamente de leche de oveja, de cabra o de búfala, o de una mezcla de estas leches, no contiene caseína de leche de vaca se utilizará el método de análisis establecido en el apéndice.

Se considera que hay presencia de caseína de leche de vaca si el contenido de caseína de leche de vaca de la muestra analizada es igual o superior al contenido de la muestra de referencia que contiene 1 % de leche de vaca, según se establece en el apéndice.

2. Podrán utilizarse otros métodos para detectar la caseína de leche de vaca en los quesos citados en el apartado 1, siempre que:

• a) el límite de detección sea como máximo del 0,5 %, y
• b) no haya falsos positivos, y
• c) la caseína de leche de vaca siga siendo detectable con la sensibilidad exigida incluso tras largos períodos de maduración, como puede suceder en condiciones comerciales normales.

Si no se cumple alguna de las condiciones citadas, se utilizará el método establecido en el apéndice.

Apéndice
MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE LECHE DE VACA Y DE CASEINATO DE LECHE DE VACA EN QUESOS DE LECHE DE OVEJA, LECHE DE CABRA O LECHE DE BÚFALA, O MEZCLAS DE LECHE DE OVEJA, CABRA Y BÚFALA

1. OBJETO

Detección de leche de vaca y de caseinato de leche de vaca en quesos de leche de oveja, leche de cabra o leche de búfala, o mezclas de leche de oveja, cabra y búfala, mediante isoelectroenfoque de γ-caseínas tras plasminólisis.

2. ÁMBITO DE APLICACIÓN

El método es adecuado para la detección sensible y específica de leche de vaca y de caseinato de leche de vaca, tanto crudo como con tratamiento térmico, en quesos frescos y madurados elaborados con leche de oveja, leche de cabra o leche de búfala, o mezclas de leche de oveja, cabra y búfala. No es adecuado para la detección de la adulteración de leche y queso con concentrados de proteínas de suero de leche de bovino tratados térmicamente.

3. PRINCIPIO DEL MÉTODO

3.1. Aislamiento de caseínas de queso y patrones de referencia

3.2. Disolución de las caseínas aisladas y ruptura con plasmina (EC.3.4.21.7)

3.3. Isoelectroenfoque de las caseínas tratadas con plasmina en presencia de urea y tinción de las proteínas

3.4. Evaluación de las manchas teñidas de γ₃ y γ₂-caseína (prueba de la presencia de leche de vaca) comparando las manchas obtenidas de la muestra con las producidas en el mismo gel por los patrones de referencia que contienen 0 % y 1 % de leche de vaca

4. REACTIVOS

A menos que se indique lo contrario, se utilizarán sustancias de grado analítico. Debe utilizarse agua bidestilada o de pureza equivalente.

Nota: los datos siguientes se refieren a geles de poliacrilamida con urea, preparados en el laboratorio, de unas dimensiones de 265 × 125 × 0,25 mm. Si se utilizan geles de otro tipo o dimensiones, es posible que deban modificarse las condiciones de separación.

Isoelectroenfoque

4.1. Reactivos para la obtención de los geles de poliacrilamida con urea

4.1.1. Solución de gel madre

Se disuelven:

4,85 g de acrilamida

0,15 g de N,N′-metilen-bis-acrilamida (BIS)

48,05 g de urea

15,00 g de glicerol (87 % p/p),

en agua; se lleva a 100 ml y se guarda en un frasco de vidrio topacio en el frigorífico.

Nota: puede utilizarse una solución de acrilamida/BIS premezcladas, presente en el comercio, en vez de los pesos fijos indicados de las acrilamidas neurotóxicas. Si una solución de este tipo contiene un 30 % p/v de acrilamida y un 0,8 % p/v de BIS, deberá utilizarse para la formulación un volumen de 16,2 ml, en lugar de los pesos fijos. El plazo de validez de la solución madre es como máximo de 10 días; si su conductividad es superior a 5 μS, debe desionizarse agitando con 2 g de amberlita MB-3 durante 30 minutos, y filtrarse después por una membrana de 0,45 μm.

4.1.2. Solución de gel

Se prepara una solución de gel mezclando aditivos y anfolitos (*) con la solución de gel madre (véase 4.1.1):

9,0 ml de solución madre

24 mg de β-alanina

500 μl de anfólito pH 3,5-9,5

250 μl de anfólito pH 5-7

250 μl de anfólito pH 6-8

Se mezcla la solución de gel y se desgasifica durante dos o tres minutos en un baño de ultrasonidos o en vacío.

Nota: la solución de gel se prepara justo antes de verterla (véase 6.2).

4.1.3. Soluciones catalizadoras

4.1.3.1. N,N,N′,N′-tetrametiletilendiamina (Temed)

4.1.3.2. Persulfato amónico al 40 % p/v (PER):

Se disuelven 800 mg de PER en agua y se completa hasta 2 ml.

Nota: debe utilizarse siempre una solución de PER recién preparada.

4.2. Líquido de contacto

Queroseno o parafina líquida

4.3. Solución anódica

Se disuelven 5,77 g de ácido fosfórico (85 % p/p) en agua y se diluye hasta 100 ml.

4.4. Solución catódica

Se disuelven 2,00 g de hidróxido sódico en agua y se diluye hasta 100 ml con agua.

Preparación de la muestra

4.5. Reactivos para el aislamiento de las proteínas

4.5.1. Ácido acético diluido (25,0 ml de ácido acético glacial llevados a 100 ml con agua)

4.5.2. Diclorometano

4.5.3. Acetona

4.6. Amortiguador de disolución de proteínas

Se disuelven:

5,75 g de glicerol (87 % p/p)

24,03 g de urea

250 mg de ditiotreitol

en agua y se completa hasta 50 ml.

Nota: se debe conservar en frigorífico durante un plazo máximo de una semana.

4.7. Reactivos para la ruptura con plasmina de las caseínas

4.7.1. Amortiguador de carbonato amónico

Se ajusta a pH 8 una solución de hidrogenocarbonato amónico 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml de agua) que contiene 0,05 mol/l de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 1,46 g/100 ml) con una solución de carbonato amónico 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml de agua) que contiene 0,05 mol/l de EDTA.

4.7.2. Plasmina bovina (EC. 3.4.21.7), con una actividad mínima de 5 U/ml

4.7.3. Solución de ácido ε-aminocaproico para inhibición enzimática

Se disuelven 2,624 g de ácido ε-aminocaproico (ácido 6-amino-n-hexanoico) en 100 ml de etanol del 40 % (v/v).

4.8. Patrones

4.8.1. En el Instituto de Medidas y Materiales de Referencia de la Comisión, B-2440 Geel, Bélgica, pueden conseguirse patrones de referencia certificados de una mezcla de leche desnatada cuajada de oveja y de cabra, con un 0 % y un 1 % de leche de vaca.

4.8.2. Preparación de patrones provisionales de laboratorio de leche cuajada de búfala con un 0 % y un 1 % de leche de vaca.

Se prepara la leche desnatada mediante centrifugación de leche cruda de vaca o de búfala a granel a 37 °C a 2 500 g durante 20 minutos. Tras enfriar el tubo y su contenido rápidamente a 6-8 °C, se elimina completamente la capa grasa superior. Para la preparación del patrón del 1 %, se añaden 5,00 ml de leche desnatada de vaca a 495 ml de leche desnatada de búfala en un vaso de 1 litro y se ajusta el pH a 6,4 mediante adición de ácido láctico diluido (10 % p/v). Se ajusta la temperatura a 35 °C y se añaden 100 μl de cuajo de ternero (actividad del cuajo 1:10 000, aprox. 3 000 U/ml), se agita durante 1 minuto y se deja el vaso en reposo, cubierto con lámina de aluminio, a 35 °C durante 1 hora, para que se pueda formar la cuajada. Una vez formada esta, se liofiliza toda la leche cuajada, sin que haya previamente homogeneización ni eliminación del suero. Tras la liofilización, se tritura bien para obtener un polvo homogéneo. Para la preparación del patrón del 0 %, se sigue el mismo procedimiento utilizando leche desnatada pura de búfala. Los patrones deben conservarse a - 20 °C.

Nota: es conveniente comprobar la pureza de la leche de búfala mediante isoelectroenfoque de las caseínas tratadas con plasmina antes de la preparación de los patrones.

Reactivos de tinción de proteínas

4.9. Fijador

Se disuelven 150 g de ácido tricloroacético en agua y se lleva a 1 000 ml.

4.10. Solución decolorante

Se diluyen 500 ml de metanol y 200 ml de ácido acético glacial hasta 2 000 ml con agua destilada.

Nota: la solución decolorante debe prepararse cada día; puede hacerse mezclando volúmenes iguales de soluciones madre de metanol del 50 % (v/v) y de ácido acético glacial del 20 % (v/v).

4.11. Soluciones colorantes

4.11.1. Solución colorante (solución madre 1)

Se disuelven 3,0 g de azul brillante Coomassie G 250 (C.I.42655) en 1 000 ml de metanol del 90 % (v/v) utilizando un agitador magnético (durante unos 45 minutos) y se filtra a través de dos filtros de pliegues de velocidad media.

4.11.2. Solución colorante (solución madre 2)

Se disuelven 5,0 g de sulfato de cobre pentahidratado en 1 000 ml de ácido acético del 20 % (v/v).

4.11.3. Solución colorante (solución de trabajo)

Se mezclan 125 ml de cada una de las soluciones madre (4.11.1, 4.11.2), justo antes de realizar la tinción.

Nota: la solución colorante solo debe utilizarse el mismo día en que se haya preparado.

5. EQUIPO

5.1. Placas de vidrio (265 × 125 × 4 mm); rodillo de caucho (15 cm de ancho); mesa de nivelación

5.2. Hoja de soporte del gel (265 × 125 mm)

5.3. Hoja de cobertura (280 × 125 mm). Se pega una tira de cinta adhesiva (280 × 6 × 0,25 mm) a cada uno de los bordes largos (véase la figura 1).

5.4. Cámara de electroenfoque con placa de refrigeración (por ejemplo, 265 × 125 mm) con fuente de alimentación adecuada (≥ 2,5 kV) o equipo automático de electroforesis

5.5. Criostato de circulación, termostatizado a 12 ± 0,5 °C

5.6. Centrífuga, ajustable a 3 000 g

5.7. Tiras de electrodos (≥ 265 mm de longitud)

5.8. Frascos de plástico para el goteo de las soluciones anódica y catódica

5.9. Aplicadores de la muestra (10 × 5 mm, papel de filtro de escasa adsorción de proteínas o viscosa)

5.10. Placas de cristal o acero inoxidable para teñir y decolorar (por ejemplo, bandejas de instrumentos de 280 × 150 mm)

5.12. Homogeneizador de varilla ajustable (10 mm de diámetro del cilindro, velocidad entre 8 000 y 20 000 rpm)

5.13. Agitador magnético

5.14. Baño ultrasónico

5.15. Soldador de películas

5.16. Micropipetas de 25 μl

5.17. Concentrador a vacío o liofilizador

5.18. Baño María termostatizado a 35 y 40 ± 1 °C con agitador

5.19. Equipo de densitometría capaz de medir a λ = 634 nm

6. PROCEDIMIENTO

6.1. Preparación de la muestra

6.1.1. Aislamiento de las caseínas

Se pesa la cantidad equivalente a 5 g de peso seco de queso o de patrón de referencia en un tubo de centrífuga de 100 ml, se añaden 60 ml de agua destilada y se homogeneiza con un homogeneizador de varilla (8 000-10 000 rpm). Se ajusta el pH a 4,6 con ácido acético diluido (4.5.1) y se centrifuga (5 minutos, 3 000 g). Se decantan la grasa y el suero, se homogeneiza el residuo a 20 000 rpm en 40 ml de agua destilada [con el pH ajustado a 4,5 con ácido acético diluido (4.5.1)], se añaden 20 ml de diclorometano (4.5.2), se homogeneiza de nuevo y se centrifuga (5 minutos, 3 000 g). Con una espátula se extrae la capa de caseína que se halla entre las fases acuosa y orgánica (véase la figura 2) y se decantan ambas fases. Se vuelve a homogeneizar la caseína en 40 ml de agua destilada (véase más arriba) y 20 ml de diclorometano (4.5.2), y se centrifuga. Se repite esta operación hasta que las dos fases de extracción sean incoloras (2 o 3 veces). Se homogeneiza el residuo de proteína con 50 ml de acetona (4.5.3) y se pasa a través de un filtro de papel de pliegues de velocidad media. Se lava dos veces el residuo que queda en el filtro con 25 ml de acetona cada vez, y se deja secar al aire o en corriente de nitrógeno; después se pulveriza bien en mortero.

Nota: la caseína aislada seca debe conservarse a - 20 °C.

6.1.2. Ruptura de las β-caseínas con plasmina para intensificar las γ-caseínas

Se suspenden 25 mg de caseínas aisladas (6.1.1) en 0,5 ml de solución amortiguadora de carbonato amónico (4.7.1) y se homogeneiza durante 20 minutos, por ejemplo con ultrasonidos. Se calienta a 40 °C y se añaden 10 μl de plasmina (4.7.2), se mezcla y se incuba durante una hora a 40 °C sin dejar de agitar. Para inhibir la enzima se añaden 20 μl de solución de ácido ε-aminocaproico (4.7.3) y se añaden después 200 mg de urea sólida y 2 mg de ditiotreitol.

Nota: para obtener mayor simetría en las bandas de caseína enfocada, es conveniente liofilizar la solución tras añadir el ácido ε-aminocaproico y disolver después el residuo en 0,5 ml de solución amortiguadora de disolución de proteínas (4.6).

6.2. Preparación de los geles de poliacrilamida con urea

Con ayuda de unas cuantas gotas de agua, se extiende la hoja de soporte del gel (5.2) sobre una placa de vidrio (5.1), y se elimina el exceso de agua con toallas o pañuelos de papel. Se extiende la hoja de cobertura (5.3) con espaciadores (0,25 mm) sobre otra placa de vidrio de la misma forma. Se coloca la placa horizontalmente sobre una mesa de nivelación.

Se añaden 10 μl de Temed (4.1.3.1) a la solución de gel preparada y desgasificada (4.1.2), se agita y se añaden 10 μl de solución de PER (4.1.3.2), se mezcla bien y se vierte de inmediato y uniformemente en el centro de la hoja de cobertura. Se coloca un extremo de la placa de soporte del gel (con la cara de la hoja hacia abajo) sobre la placa de la hoja de cobertura y se baja lentamente de manera que se forme una película de gel entre las hojas, extendiéndose de forma regular y sin burbujas (figura 3). Con una fina espátula se hace bajar cuidadosa y completamente la placa de soporte del gel y se colocan otras tres placas de vidrio encima para que actúen de peso. Una vez completada la polimerización (alrededor de 60 minutos), se extrae el gel polimerizado sobre la hoja de soporte del gel junto con la hoja de cobertura, dando golpecitos en las placas de vidrio. Se limpia cuidadosamente el revés de la hoja de soporte para eliminar los residuos de gel y la urea. Se suelda el “emparedado de gel” para formar un tubo de película, y se guarda en frigorífico (durante 6 semanas como máximo).

Nota: la hoja de cobertura con los espaciadores puede volver a utilizarse. El gel de poliacrilamida puede cortarse en trozos más pequeños, lo que es recomendable cuando hay pocas muestras o si se utiliza un equipo automático de electroforesis (dos geles de 4,5 × 5 cm).

6.3. Isoelectroenfoque

Se gradúa el termostato de refrigeración a 12 °C. Se frota el revés de la hoja de soporte del gel con queroseno y después se dejan caer unas cuantas gotas de queroseno (4.2) sobre el centro del bloque de refrigeración. Se extiende encima el “emparedado de gel”, con la cara del soporte hacia abajo, con cuidado para evitar la formación de burbujas. Se enjuga el exceso de queroseno y se quita la hoja de cobertura. Se empapan las tiras de los electrodos con las soluciones electródicas (4.3 y 4.4), se cortan para ajustarlas a la longitud del gel y se colocan en los lugares previstos (a 9,5 cm de distancia de los electrodos).

Condiciones del isoelectroenfoque:

• 6.3.1. Tamaño del gel: 265 × 125 × 0,25 mm

  Etapa	Tiempo (min)	Tensión (V)	Intensidad de corriente (mA)	Potencia (W)	Voltios-hora (Vh)
  1.-Pre-enfoque	30	máxima 2 500	máxima 15	constante 4	aprox. 300
  2.-Enfoque de la muestra (34)	60	máxima 2 500	máxima 15	constante 4	aprox. 1 000
  3.-Enfoque final	60	máxima 2 500	máxima 5	máxima 20	aprox. 3 000
  	40	máxima 2 500	máxima 6	máxima 20	aprox. 3 000
  	30	máxima 2 500	máxima 7	máxima 25	aprox. 3 000

  Nota: si se modifica el espesor o la anchura de los geles, habrá que ajustar convenientemente los valores de intensidad y potencia (por ejemplo, habrá que duplicar los valores de intensidad de corriente eléctrica y de potencia si se utiliza un gel de 265 × 125 × 0,5 mm).

• 6.3.2. Ejemplo de programa de tensión para un equipo automático de electroforesis (2 geles de 5,0 × 4,5 cm), cuyos electrodos sin tiras se aplican directamente al gel

  Etapa	Tensión	Intensidad de corriente	Potencia	Temperatura	Voltios-hora
  1.-Pre-enfoque	1 000 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	85 Vh
  2.-Enfoque de la muestra	250 V	5,0 mA	2,5 W	8 °C	30 Vh
  3.-Enfoque	1 200 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	80 Vh
  4.-Enfoque	1 500 V	5,0 mA	7,0 W	8 °C	570 Vh

  El aplicador de muestra se coloca en la etapa 2 a 0 Vh.

  El aplicador de muestra se retira en la etapa 2 a 30 Vh.

6.4. Tinción de las proteínas

6.4.1. Fijación de las proteínas

Se retiran las tiras de los electrodos inmediatamente después de cortar la corriente y se pone el gel inmediatamente en un recipiente de tinción/decoloración con 200 ml de fijador (4.9); se deja durante 15 minutos, agitando continuamente.

6.4.2. Lavado y tinción de la placa de gel

Se escurre totalmente el fijador y se lava la placa de gel dos veces durante 30 segundos cada vez con 100 ml de solución decolorante (4.10). Se retira la solución decolorante y se llena el recipiente con 250 ml de solución colorante (4.11.3); se tiñe durante 45 minutos con agitación suave.

6.4.3. Decoloración de la placa de gel

Se retira la solución colorante, se lava la placa de gel dos veces con 100 ml de solución decolorante (4.10) cada vez; después se agita durante 15 minutos con 200 ml de solución decolorante y se repite la etapa de decoloración al menos 2 o 3 veces hasta que el fondo se vea claro e incoloro. A continuación, se enjuaga la placa de gel con agua destilada (2 × 2 minutos) y se deja secar al aire (de 2 a 3 horas) o con un secador de pelo (de 10 a 15 minutos).

Nota 1: la fijación, el lavado, la tinción y la decoloración se deben realizar a 20 °C. No deben emplearse temperaturas elevadas.

Nota 2: si se prefiere utilizar una tinción de plata (por ejemplo, Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Código n.º 17-1150-01), de mayor sensibilidad, las muestras de caseína tratadas con plasmina deben diluirse a 5 mg/ml.

7. EVALUACIÓN

La evaluación se realiza comparando las manchas de proteínas de la muestra desconocida con los patrones de referencia en el mismo gel. La detección de leche de vaca en quesos de leche de oveja, leche de cabra y leche de búfala o sus mezclas se realiza por medio de las γ₃- y γ₂-caseínas, cuyos puntos isoeléctricos se sitúan entre los pH 6,5 y 7,5 (figuras 4a, 4b y 5). El límite de detección es inferior al 0,5 %.

7.1. Estimación visual

Para la evaluación visual de la cantidad de leche de vaca es conveniente ajustar las concentraciones de las muestras y patrones para obtener el mismo nivel de intensidad de las γ₂- y γ₃-caseínas de oveja, cabra y búfala (véase “γ₂ E,G,B” y “γ₃ E,G,B”, en las figuras 4a, 4b y 5). A continuación podrá evaluarse directamente la cantidad de leche de vaca (menor, igual o mayor que el 1 %) en la muestra desconocida comparando la intensidad de las γ₃- y γ₂-caseínas de vaca (véase “γ₃ C” y “γ₂ C” en las figuras 4a, 4b y 5) con las de los patrones de referencia del 0 % y el 1 % (oveja, cabra) o con los patrones provisionales de laboratorio (búfala).

7.2. Estimación densitométrica

Cuando sea posible, se aplica la densitometría (5.19) para determinar la relación de las áreas de los picos de las γ₂- y γ₃-caseínas de vaca con respecto a las de oveja, cabra y búfala (véase la figura 5). Este valor se compara con la relación de las áreas de los picos de las γ₂- y γ₃-caseínas del patrón de referencia del 1 % (oveja, cabra) o del patrón provisional de laboratorio (búfala) analizados en el mismo gel.

Nota: el método funciona satisfactoriamente si se encuentra una señal positiva clara de las dos caseínas de vaca (γ₂ y γ₃) en el patrón de referencia del 1 % pero no en el del 0 %. En caso contrario, deberá optimizarse el procedimiento respetando los detalles del método con precisión.

Una muestra se considerará positiva cuando las dos caseínas de vaca (γ₂ y γ₃) o las relaciones de las áreas de los picos correspondientes sean iguales o superiores al nivel del patrón de referencia del 1 %.

8. BIBLIOGRAFÍA

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: “Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ₂-caseins”. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: “A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting”. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: “Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier”. En: “Electrophoresis-Forum 89” (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: “Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen”. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

Radola B.J.: “Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films”. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Figura 1

Esquema de la hoja de cobertura

Figura 2

Capa de caseína flotando entre las fases acuosa y orgánica tras la centrifugación

Figura 3

Técnica de inclinación para moldear geles ultrafinos de poliacrilamida

a = cinta espaciadora (0,25 mm); b = hoja de cobertura (5.3); c, e = placas de vidrio (5.1); d = solución de gel (4.1.2); f = hoja de soporte de gel (5.2)

Figura 4a

Isoelectroenfoque de caseínas tratadas con plasmina de queso elaborado con leche de oveja y cabra con cantidades diferentes de leche de vaca

% CM = porcentaje de leche de vaca, C = vaca, E = oveja, G = cabra

Se muestra la mitad superior del gel de IEF.

Figura 4b

Isoelectroenfoque de caseínas tratadas con plasmina de queso elaborado con mezclas de leche de oveja, cabra y búfala con cantidades diferentes de leche de vaca

% CM = porcentaje de leche de vaca; 1 + = muestra que contiene un 1 % de leche de vaca en la que se ha inyectado caseína pura de vaca a mitad del recorrido; C = vaca, E = oveja, G = cabra, B = búfala.

Se muestra la distancia de separación total del gel de IEF.

Figura 5

Superposición de densitogramas de patrones (STD) y muestras de quesos elaborados con una mezcla de leche de oveja y cabra tras el isoelectroenfoque

a, b = patrones con 0 % y 1 % de leche de vaca; c-g = muestras de quesos con 0, 1, 2, 3 y 7 % de leche de vaca; C = vaca, E = oveja, G = cabra.

La mitad superior del gel de IEF se leyó a λ = 634 nm.

LE0000613811_20180207Anexo VIII introducido por el apartado 3) del anexo del Reglamento de Ejecución (UE) 2018/150 de la Comisión, de 30 de enero de 2018, por el que se modifica el Reglamento de Ejecución (UE) 2016/1240 en lo que se refiere a los métodos para el análisis y la evaluación de la calidad de la leche y de los productos lácteos que pueden optar a la intervención pública y a la ayuda para el almacenamiento privado («D.O.U.E.L.» 31 enero).Vigencia: 7 febrero 2018

ANEXO IX
Evaluación de los análisis

1. Garantía de calidad

Los análisis los realizarán laboratorios designados de conformidad con el artículo 12 del Reglamento (CE) n.º 882/2004(35) o que designen las autoridades competentes del Estado miembro.

2. Muestreo y controversias sobre los resultados de los análisis

1. El muestreo se efectuará de acuerdo con la normativa aplicable al producto estudiado. En caso de que no se prevean expresamente disposiciones sobre muestreo, se utilizarán las disposiciones establecidas en la norma ISO 707: Leche y productos lácteos. Directrices para la toma de muestras.

2. Los informes de laboratorio de los resultados de los análisis deberán incluir suficiente información para que se pueda hacer una evaluación de dichos resultados según el apéndice.

3. Para los análisis exigidos por la normativa de la Unión se tomarán muestras por duplicado.

4. En caso de controversia sobre los resultados, el organismo pagador hará que se repita el análisis necesario del producto de que se trate, debiendo correr con los costes la parte perdedora.

El análisis antes mencionado se efectuará siempre que se disponga de duplicados sellados de las muestras del producto que hayan sido conservados de forma adecuada por la autoridad competente. El fabricante enviará una solicitud al organismo pagador para realizar el análisis en el plazo de siete días laborables a partir de la notificación de los resultados del primer análisis. El análisis deberá realizarlo el organismo pagador en el plazo de veintiún días laborables a partir de la recepción de la solicitud.

5. El resultado derivado del recurso será el definitivo.

6. Si el fabricante puede demostrar, en el plazo de cinco días laborables desde la fecha del muestreo, que este no se había efectuado de forma correcta, se repetirá el muestreo siempre que sea posible. Si no puede repetirse el muestreo, se aceptará el envío.

Apéndice

Evaluación del cumplimiento de un envío respecto al límite legal

1. Principio

Cuando la normativa aplicable al régimen de intervención pública y al almacenamiento privado establezca procedimientos de muestreo detallados, deberán seguirse esos procedimientos. En todos los demás casos se utilizará una muestra formada por al menos tres unidades de muestra tomadas aleatoriamente del envío objeto de control. Podrá prepararse una muestra compuesta. El resultado obtenido se comparará con los límites legales calculando un intervalo de confianza del 95 % como dos veces la desviación típica, dependiendo la desviación típica correspondiente de si: 1) el método está validado mediante colaboración internacional con valores de σ_r y σ_R, o si 2) se ha calculado la reproducibilidad interna en caso de validación dentro del propio laboratorio. Este intervalo de confianza se iguala entonces a la incertidumbre de la medición del resultado.

2. El método está validado mediante colaboración internacional

En este caso, se han establecido la desviación típica de la repetibilidad σ_r y la desviación típica de la reproducibilidad σ_R y el laboratorio puede demostrar el cumplimiento con las características de funcionamiento del método validado.

Se calcula la media aritmética de las n mediciones repetidas.

Se calcula la incertidumbre ampliada (k = 2) de del modo siguiente:

Si el resultado final x de la medición se calcula utilizando una fórmula del tipo x = y ₁ + y ₂, x = y ₁ - y ₂, x = y ₁ · y ₂ o x = y ₁/y ₂ deberán seguirse los métodos normales para combinar desviaciones típicas en tales casos.

Se considera que el envío no se ajusta al límite superior legal UL si

en caso contrario, se considera que sí cumple el UL.

Se considera que el envío no se ajusta al límite inferior legal LL si

en caso contrario, se considera que sí cumple el LL.

3. Validación en el propio laboratorio con cálculo de la desviación típica de la reproducibilidad interna

En caso de que se utilicen métodos no especificados en el presente Reglamento y no se hayan establecido medidas de la precisión, deberá efectuarse una validación en el propio laboratorio. En las fórmulas para calcular la incertidumbre ampliada _U se utilizarán la desviación típica de la repetibilidad interna s_ir y la desviación típica de la reproducibilidad interna s_i R en lugar de σ_r y σ _R , respectivamente.

En el punto 1 figuran las normas que deben seguirse para determinar la conformidad con el límite legal. Sin embargo, si se considera que el envío no cumple el límite legal, habrá que repetir las mediciones con el método especificado en el presente Reglamento, y el resultado se evaluará según lo indicado en el punto 1.

(*) Se ha visto que los productos Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) y Resolyte® pH 5-7 y pH 6-8 (BDH, Merck) son muy adecuados para conseguir la separación necesaria de las γ-caseínas.

LE0000613811_20180207Anexo IX introducido por el apartado 3) del anexo del Reglamento de Ejecución (UE) 2018/150 de la Comisión, de 30 de enero de 2018, por el que se modifica el Reglamento de Ejecución (UE) 2016/1240 en lo que se refiere a los métodos para el análisis y la evaluación de la calidad de la leche y de los productos lácteos que pueden optar a la intervención pública y a la ayuda para el almacenamiento privado («D.O.U.E.L.» 31 enero).Vigencia: 7 febrero 2018