ANEXO

Planes de muestreo y m閠odos de diagn髎tico para la detecci髇 y la confirmaci髇 de la septicemia hemorr醙ica viral (SHV) y la necrosis hematopoy閠ica infecciosa (NHI)

INTRODUCCI覰

El presente anexo:

• a) Establece directrices y requisitos m韓imos aplicables a los planes de muestreo y m閠odos de diagn髎tico para la detecci髇 y confirmaci髇 de la presencia de septicemia hemorr醙ica viral (SHV) y necrosis hematopoy閠ica infecciosa (NHI).
• b) Integra las disposiciones de los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE para la obtenci髇 y el mantenimiento de la autorizaci髇 de zonas y de explotaciones situadas en zonas no autorizadas.
• c) Establece disposiciones para el correcto diagn髎tico de la septicemia hemorr醙ica viral y la necrosis hematopoy閠ica infecciosa y el reconocimiento oficial de la autorizaci髇 de zonas y de explotaciones situadas en zonas no autorizadas de conformidad con los art韈ulos 5 y 6 de la Directiva 91/67/CEE.
• d) Est� destinado a las autoridades responsables de la lucha contra la septicemia hemorr醙ica viral y la necrosis hematopoy閠ica infecciosa y al personal de laboratorio que lleve a cabo las pruebas de estas enfermedades. En consecuencia, se presta especial atenci髇 a los procedimientos de muestreo, los principios y aplicaciones de las pruebas de laboratorio y la evaluaci髇 de sus resultados, as� como a las t閏nicas de laboratorio detalladas. No obstante, cuando proceda, los laboratorios podr醤 modificar las pruebas recogidas en el presente anexo o utilizar pruebas diferentes, siempre que se pueda demostrar que tienen una sensibilidad y especificidad equivalentes.

La parte I comprende los planes de muestreo y los m閠odos de diagn髎tico para la vigilancia de la septicemia hemorr醙ica viral y la necrosis hematopoy閠ica infecciosa con objeto de obtener y mantener la autorizaci髇 de una zona o de una explotaci髇 situada en una zona no autorizada.

En la parte II se describen los procedimientos de diagn髎tico para confirmar la existencia de la septicemia hemorr醙ica viral y la necrosis hematopoy閠ica infecciosa en caso de que se sospeche de su presencia.

En la parte III se establecen criterios y directrices de un programa oficial de inspecci髇 sanitaria que documente la ausencia hist髍ica de septicemia hemorr醙ica viral y la necrosis hematopoy閠ica infecciosa.

En la parte IV se recogen recomendaciones sobre el procedimiento empleado para la titulaci髇 del virus de la septicemia hemorr醙ica viral y la necrosis hematopoy閠ica infecciosa y para comprobar la sensibilidad de los cultivos celulares a la infecci髇.

En la parte V se recogen los acr髇imos y las abreviaturas.

PARTE I Planes de muestreo y m閠odos de diagn髎tico para la vigilancia de la septicemia hemorr醙ica viral y la necrosis hematopoy閠ica infecciosa, con objeto de obtener y mantener la autorizaci髇 de una zona o de una explotaci髇 situada en una zona no autorizada

I. Inspecciones y muestreo

1. Disposiciones generales sobre las inspecciones sanitarias cl韓icas, la recogida y la selecci髇 de muestras para vigilancia de zonas o explotaciones situadas en zonas no autorizadas con objeto de lograr o mantener la autorizaci髇 con respecto a la SHV o la NHI.-En los cuadros 1A, 1B y 1C se resumen las inspecciones sanitarias cl韓icas y el muestreo de tejidos de los peces, del fluido ov醨ico o de ambos, que deber� realizarse en las zonas o las explotaciones situadas en zonas no autorizadas para lograr o mantener la autorizaci髇 con respecto a la SHV o la NHI de conformidad con los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE. En las partes I.I.2 a I.I.4 se recogen detalles m醩 precisos. Los cuadros 1A y 1B no ser醤 aplicables a las nuevas explotaciones ni a las explotaciones que vuelvan a dar comienzo a sus actividades con peces, huevos o gametos procedentes una zona autorizada o de una explotaci髇 autorizada situada en una zona no autorizada, siempre que cumplan lo dispuesto en las letras a) o b) de la parte I.A6 o en las letras a) o b) de la parte II.A3 del anexo C de la Directiva 91/67/CEE.

Las inspecciones cl韓icas deber醤 efectuarse durante el per韔do comprendido entre octubre y junio o siempre que la temperatura del agua est� por debajo de los 14� C. Cuando las explotaciones deban ser inspeccionadas cl韓icamente dos veces al a駉, los intervalos entre ambas visitas deber醤 ser de un m韓imo de cuatro meses. Todas las unidades de producci髇 (estanques, tanques, jaulas de red, etc.) deber醤 inspeccionarse para comprobar si hay peces muertos, d閎iles o que act鷈n de manera anormal. Deber� prestarse especial atenci髇 a la zona de desag黣, donde los peces d閎iles tienen tendencia a acumularse debido a la corriente de agua.

Los peces que se tomen como muestra se seleccionar醤 de la siguiente manera:

• - Si hay truchas arco iris, toda la muestra estar� compuesta de peces de esa especie. En caso contrario, la muestra deber� incluir peces de todas las especies presentes siempre que sean sensibles al virus de la SHV o de la NHI (de conformidad con la lista recogida en el anexo A de la Directiva 91/67/CE).
  
  Las especies deber醤 estar representadas de manera proporcional en la muestra.
• - Si se emplea m醩 de una fuente de agua para la producci髇 de peces, la muestra deber� incluir peces que representen a todas las fuentes.
• - Si hay peces d閎iles, que act鷈n de manera anormal o muertos recientemente (sin descomponer), tales peces ser醤 los primeros que se incluyan en la muestra. En caso de que no los haya, 閟ta deber� estar compuesta de peces sanos, de apariencia normal, recogidos de tal modo que est閚 representadas proporcionalmente todas las partes de la explotaci髇 y las clases de edad.

2. Disposiciones espec韋icas, incluida la recogida de muestras, para la vigilancia de zonas o explotaciones situadas en zonas no autorizadas con objeto de lograr o mantener la autorizaci髇 con respecto a la SHV y la NHI.

• a) Una zona o una explotaci髇 situada en una zona no autorizada sometida a supervisi髇 por los servicios oficiales puede obtener la autorizaci髇 con respecto a la SHV o la NHI siempre que se someta a uno de los dos modelos siguientes:
  • 1. Modelo A: Un programa de vigilancia de dos a駉s.
    
    Tras un plazo m韓imo de dos a駉s de ausencia de signos cl韓icos o de otro tipo de SHV o NHI, todas las explotaciones de la zona o toda explotaci髇 situada en una zona no autorizada que deseen ser autorizadas, deber醤 someterse a una inspecci髇 sanitaria dos veces al a駉 durante dos a駉s. A lo largo de este per韔do de control de dos a駉s que precede a la consecuci髇 de la autorizaci髇, se deber� mantener la ausencia de signos cl韓icos o de otro tipo de SHV o de NHI y se deber醤 recoger muestras para su examen de conformidad con lo establecido en el cuadro 1A. Adem醩, las muestras deber醤 seleccionarse, prepararse y examinarse de conformidad con lo dispuesto en las partes II a I.IV y los resultados de los ex醡enes de laboratorio para detectar la SHV o la NHI deber醤 ser negativos.
  • 2. Modelo B: Un programa de vigilancia de dos a駉s con una muestra de tama駉 reducido.
    
    Tras un programa oficial de inspecci髇 sanitaria que documente la ausencia hist髍ica de SHV o NHI durante, al menos, cuatro a駉s, todas las explotaciones de la zona o toda explotaci髇 que est� situada en una zona no autorizada, que deseen ser autorizadas, deber醤 someterse a inspecci髇 sanitaria dos veces al a駉 durante dos a駉s. A lo largo de este per韔do de control de dos a駉s que precede a la consecuci髇 de la autorizaci髇, se deber� mantener la ausencia de signos cl韓icos o de otro tipo de SHV o de NHI y se deber醤 recoger muestras para su examen de conformidad con lo establecido en el cuadro 1B. Adem醩, las muestras deber醤 seleccionarse, prepararse y examinarse de conformidad con lo dispuesto en las partes II a I.IV y los resultados de los ex醡enes de laboratorio para detectar la septicemia hemorr醙ica viral o la necrosis hematopoy閠ica infecciosa deber醤 ser negativos. Para que los servicios oficiales reconozcan un programa de inspecci髇 sanitaria a efectos de documentaci髇 de la ausencia de septicemia hemorr醙ica viral o necrosis hematopoy閠ica infecciosa, 閟te deber� cumplir los criterios y directrices recogidos en la parte III.
• b) Disposiciones especiales para la autorizaci髇 de nuevas explotaciones y de explotaciones que vuelven a dar comienzo a sus actividades con peces, huevos o gametos procedentes de una zona autorizada, o de una explotaci髇 autorizada situada en una zona no autorizada.
  
  Las nuevas explotaciones y las explotaciones que vuelvan a dar comienzo a sus actividades con peces, huevos o gametos procedentes de una zona autorizada o de una explotaci髇 autorizada situada en una zona no autorizada podr醤 obtener la autorizaci髇 de conformidad con lo dispuesto en las letras a) y b) de la parte I.A.6 o en las letras a) y b) de la parte II.A.3 del anexo C de la Directiva 91/67/CEE. Por tanto, las disposiciones de muestreo establecidas en los ya citados modelos A y B [letras a) y b) de la parte I.I.2.1] no ser醤 aplicables a dichas explotaciones.
• c) Programa de vigilancia para el mantenimiento de la autorizaci髇 con respecto a la septicemia hemorr醙ica viral o la necrosis hematopoy閠ica infecciosa.
  
  Con objeto de mantener la autorizaci髇 de una zona o de una explotaci髇 situada en una zona no autorizada con respecto a la septicemia hemorr醙ica viral o la necrosis hematopoy閠ica infecciosa, las inspecciones y el muestreo para realizar los ex醡enes deber醤 llevarse a cabo de conformidad con lo establecido en el cuadro 1C. Las muestras deber醤 seleccionarse, prepararse y examinarse de conformidad con lo dispuesto en las partes II a I.IV y los ex醡enes de laboratorio deber醤 ser negativos con respecto a los agentes causantes de la septicemia hemorr醙ica viral o la necrosis hematopoy閠ica infecciosa.

3. Preparaci髇 y env韔 de muestras procedentes de los peces.-

Antes de su env韔 o traslado al laboratorio, se extraer醤 de los peces partes de los 髍ganos que deban examinarse con instrumental est閞il de disecci髇 y se introducir醤 en tubos de pl醩tico est閞iles que contengan medio de transporte, es decir, medio de cultivo celular con un 10 por 100 de suero de ternera y antibi髏icos. Se recomienda la combinaci髇 de 200 UI de penicilina, 200 microgramos de estreptomicina y 200 microgramos de kanamicina por ml, aunque podr醤 utilizarse asimismo otros antibi髏icos de eficacia probada. Los tejidos que se deber醤 examinar son el bazo, la parte anterior del ri耋n y, adem醩, bien el coraz髇 o bien el enc閒alo. En algunas ocasiones, deber� examinarse el fluido ov醨ico (cuadros 1A-1C).

El fluido ov醨ico o las partes de 髍ganos de un m醲imo de 10 peces (cuadros 1A-1C) podr醤 recogerse en un solo tubo est閞il que contenga al menos 4 ml de medio de transporte, para constituir una muestra conjunta. El peso del tejido de cada muestra deber� ser de 0,5 gramos como m韓imo.

Los tubos se colocar醤 en recipientes aislados (por ejemplo, cajas de poliestireno de paredes gruesas) con una cantidad suficiente de hielo o de bloques de enfriamiento para garantizar la refrigeraci髇 de las muestras durante su traslado al laboratorio. Se evitar� la congelaci髇. La temperatura de las muestras durante el transporte nunca deber� exceder de 10� C y en el momento de la recepci髇 todav韆 deber� haber hielo en el recipiente de transporte o alternativamente, uno o m醩 bloques de enfriamiento deber醤 estar a鷑 helados parcial o totalmente.

El examen virol骻ico deber� iniciarse lo antes posible y nunca despu閟 de que hayan transcurrido cuarenta y ocho horas desde la recogida de las muestras. En casos excepcionales (1) , el examen virol骻ico podr� empezar a m醩 tardar en un plazo de setenta y dos horas desde la recogida del material, siempre que 閟te quede protegido con medio de transporte y se cumplan los requisitos de temperatura durante el transporte (v閍se el punto 3 de la parte I.I.3).

En caso de que puedan cumplirse los requisitos de temperatura durante el transporte, podr醤 enviarse peces enteros al laboratorio. Los peces enteros podr醤 envolverse en papel absorbente y deber醤 enviarse en bolsas de pl醩tico refrigeradas seg鷑 se indica m醩 arriba. Tambi閚 podr醤 enviarse peces vivos.

El embalaje y etiquetado deber醤 realizarse de conformidad con la normativa de transporte nacional e internacional actualmente vigente que corresponda.

4. Recogida de material de diagn髎tico suplementario.-

De acuerdo con el laboratorio de diagn髎tico correspondiente, tambi閚 se podr醤 recoger otros tejidos de peces, que se preparar醤 para efectuar ex醡enes suplementarios.

II. Preparaci髇 de las muestras para el examen virol骻ico

1. Congelaci髇 en casos excepcionales.-

En caso de que surjan dificultades pr醕ticas (por ejemplo, condiciones meteorol骻icas adversas, d韆s festivos, problemas de laboratorio, etc.), que impidan inocular las c閘ulas en las cuarenta y ocho horas siguientes a la recogida de las muestras de tejidos, se podr醤 congelar estas muestras en medio de cultivo celular a una temperatura igual o inferior a -20� C y realizar el examen virol骻ico en un plazo de catorce d韆s. En cualquier caso, el tejido s髄o podr� congelarse y descongelarse una 鷑ica vez antes de su examen. Se deber� llevar un registro de los motivos por los que se han congelado las muestras de tejido en cada ocasi髇 en que se haya hecho (como, por ejemplo, tormenta, muerte de las l韓eas celulares, etc.).

2. Homogeneizaci髇 de los 髍ganos.-

Una vez en el laboratorio, se homogeneizar� completamente el tejido de los tubos (con un triturador, mezclador o mortero con arena est閞il) y a continuaci髇 se suspender� el homogeneizado en el medio de transporte original.

Si la muestra est� formada por peces enteros de menos de 4 cm de longitud, 閟tos se desmenuzar醤 con unas tijeras est閞iles o un escalpelo tras haberse eliminado la parte del cuerpo posterior a la cloaca. Si la muestra est� formada por peces enteros de una longitud comprendida entre 4 y 6 cm, se recoger醤 las v韘ceras, sin descartar los ri駉nes. Si la muestra est� formada por peces enteros de m醩 de 6 cm de longitud, se recoger醤 muestras de tejido de conformidad con el procedimiento descrito en la parte I.I.3. Las muestras de tejido se desmenuzar醤 con escalpelo o tijeras est閞iles y se homogeneizar醤 seg鷑 el procedimiento arriba descrito; se suspender� el homogeneizado en medio de transporte.

La proporci髇 final entre tejidos y medio de transporte deber� ajustarse en el laboratorio a 1:10.

3. Centrifugado del homogeneizado.-

El homogeneizado se centrifugar� a una aceleraci髇 de entre 2000 y 4000 x g durante quince minutos, en una centrifugadora refrigerada a una temperatura comprendida entre 2 y 5� C, y el sobrenadante se recoger� y se tratar� durante cuatro horas a 15� C o durante toda la noche a 4� C con antibi髏icos; por ejemplo, 1 mg/ml de gentamicina puede ser 鷗il en esta fase.

Si la muestra ha sido enviada en un medio de transporte (es decir, con exposici髇 a antibi髏icos), podr� omitirse el tratamiento con antibi髏icos del sobrenadante.

El tratamiento con antibi髏icos tiene por objeto luchar contra la contaminaci髇 bacteriana de las muestras y hace innecesaria la filtraci髇 con filtros de membrana.

Si el sobrenadante recogido se almacena a -80� C en el plazo de cuarenta y ocho horas siguientes a la toma de muestras, podr� ser reutilizado una sola vez para el examen virol骻ico.

En caso de que surjan dificultades pr醕ticas (por ejemplo, aver韆 de la incubadora, problemas con los cultivos celulares, etc.) que impidan inocular las c閘ulas en las cuarenta y ocho horas siguientes a la recogida de las muestras de tejidos, se podr� congelar el sobrenadante a -80� C y realizar el examen virol骻ico en un plazo de catorce d韆s.

Antes de la inoculaci髇 de las c閘ulas, el sobrenadante se mezclar� a partes iguales con un conjunto de antisueros de los serotipos aut骳tonos de virus de la necrosis pancre醫ica infecciosa (NPI), diluidos en la proporci髇 adecuada, y la mezcla se incubar� durante una hora como m韓imo a una temperatura de 15 oC o durante dieciocho horas como m醲imo a una temperatura de 4 oC. El t韙ulo del antisuero deber� ser como m韓imo de 1:2000 en una prueba de neutralizaci髇 en placa del 50 por 100.

El tratamiento de todos los in骳ulos con antisuero del virus de la NPI (virus que en algunas partes de Europa est� presente en el 50 por 100 de las muestras de peces) tiene por objeto evitar el desarrollo de efectos citopatog閚icos (ECP) debidos a este virus en los cultivos celulares inoculados. Con ello se logra reducir la duraci髇 de los ex醡enes virol骻icos, as� como el n鷐ero de casos en que la presencia de ECP deber韆 considerarse como indicador potencial de la presencia del virus de la septicemia hemorr醙ica viral o del de la necrosis hematopoy閠ica infecciosa.

Cuando las muestras procedan de unidades de producci髇 consideradas indemnes de NPI, podr� omitirse el tratamiento de los in骳ulos con antisuero del virus de dicha enfermedad.

III. Examen virol骻ico

1. Medios y cultivos celulares.-

Se cultivar醤 c閘ulas BF-2 o RTG-2 y bien EPC o bien FHM a una temperatura comprendida entre 20 y 30 oC en un medio adecuado como, por ejemplo, MEM de Eagle (o sus modificaciones) con adici髇 de un 10 por 100 de suero vacuno fetal y antibi髏icos en concentraciones normales.

Si las c閘ulas se cultivan en frascos cerrados, es recomendable amortiguar el medio con bicarbonato. El medio utilizado para el cultivo de c閘ulas en unidades abiertas podr� amortiguarse con Tris-HC1 (23 mM) y bicarbonato s骴ico (6 mM). El pH deber� ser de 7,6 �0,2.

Para la inoculaci髇 con tejidos se emplear醤 cultivos celulares j髒enes (de entre cuatro y cuarenta y ocho horas) y en crecimiento activo (no confluente) en el momento de la inoculaci髇.

2. Inoculaci髇 de los cultivos celulares.-

La suspensi髇 de 髍ganos tratada con antibi髏icos se inocular� en cultivos celulares en dos diluciones, es decir, la diluci髇 original y, adem醩, una diluci髇 1:10 de la misma, que dar醤 lugar a diluciones finales del material tisular en el medio de cultivo celular de 1:100 y 1:1000, respectivamente (a fin de evitar interferencias hom髄ogas). Deber醤 inocularse, como m韓imo, dos l韓eas celulares (v閍se la parte I.III.1). La proporci髇 entre el tama駉 del in骳ulo y el volumen del medio de cultivo celular ser� aproximadamente de 1:10.

Para cada diluci髇 y cada l韓ea celular se emplear� al menos un 醨ea celular de 2 cm2 aproximadamente, correspondiente a un pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Se recomienda el uso de placas de cultivo celular, aunque tambi閚 son aceptables otras unidades con 醨eas de crecimiento similares o mayores.

3. Incubaci髇 de los cultivos celulares.-

Los cultivos celulares inoculados se incubar醤 entre siete y diez d韆s a una temperatura de 15 篊. Si el color del medio de cultivo celular pasa de rojo a amarillo, lo que indica la acidificaci髇 del medio, se llevar� a cabo el ajuste del pH con una soluci髇 est閞il de bicarbonato, o con una sustancia equivalente, para garantizar la sensibilidad celular a la infecci髇 v韗ica.

Al menos una vez cada seis meses, o si se sospecha que la sensibilidad celular ha descendido, se efectuar� la titulaci髇 de material congelado de virus de septicemia hemorr醙ica viral y necrosis hematopoy閠ica infecciosa para comprobar la sensibilidad de los cultivos celulares a la infecci髇. En la parte IV se describe el procedimiento recomendado.

4. Microscopia.-

Se observar醤 peri骴icamente (al menos tres veces por semana) a 40-150 aumentos los cultivos celulares inoculados para comprobar si se han producido ECP. Si hay signos evidentes de ECP, se iniciar醤 inmediatamente los procedimientos de identificaci髇 del virus de conformidad con la parte I.IV.

5. Subcultivos.-

Si despu閟 de la incubaci髇 primaria de siete a diez d韆s no se han desarrollado ECP, se realizar醤 subcultivos en nuevos cultivos celulares, utilizando 醨eas celulares similares a las del cultivo primario.

Se reunir醤 al韈uotas del medio (sobrenadante) de todos los cultivos/pocillos pertenecientes al cultivo primario, por l韓eas celulares, siete o diez d韆s despu閟 de la inoculaci髇. El resultado se inocular� en cultivos celulares hom髄ogos sin diluir y en una diluci髇 de 1:10 (que dar醤 lugar a diluciones finales de 1:10 y 1:100, respectivamente, del sobrenadante) como se describe en la parte I.III.2. De manera alternativa, se pueden inocular directamente en un pocillo que contenga cultivo celular fresco al韈uotas de un 10 por 100 del medio que constitu韆 el cultivo primario (subcultivo de pocillo a pocillo). La inoculaci髇 podr� ir precedida de la preincubaci髇 de las diluciones con el antisuero del virus de la necrosis pancre醫ica infecciosa a una diluci髇 adecuada, tal y como se describe en la parte I.II.3.

Los cultivos inoculados se inocular醤 entonces durante siete a diez d韆s a una temperatura de 15� C y se mantendr醤 bajo observaci髇, seg鷑 se indica en la parte I.III.4.

Si se producen ECP t髕icos en los tres primeros d韆s de incubaci髇, se podr� realizar un subcultivo en esa etapa, pero entonces las c閘ulas deber醤 incubarse durante siete d韆s y volver a subcultivarse durante otros siete d韆s. Si se desarrollan ECP t髕icos despu閟 de tres d韆s, las c閘ulas podr醤 subcultivarse una vez e incubarse hasta que transcurra el total de catorce d韆s desde la inoculaci髇 primaria. En los 鷏timos siete d韆s de incubaci髇 no deber� registrarse ninguna se馻l de toxicidad.

Si, pese al tratamiento con antibi髏icos, se produce una contaminaci髇 bacteriana, antes de proceder al subcultivo se deber� centrifugar el sobrenadante a 2000-4000 x g durante un per韔do de quince a treinta minutos y a una temperatura de 2 a 5 oC, o filtrarlo a trav閟 de un filtro de 0,45 xm (por una membrana con baja afinidad por las prote韓as), o someterlo a ambos procedimientos. Por lo dem醩, los procedimientos de subcultivo son los mismos que los aplicados a los ECP t髕icos.

IV. Identificaci髇 del virus

1. Pruebas de identificaci髇 del virus.-

Si se observa la existencia de ECP en un cultivo celular, se recoger� medio (sobrenadante) y se examinar� someti閚dolo a una o varias de las pruebas siguientes: Neutralizaci髇, IF o ELISA. Si estas pruebas no permiten identificar el virus con seguridad en una semana, el sobrenadante deber� enviarse para su identificaci髇 inmediata al laboratorio nacional de referencia o al laboratorio comunitario de referencia para las enfermedades de los peces.

2. Neutralizaci髇.-

Se eliminar醤 las c閘ulas del sobrenadante recogido mediante centrifugaci髇 (2000-4000 x g) o filtraci髇 por membrana (0,45 xm) por una membrana con baja afinidad por las prote韓as y 閟te se diluir� a 1:100 y 1:10000 en un medio de cultivo celular.

Se mezclar醤 al韈uotas de las dos diluciones de sobrenadante con partes iguales de los siguientes reactivos por separado, y se incubar醤 durante sesenta minutos a una temperatura de 15 篊:

• - Suero que contenga un anticuerpo con especificidad de grupo frente al virus de la septicemia hemorr醙ica viral a una diluci髇 de 1:50 (vol:vol) (2) .
• - Suero que contenga un anticuerpo con especificidad de grupo frente al virus de la necrosis hematopoy閠ica infecciosa a una diluci髇 de 1:50 (vol:vol) (2) .
• - Conjunto de antisueros frente a los serotipos aut骳tonos del virus de la necrosis pancre醫ica infecciosa a una diluci髇 de 1:50 (vol:vol) (2) .
• - Medio solo (control positivo).

De cada mezcla de sobrenadante y virus, se inocular醤 al menos dos cultivos celulares con 50 xl cada uno y se incubar醤 a 15 oC. Se controlar� si aparecen ECP de la forma descrita en la parte I.III.4.

Algunas cepas del virus de la septicemia hemorr醙ica viral no reaccionan en las pruebas de neutralizaci髇. Tales cepas deben identificarse mediante la prueba de IF o la de ELISA.

Podr醤 usarse alternativamente otras pruebas de neutralizaci髇 de eficacia probada.

3. IF.-

Para cada cepa v韗ica que se desee identificar, se sembrar醤 con c閘ulas al menos ocho cubres o sus equivalentes, a una densidad que permita alcanzar una confluencia del 60 al 90 por 100 aproximadamente despu閟 de veinticuatro horas de cultivo. Se recomienda utilizar c閘ulas EPC por su fuerte adherencia a las superficies de cristal, pero tambi閚 se pueden utilizar otras l韓eas celulares, como BF-2, RTG-2 o FHM.

Cuando las c閘ulas hayan sedimentado en la superficie del cristal (aproximadamente una hora despu閟 de la siembra) o cuando los cultivos se hayan incubado durante un per韔do de hasta veinticuatro horas, se inocular� el virus que se desee identificar. Se inocular醤 cuatro cultivos en la proporci髇 de 1:10 en volumen y otros cuatro en la proporci髇 de 1:1000, que, posteriormente, se incubar醤 a 15� C durante un per韔do de veinte a treinta horas.

Tras la incubaci髇, los cultivos se aclarar醤 dos veces en MEM de Eagle sin suero, se fijar醤 con acetona helada al 80 por 100 y se te駃r醤 con ayuda de una IFAT de doble capa. La primera capa de reactivo consistir� en anticuerpos policlonales o monoclonales de calidad de referencia. La segunda capa de reactivo estar� formada por un antisuero conjugado con fluorocromo con afinidad por la inmunoglobina utilizada en la primera capa. Por cada uno de los antisueros sometidos a la prueba, deber� te駃rse al menos un cultivo inoculado con una dosis alta y otro inoculado con una dosis baja. La prueba incluir� controles negativos y positivos adecuados. Se recomiendan para esta prueba fluorocromos como el FITC o el TRITC.

Los cultivos te駃dos se preparar醤 utilizando soluci髇 salina de glicerol y se examinar醤 con luz ultravioleta incidente, utilizando oculares de 10 � 12 aumentos y objetivos de 25 � 40 aumentos con aperturas num閞icas > 0,7 y > 1,3, respectivamente.

La t閏nica de IF descrita se ofrece como ejemplo. Podr醤 usarse alternativamente otras t閏nicas de IF (diferentes en relaci髇 con los cultivos celulares, la fijaci髇 y los anticuerpos de calidad de referencia) de probada eficacia.

4. ELISA.-

Los pocillos de las placas de microtitulaci髇 se recubrir醤 durante una noche con las diluciones recomendadas de fracciones inmunoglobul韓icas purificadas de anticuerpos de calidad de referencia.

Tras aclarar los pocillos con soluci髇 amortiguadora PBS-Tween-20, se incorporar� a los pocillos el virus que se desee identificar en fases de diluci髇 doble o cu醖ruple y se dejar� reaccionar con el anticuerpo de recubrimiento durante sesenta minutos a 37 oC. Tras el aclarado con la soluci髇 amortiguadora PBS-Tween-20, se a馻dir醤 anticuerpos con biotina de la especificidad correspondiente a la de los anticuerpos de recubrimiento y se dejar� reaccionar durante sesenta minutos a 20� C.

Despu閟 de efectuar otro aclarado como el anterior, se a馻dir� estreptavidina conjugada con peroxidasa de r醔ano (HRP) y se dejar� reaccionar durante una hora a 20� C. Tras efectuar un 鷏timo aclarado, se visualizar� la enzima ligada utilizando sustratos ELISA adecuados (OPD u otros).

Esta versi髇 de ELISA basada en el empleo de biotina y avidina se ofrece a modo de ejemplo. En su lugar podr醤 utilizarse otras versiones de ELISA de eficacia probada.

CUADRO 1A

Plan de inspecci髇 y muestreo para las zonas y explotaciones situadas en zonas no autorizadas para el per韔do de control de dos a駉s que precede a la autorizaci髇 con respecto a la septicemia hemorr醙ica viral y la necrosis hematopoy閠ica infecciosa

(De conformidad con los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE y las disposiciones establecidas en la parte I del presente anexo)

�	�	�	Ex醡enes de laboratorio para detectar la presencia de virus (3)	�
�	N鷐ero de inspecciones cl韓icas anuales (dos a駉s)	N鷐ero de ex醡enes de laboratorio anuales (dos a駉s)	N鷐ero de peces en crecimiento (material de los 髍ganos)	N鷐ero de reproductores (fluido ov醨ico)
�	�	�	Zonas y explotaciones continentales	�
a) Explotaciones con reproductores	2	2	120 (primera inspecci髇) (4) 150 (segunda inspecci髇)	30 (primera inspecci髇) (5) 0 (segunda inspecci髇)
b) Explotaciones 鷑icamente con reproductores	2	1	0	150 (primera o segunda inspecci髇). (5)
c) Explotaciones sin reproductores	2	2	150 (primera y segunda inspecciones)	0
�	�	�	Zonas y explotaciones costeras	�
a) Explotaciones con reproductores	2	2	120 (primera inspecci髇) 150 (segunda inspecci髇)	30 (primera inspecci髇). (5) 0 (segunda inspecci髇).
b) Explotaciones de salm髇idos sin reproductores	2	2	30 (primera y segunda inspecciones). (6)	0
c) Explotaciones sin salm髇idos y sin reproductores	2	2	150 (primera y segunda inspecciones)	0

N鷐ero m醲imo de peces por muestra conjunta: 10.

CUADRO 1B

Plan de inspecci髇 y muestreo para el per韔do de control de dos a駉s que precede a la autorizaci髇 con respecto a la septicemia hemorr醙ica viral y la necrosis hematopoy閠ica infecciosa en zonas y explotaciones situadas en zonas no autorizadas con un historial documentado de ausencia de estas enfermedades oficialmente reconocido

(De conformidad con los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE y las disposiciones establecidas en las partes I y III del presente anexo)

�	�	�	Ex醡enes de laboratorio para detectar la presencia de virus	�
�	N鷐ero de inspecciones cl韓icas anuales (dos a駉s)	N鷐ero de ex醡enes de laboratorio anuales (dos a駉s)	N鷐ero de peces en crecimiento (material de los 髍ganos)	N鷐ero de reproductores (fluido ov醨ico)
�	�	�	Zonas y explotaciones continentales	�
a) Explotaciones con reproductores	2	2	0 (primera inspecci髇) (7) 30 (segunda inspecci髇)	30 (primera inspecci髇) (8) 0 (segunda inspecci髇)
b) Explotaciones 鷑icamente con reproductores	2	1	0	30 (primera o segunda inspecci髇). (8)
c) Explotaciones sin reproductores	2	2	150 (primera y segunda inspecciones)	0
�	�	�	Zonas y explotaciones costeras	�
a) Explotaciones con reproductores	2	2	0 (primera inspecci髇) 30 (segunda inspecci髇)	30 (primera inspecci髇). (8) 0 (segunda inspecci髇).
b) Explotaciones de salm髇idos sin reproductores	2	2	30 (primera y segunda inspecciones). (9)	0
c) Explotaciones sin salm髇idos y sin reproductores	2	2	30 (primera y segunda inspecciones)	0

N鷐ero m醲imo de peces por muestra conjunta: 10.

CUADRO 1C

Plan de inspecci髇 y muestreo para las zonas y explotaciones situadas en zonas no autorizadas con vistas a mantener la autorizaci髇 con respecto a la septicemia hemorr醙ica viral y la necrosis hematopoy閠ica infecciosa

(De conformidad con los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE y las disposiciones establecidas en la parte I del presente anexo)

�	�	N鷐ero de peces de una muestra conjunta sometida a examen de laboratorio (10)	�
�	N鷐ero de inspecciones cl韓icas anuales	N鷐ero de peces en crecimiento (material de los 髍ganos)	N鷐ero de reproductores (fluido ov醨ico)
�	Zonas y explotaciones continentales	�	�
a) Explotaciones con reproductores	2	20 (primera o segunda inspecci髇)	10 (primera o segunda inspecci髇)
b) Explotaciones 鷑icamente con reproductores	2	0	30 (primera o segunda inspecci髇). (11)
c) Explotaciones sin reproductores	1	30	0
�	Zonas y explotaciones costeras	�	�
a) Explotaciones con reproductores	2	20 (primera o segunda inspecci髇)	10 (primera o segunda inspecci髇). (11)
b) Explotaciones sin reproductores	1	30 (12)	0
�	�	�	�

N鷐ero m醲imo de peces por muestra conjunta: 10.

PARTE II Procedimientos de diagn髎tico para la confirmaci髇 de la necrosis hematopoy閠ica infecciosa y de la septicemia hemorr醙ica viral en presuntos brotes

Se emplear醤 una o m醩 de las siguientes t閏nicas para el diagn髎tico de estas enfermedades:

• A) Aislamiento convencional de los virus y posterior identificaci髇 serol骻ica de los mismos.
• B) Aislamiento e identificaci髇 serol骻ica simult醤ea de los virus.
• C) Otras t閏nicas de diagn髎tico (IFAT, ELISA).

En las explotaciones de las zonas autorizadas, el primer caso de estas enfermedades no deber� confirmarse bas醤dose 鷑icamente en el m閠odo C. Deber� utilizarse tambi閚 el m閠odo A o el B.

Es posible que en algunos casos el material tisular destinado al examen virol骻ico tenga que ir acompa馻do de material suplementario para ex醡enes bacteriol骻icos, parasitol骻icos, histol骻icos o de otro tipo que permitan un diagn髎tico diferencial.

A. Aislamiento convencional de los virus y posterior identificaci髇 serol骻ica de los mismos

I.1 Selecci髇 de muestras.-

Para el examen se seleccionar醤 como m韓imo 10 peces que muestren los signos t韕icos de la necrosis hematopoy閠ica infecciosa o de la septicemia hemorr醙ica viral.

I.2 Preparaci髇 y env韔 de muestra de peces.-

Proc閐ase del modo indicado en la parte I.I.3.

I.3 Recogida de material suplementario para diagn髎tico.-

Proc閐ase del modo indicado en la parte I.I.4.

II. Preparaci髇 de las muestras para el examen virol骻ico.-

Proc閐ase del modo indicado en la parte I.II.

III. Examen virol骻ico.-

Proc閐ase del modo indicado en la parte I.III.

IV. Identificaci髇 del virus.-

Proc閐ase del modo indicado en la parte I.IV.

B. Aislamiento e identificaci髇 serol骻ica simult醤ea de los virus

I.1 Selecci髇 de muestras.-

Proc閐ase del modo indicado en la parte II.A.I.1.

I.2 Preparaci髇 y env韔 de muestras de peces. -

Proc閐ase del modo indicado en la parte I.I.3.

I.3 Recogida de material suplementario para diagn髎tico.-

Proc閐ase del modo indicado en la parte I.I.4.

II.1 Homogeneizaci髇 de los 髍ganos.-

Proc閐ase del modo indicado en la parte I.II.2.

II.2 Centrifugado del homogeneizado.-

El homogeneizado se centrifugar� a una aceleraci髇 de entre 2000 y 4000xg durante quince minutos, en una centrifugadora refrigerada a una temperatura comprendida entre 2 y 5� C, y el sobrenadante se recoger� y se tratar� durante cuatro horas a 15� C con antibi髏icos, por ejemplo, 1 mg/ml de gentamicina, o se filtrar� (0,45 xg) por una membrana con baja afinidad por las prote韓as.

II.3 Tratamiento del sobrenadante con antisueros para diagn髎tico.-

La suspensi髇 de 髍ganos tratada con antibi髏icos o filtrada por membrana se diluir� a 1:10 y 1:1000 en medio de cultivo celular; se mezclar醤 al韈uotas suyas a partes iguales con los reactivos enumerados en la parte I.IV.2 y se incubar醤 durante 60 minutos a 15� C.

III.1 Medios y cultivos celulares.-

Proc閐ase del modo indicado en la parte I.III.1.

III.2 Inoculaci髇 de los cultivos celulares.-

De cada mezcla de suero y virus (preparada del modo indicado en la parte II.B.II.3), se inocular醤 al menos dos cultivos celulares por l韓ea celular con 50 xl cada uno.

III.3 Incubaci髇 de los cultivos celulares.-

Proc閐ase del modo indicado en la parte I.III.3.

III.4 Microscopia.-

Se observar醤 diariamente a 40-150 aumentos los cultivos celulares inoculados para comprobar si se han producido ECP. Si se evita la aparici髇 de ECP con alguno de los antisueros utilizados, el virus podr� considerarse identificado.

En caso contrario, se iniciar醤 los procedimientos de identificaci髇 del virus de conformidad con la parte I.IV.

III.5 Subcultivos.-

Si no se han obervado ECP despu閟 de siete a diez d韆s, se realizar醤 subcultivos a partir de los cultivos inoculados con sobrenadante y medio (parte II.B.II.3) con arreglo a la parte I.III.5.

C. Otras t閏nicas de diagn髎tico

Las t閏nicas IFAT o ELISA descritas en las partes I.IV.3 y I.IV.4, respectivamente, se podr醤 aplicar al sobrenadante, que se habr� preparado del modo indicado en la parte I.II.2. Estas t閏nicas r醦idas se completar醤 con un examen virol骻ico con arreglo a los puntos A o B antes de que hayan transcurrido cuarenta y ocho horas desde la toma de la muestra, si:

• a) Se obtiene un resultado negativo, o
• b) Se obtiene un resultado positivo con material que constituya el primer caso de necrosis hematopoy閠ica infecciosa o septicemia hemorr醙ica viral en una zona autorizada.

El material tisular podr� someterse a otras t閏nicas de diagn髎tico como la RCPTI, la IF realizada con cortes congelados o la inmunohistoqu韒ica realizada con material fijado con formol. Estas t閏nicas deber醤 completarse siempre con la inoculaci髇 en cultivos celulares de material tisular no fijado.

PARTE III Demostraci髇 documental de la ausencia de septicemia hemorr醙ica viral, de necrosis hematopoy閠ica infecciosa o de ambas en zonas o en explotaciones situadas en zonas no autorizadas

Directrices y criterios aplicables a un programa oficial de inspecci髇 sanitaria.

1. S髄o se podr� iniciar un programa de inspecci髇 sanitaria:

Tras haber aplicado un programa de erradicaci髇 del virus de la septicemia hemorr醙ica viral o del virus de necrosis hematopoy閠ica infecciosa reconocido oficialmente, en virtud del cual se hayan retirado todos los peces de las instalaciones y 閟tas se hayan limpiado, desinfectado y dejado en reposo antes de volver a abastecerlas con peces procedentes de explotaciones autorizadas, o

En explotaciones pisc韈olas en las que no haya precedentes de infecci髇 con los virus de estas enfermedades.

2. El programa de inspecci髇 sanitaria deber� constar tanto de inspecciones cl韓icas como de ex醡enes de laboratorio.

3. El programa deber� incluir dos inspecciones sanitarias cl韓icas anuales realizadas de conformidad con las directrices recogidas en la parte I.

4. En al menos una de las inspecciones llevadas a cabo cada a駉, se recoger醤 30 muestras de tejidos de peces o de fluido ov醨ico de cada explotaci髇 pisc韈ola. Las muestras se seleccionar醤, preparar醤 y someter醤 a examen de laboratorio de conformidad con las partes I, II y IV.

5. El programa de inspecci髇 sanitaria se llevar� a cabo durante al menos cuatro a駉s en todas las explotaciones de la zona o en la explotaci髇 (situada en una zona no autorizada) que vayan a autorizarse.

6. Para que se reconozca oficialmente el programa, no deber� darse ni detectarse ning鷑 caso de septicemia hemorr醙ica viral ni de necrosis hematopoy閠ica infecciosa (ni infecciones cl韓icas ni aislamientos de virus).

PARTE IV Procedimiento de titulaci髇 para comprobar la sensibilidad de los cultivos celulares a la infecci髇

A continuaci髇 se recogen los procedimientos de titulaci髇 recomendados mencionados en la parte I.III.3.

Se deber醤 emplear al menos dos cepas de virus de la septicemia hemorr醙ica viral y una cepa de virus de la necrosis hematopoy閠ica infecciosa. Las cepas deber醤 representar los principales grupos de virus presentes en la Uni髇 Europea; por ejemplo, en el caso del virus de la septicemia hemorr醙ica viral, se deber� elegir una cepa patog閚ica para la trucha arco iris de agua dulce y una cepa de agua salada patog閚ica para el rodaballo, y en el caso del virus de la necrosis hematopoy閠ica infecciosa se deber� elegir una cepa patog閚ica para la trucha arco iris de Europa. Deber醤 emplearse cepas bien definidas procedentes de los Estados miembros. El laboratorio comunitario de referencia para las enfermedades de los peces puede suministrar cepas de referencia.

En tubos de cultivo celular con c閘ulas BF-2 o RTG-2, en el caso del virus de la septicemia hemorr醙ica viral, y con c閘ulas EPC o FHM, en el del virus de la necrosis hematopoy閠ica infecciosa, se propagar醤 lotes de virus de un n鷐ero bajo de pases en cultivos celulares. Se deber� emplear un medio de cultivo celular con, al menos, un 10 por 100 de suero. En la inoculaci髇 deber� emplearse una MOI baja (< 1).

Con los ECP totales presentes, se recoger� el virus mediante centrifugado del sobrenadante del cultivo celular a 2000xg durante quince minutos, se esterilizar� pas醤dolo por un filtro de membrana de 0,45 靘 y se distribuir� en criotubos etiquetados. El virus se mantendr� a -80� C.

Una semana despu閟 de la congelaci髇, se descongelar醤 tres tubos de cada virus coloc醤dose en agua fr韆 y se titular醤 con sus l韓eas celulares respectivas. Cada cepa de virus se descongelar� y titular�, al menos, cada seis meses o si se sospecha que la sensibilidad de una l韓ea celular se ha visto reducida.

Se deber醤 describir detalladamente los procedimientos de titulaci髇 y se deber� seguir el mismo procedimiento cada vez.

La titulaci髇 por diluci髇 hasta el l韒ite se efectuar� utilizando, al menos, seis tubos en cada fase de diluci髇.

Los t韙ulos se comparar醤 con los obtenidos previamente. Si el t韙ulo de uno de las tres cepas de virus es inferior en un factor igual o superior a dos unidades logar韙micas, respecto al t韙ulo inicial, no deber� volver a utilizarse la l韓ea celular para fines de vigilancia.

Si en el laboratorio se guardan distintas l韓eas celulares, cada una deber� examinarse por separado.

Los registros se conservar醤, al menos, diez a駉s.

PARTE V Acr髇imos y abreviaturas

BF-2 Fibroblasto de alev韓 de Lepomis macrochirus (l韓ea celular).

ECP Efectos citopatog閚icos.

LCR Laboratorio comunitario de referencia para las enfermedades de los peces. ELISA Prueba de inmunoabsorci髇 enzim醫ica.

EPC Epithelioma papulosum cyprini (l韓ea celular).

FHM Pimephales promeles (l韓ea celular).

FITC Isotiocianato de fluoresce韓a.

Hepes 羉ido N-2-hidroxietilpiperazina-N'2-etano-sulf髇ico.

HRP Peroxidasa de r醔ano.

IF Inmunofluorescencia.

IFAT Prueba de fluorescencia indirecta para la detecci髇 de anticuerpos.

(V) NHI (Virus de la) necrosis hematopoy閠ica infecciosa.

(V) NPI (Virus de la) necrosis pancre醫ica infecciosa.

MEM Medio m韓imo fundamental.

MOI Multiplicidad de infecci髇 (proporci髇 del n鷐ero de part韈ulas v韗icas infecciosas a馻dido a un n鷐ero conocido de c閘ulas de un cultivo).

OPD Orto-fenilendiamina.

PBS Soluci髇 salina amortiguadora fosfatada.

RTG-2 G髇adas de trucha arco iris (l韓ea celular).

RCP-TI Reacci髇 de polimerizaci髇 en cadena con transcripci髇 inversa.

Tris-HC1 Tris (hidroximetil) aminometano-HC1.

TRITC Isotiocianato de tetrametil-rodamina.

(V) SHV (Virus de la) septicemia hemorr醙ica viral.